Biểu hiện và nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu của enzyme lasparaginase tái tổ hợp từ erwinia chrysanthemi

175 3 0
  • Loading ...
1/175 trang
Tải xuống

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 05/11/2019, 17:25

r VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ HIỀN TRANG BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ MÁU CỦA ENZYME L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP TỪ Erwinia chrysanthemi Luận án tiến sĩ sinh học Hà nội - 2019 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ HIỀN TRANG BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ MÁU CỦA ENZYME L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP TỪ Erwinia chrysanthemi Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS ĐỖ THỊ TUYÊN Viện Công nghệ sinh học PGS.TS QUYỀN ĐÌNH THI Viện Cơng nghệ sinh học Hµ néi - 2019 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tun, Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học tận tình hướng dẫn, giúp đỡ thường xuyên giai đoạn trình nghiên cứu, sửa chữa luận án, báo tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, kinh phí, thời gian để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, kính trọng tới cố PGS TS Quyền Đình Thi ngun Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học Enzyme, ngun Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn định hướng nghiên cứu bước đầu cho luận án Luận án thực kinh phí đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu qui trình sản xuất L-asparaginase tái tổ hợp, thử nghiệm diệt dòng tế bào ung thư định hướng dùng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư máu” cố PGS TS Quyền Đình Thi làm chủ nhiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn tới nhóm nghiên cứu PGS TS Đỗ Thị Thảo, nhóm nghiên cứu TS Lã Thị Huyền_Viện Cơng nghệ sinh học, nhóm nghiên cứu PGS TS Hồng Thị Mỹ Nhung – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên nhóm nghiên cứu TS Đỗ Minh Trung- Học Viện Quân y phối hợp nghiên cứu tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Phòng Quản lý tổng hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, cán sở đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam tạo điều kiện thời gian, trang thiết bị giúp đỡ thủ tục hành để luận án hồn thành Để hồn thành luận án tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu nhiệt tình tập thể cán Phòng Cơng nghệ sinh học Enzyme,Viện Công nghệ sinh học, động viên suốt q trình nghiên cứu Đồng thời tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân động viên tinh thần giúp đỡ vật chất suốt trình thực luận án Hà nội, ngày tháng năm 2019 Nguyễn Thị Hiền Trang i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS Nguyễn Thị Hiền Trang ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Giải nghĩa ALL Acute lymphoid leukemia Ung thư bạch cầu cấp dòng lympho AML Acute myeloid leukemia Ung thư bạch cầu cấp dòng tủy aspg Gene mã hóa L-asparaginase maspg Gene mã hóa L-asparaginase hồn chỉnh cắt signal peptide rASPG L-asparaginase tái tổ hợp CML Chronic myeloid leukemia Ung thư bạch cầu mãn dòng tủy CCR Children’s Cancer Group Nhóm ung thư trẻ em CR Complete remission Thuyên giảm hoàn toàn DEAE Diethylaminoethyl DNA Deoxiribonucleic acid DMSO Dimethyl sulfoxide DFCI Dana-Fraber Cancer institute Viện ung thư Dana-Fraber DFS Disease-free survival Sống sót mà khơng mang bệnh DTT Dithiothreito EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EFS Event-free survival Sống sót mà khơng bị biến chứng Human leucocyte antigen Kháng nguyên kháng bạch cầu HLA người LB Lysogeny broth Môi trường biểu IPTG Isopropyl thio-β-D-galactoside Chất cảm ứng OD Optical density Mật độ quang PEG Polyethylen glycol POG Pediatric Oncology Group Nhóm ung thư thiếu niên SRB Sulforhodamine B Chất nhuộm tế bào TCA Trichloroacetic acid iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT - iii MỤC LỤC - iv DANH MỤC HÌNH - vii DANH MỤC BẢNG x MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU - 1.1 Tổng quan L-asparaginase…………………………………………………… 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cấu trúc