Đang tải... (xem toàn văn)
3. Một số câu hỏi phụ và lưu ý cần nhớ: Có 3 loại micopipet : 0.5 10(µl), 20 100 (µl), 100 – 1000 (µl) Có 2 loại eppendorf : V = 1.5 ml ( đầu nhọn), V = 2ml ( đầu bằng) Sử dụng micopipet: Hút 1 lần 1 V nhất định : nhấn 1 nấc, xả 2 nấc Hút nhiều lần cùng 1 V : nhấn 2 nấc, xả 1 nấc, đến lần cuối cùng sau khi nhả 1 nấc vào eppendorf, phần còn lại sẽ xả bỏ ra ngoài Tại sao quai hướng ra ngoài : vì khi ly tâm ở tốc độ cao, cặn sẽ lắng xuống ở đáy ống phía đối diện với trục ( phía dưới quai). Như vậy ta biết được vị trí của cắn nên khi thao tác sẽ tránh không làm ảnh hưởng đến cắn. Tại sao phải đặt cân bằng và đối xứng: do ly tâm tròn đều và hướng tâm, nếu để ko cân bằng hoặc ko đối xứng, lực tác dụng bị lệch có thể dẫn đến gãy ổ bi, gãy ổ trục của máy
Thiên Kiều Trang 1/6 ÔN TẬP SINH HOC PHÂN TỬ I CÁCH SỬ DỤNG PIPET, MÁY LY TÂM, PHA LOÃNG HĨA CHẤT Cơng thức pha lỗng hóa chất: Vdd mẹ cần lấy = (Nồng độ dd pha/Nồng độ dd mẹ) x V muốn pha Ví dụ: Pha 200 (µl) dd TAE 1X từ dd TAE 10X - Tính V dd TAE10X cần lấy = (1/10) x 200 = 20 (µl) + 180(µl) H2O - Dùng micropipet 10 - 200 µl (lưu ý tùy theo thể tích đề yêu cầu chọn loại micopipet thích hợp) - Chỉnh đến V 20 µl để hút dung dịch TAE 10X (nhấn nấc, xả nấc), cho vào eppendorf - Sau đó, thay đầu tip khác chỉnh V 180 µl để hút H2O cho vào eppendorf chứa dd TAE10X - Trộn ( cách đảo trộn tay, micopipet, máy trộn vontex) Sử dụng máy ly tâm - Chọn cặp eppendorf giống hình dáng thể tích - Kiểm tra dung dịch chứa bên có đồng lượng khơng ( V nhau) theo cặp chọn Cặp khơng đồng lượng loại - Đặt cặp đối xứng vào máy, quai hướng Một số câu hỏi phụ lưu ý cần nhớ: Có loại micopipet : 0.5 - 10(µl), 20 -100 (µl), 100 – 1000 (µl) Có loại eppendorf : V = 1.5 ml ( đầu nhọn), V = 2ml ( đầu bằng) Sử dụng micopipet: - Hút lần V định : nhấn nấc, xả nấc - Hút nhiều lần V : nhấn nấc, xả nấc, đến lần cuối sau nhả nấc vào eppendorf, phần lại xả bỏ ngồi Tại quai hướng ngồi : ly tâm tốc độ cao, cặn lắng xuống đáy ống phía đối diện với trục ( phía quai) Như ta biết vị trí cắn nên thao tác tránh không làm ảnh hưởng đến cắn Tại phải đặt cân đối xứng: ly tâm tròn hướng tâm, để ko cân ko đối xứng, lực tác dụng bị lệch dẫn đến gãy ổ bi, gãy ổ trục máy Thiên Kiều Trang 2/6 Thiên Kiều Trang 3/6 II CHIẾT TÁCH AND Plasmid Má người - Qui trình chiết tách Ngồi ba bước có thêm bước thu sinh khối - Qui trình chiết tách Ba bước: phá màng TB, biến tính protein, tủa ADN - Các dd sử dụng: Phá màng: SDS kiềm - Các dd sử dụng: Biến tính protein: SDS kiềm Phá màng: SDS Biến tính protein: chloroform phenol pH8, hai Tủa ADN: ethanol 960 Tủa ADN: ethanol 96 Rửa tủa : cồn 700 - Qui trình chiết tách Ngồi ba bước thêm bước dùng nitơ lỏng (-1960C) để làm giòn vách cellulose - Các dd sử dụng: Phá màng: SDS CTAB Biến tính protein: chloroform phenol pH8, isoamyl alcol (pp mitsui) Tủa ADN: isopropanol Rửa tủa : cồn 700 Rửa tủa : cồn 700 Thực vật Một số lưu ý cần nhớ: Tại chiết tách ADN plasmid sử dụng SDS kiềm mà SDS : mục đích muốn loại bỏ gen NST VK, môi trường kiềm (pH = 12) ADN NST biến tính ko hồi phục, ADN plasmid biến tính có hồi phục ta loại ADN NST Biến tính ADN NST nào: ADN NST bị tách đôi sợi Tại người ta hay sử dụng pp CTAB chiết tách ADN thực vật: TB thực vật có nhiều polysarcharid, CTAB có khả liên kết thuận nghịch với ADN ( CTAB – ADN) CTAB – polysarcharid, loại polysarcharid bước Vai trò hóa chất: Dung dịch phá màng chiết tách AND má người gồm: tris-HCl 50mM pH8, EDTA 450mM, SDS1%, NaCl 10mM - Tris : ổn định PH - EDTA: ức chế hoạt động enzyne thủy phân ADN - SDS 1% Tác nhân phá vỡ màng TB - NaCl 10mM gây xáo trộn áp suất thẩm thấu - Chloroform:biến tính protein - Ethanol 96% (100%) lạnh làm tủa ADN Thiên Kiều Trang 4/6 - Ethanol 70% rửa muối , làm ADN để thu ADN tinh khiết - Bảo quản ADN nước hay TE ( Tris 0.1M – EDTA 0.001M) để lâu hơn, To 200c bảo quản tháng , 40C bảo quản vài tuần DD hòa mẩu GTE (glucose- Tris- EDTA)để phân tán vi khuẩn Phải giử lạnh để ức chế hoạt động men nội bào RNAse 10mg/ml -> phân hủy ARN III PP ĐO QUANG Nguyên tắc pp đo quang: Dùng tia sáng tử ngoại chiếu qua mẫu thử, phân tử hấp thụ ánh sáng hấp thụ ánh sáng bước sóng thích hợp cho mật độ quang Dựa vào mật độ quang ta đánh giá độ tinh mẫu - OD ADN = 260nm, OD protein = 280nm, OD thực vật = 230nm Mục đích pp đo quang : - Xác định hàm lượng kiểm tra độ tinh kiết phân tử ADN dd - PP đo quang phổ dựa vào hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại dd ADN sóng 260nm - Độ hấp thụ tỷ lệ với nồng độ ADN biểu thị thông qua mật độ quang OD ( oftic density) + OD260nm= 50μg/ml cho dd ADN mạch kép + OD260nm= 40μg/ml cho dd ADN mạch đơn Chú ý : Cần phải làm ARN ARN có độ hấp thụ as tử ngoại sóng OD260nm nên làm sai lệch mật độ quang 3.Công thức : Nồng độ ADN (μg/ml)= 50 ×OD260nm ×n OD260nm độ hấp thụ dd ADN bước sóng 260nm 50: hệ số chuyển đổi dd nồng độ ADN sợi đơi (sợi đơn ×40) n: hệ số pha loãng Đánh giá độ tinh : - Đo dd sóng 260nm mức hấp thụ cực đại ADN - Đo dd sóng 280nm mức hấp thụ cực đại protein - Lập tỷ số: OD260/OD280 : Thiên Kiều Trang 5/6 + Nếu kết = 1,8 – 2,0 : dịch chiết ADN tinh + Nếu kết > : ADN bị biến tính phân hủy , lẫn ARN + Kết < 1,8 : dd ADN lẫn tạp chất Lưu ý : ADN thực vật đo thêm OD230nm Tính độ tinh AND thực vật: OD260nm/ OD230nm để loại polysacaric Các bước cần tiến hành đến trạm đo quang Yêu cầu: Đặt mẫu thử vào máy đo quang - Chọn mẫu thử ( V mẫu thử phải đủ 2ml) - Cầm rửa cốc đo, lau cốc ( lau bên ngoài) - Đổ mẫu thử vào cốc đo - Đặt cốc đo vào máy ( lưu ý để mặt cốc theo chiều ánh sáng qua) - Chỉnh bước sóng phù hợp với yêu cầu đề IV ĐIỆN DI Nguyên tắc: Là dịch chuyển phân tử tích điện hướng điện cực trái dấu với dd tác dụng điện trường Lưu ý: ADN mang điện tích âm di chuyển từ cực âm sang cực dương Ứng dụng pp điện di: Định tính thu nhận mẫu ADN hiển thị trực tiếp: - Sản phẩm ADN nguyên vẹn - Sản phẩm ADN bị cắt giới hạn - Sản phẩm ADN khuyếch đại kỹ thuật PCR Thành phần điện di: - Bồn, dd đệm, có dòng điện qua - điện cực ( -), (+) - Giếng chứa ADN làm từ thạch ( để ADN di chuyển) Chú ý đặt thạch: - Giếng quay cực âm - Đè miếng thạch ngập nước Tốc độ di chuyển ADN phụ thuộc vào: - Kích thước, cấu trúc ko gian phân tử ADN Thiên Kiều Trang 6/6 - Nồng độ chất cấu thành gel (nồng độ thạch cao: di chuyển phân tử nhỏ, nồng độ thạch thấp: di chuyển phân tử lớn) Tại dùng thạch làm để ADN di chuyển : cấu trúc thạch polyme, tạo khe (mắc lưới) cho phân tử qua ... Trang 3/6 II CHIẾT TÁCH AND Plasmid Má người - Qui trình chiết tách Ngồi ba bước có thêm bước thu sinh khối - Qui trình chiết tách Ba bước: phá màng TB, biến tính protein, tủa ADN - Các dd sử dụng:... ADN nước hay TE ( Tris 0.1M – EDTA 0.001M) để lâu hơn, To 200c bảo quản tháng , 40C bảo quản vài tu n DD hòa mẩu GTE (glucose- Tris- EDTA)để phân tán vi khuẩn Phải ln giử lạnh để ức chế hoạt động