L-asparaginase 1.1.4 Cơ chế phản ứng L-asparaginase - 1.1.5 Các nguồn L-asparaginase 1.1.6 Ứng dụng - 1.2 L-asparaginase điều trị ung thƣ máu…………………………………….11 1.2.1 Tổng quan bệnh ung thư máu 11 1.2.2 Cơ chế hoạt động L-asparaginase điều trị ung thư - 14 1.2.3 Ứng dụng L-asparaginase điều trị bệnh nhân bị ung thư bạch cầu 17 1.2.4 Các dạng asparaginase sử dụng điều trị - 19 1.2.5 Các vấn đề liên quan đến ứng dụng lâm sàng asparaginase từ vi khuẩn - 20 1.2.6 Mẫn cảm với asparaginase từ Escherichia coli trì hiệu điều trị sau thay Erwinia-asparaginase 22 1.3 Tình hình nghiên cứu L-asparaginase………………………………………….23 1.3.1 Trên giới 23 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 35 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 37 2.1 Vật liệu…………………………………………………………………………….37 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu - 37 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 37 2.1.3 Các plasmid mồi - 37 iv 2.1.4 Các chủng vi khuẩn tế bào 38 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 39 2.1.6 Hóa chất - 39 2.1.7 Thiết bị thí nghiệm 41 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu… 41 2.2.1 Thiết kế plasmid biểu - 41 2.2.2 Nuôi biểu 44 2.2.3 Xác định hoạt tính L-asparaginase 45 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đơn lẻ tới sinh tổng hợp enzyme 46 2.2.5 Tối ưu phương pháp đáp ứng bề mặt - 48 2.2.6 Tinh protein tái tổ hợp 49 2.2.7 Nhận dạng protein tái tổ hợp phương pháp MALDI -TOF - 51 2.2.8 Đánh giá tính chất lý hóa enzyme 52 2.2.9 Xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng với dòng tế bào ung thư - 53 2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu 56 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU - 58 3.1 Nghiên cứu biểu L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi 58 3.1.1 Tối ưu trình tự gene - 58 3.1.2 Thiết kế plasmid pE22aspg biểu E coli - 61 3.1.3 Thiết kế plasmid pE21maspg biểu E coli - 64 3.1.4 Thiết kế plasmid pE21maspg-nonhis biểu E coli 67 3.2 Tối ƣu điều kiện biểu cho sinh tổng hợp L-asparaginase tái tổ hợp…… 70 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG - 71 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tiếp giống 71 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ampicillin trước cảm ứng - 72 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường biểu 73 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon bổ sung - 74 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng ion khoáng bổ sung 74 3.2.7 Tối ưu hóa điều kiện biểu rASPG tái tổ hợp phương pháp đáp ứng bề mặt -.75 3.3 Đánh giá tính chất lý hóa rASPG khơng có 6xHis ……………………… 79 v 3.3.1 Tinh rASPG từ E coli/pE21maspg-nonhis 79 3.3.2 Nhận diện enzyme tái tổ hợp phân tích khối phổ MALDI-TOF - 81 3.3.3 Động học enzyme - 84 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ pH phản ứng tới hoạt độ rASPG - 84 3.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ pH tới độ bền rASPG - 86 3.3.6 Ảnh hưởng EDTA số ion kim loại lên hoạt tính rASPG 87 3.3.7 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính rASPG 87 3.3.8 Ảnh hưởng Dithiothreitol tới hoạt tính rASPG - 88 3.4 Nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ rASPG…………………… 88 3.4.1 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư bạch cầu lympho chuột P388 - 89 3.4.2 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8 - 90 3.4.3 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột SP2/0-Ag14 - 91 3.4.4 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư tủy mãn người K562 - 92 3.4.5 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp người HL60 - 93 3.4.6 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư máu lympho người Jurkat 95 3.4.7 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư quản người Hep2 - 97 3.4.8 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào thường 98 CHƢƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU - 99 A DK A LP DK N LP IV N IL IV AT IL G AT GT G IA GT G IA SA G AT SA AT GT Q GT TT Q GY TT AV PE V KK LA NV K GE QF S NM AS AR DD V DG VV IT H GT DT LH TT R SV FD VR G LT SL V M EE RP M M TG YF AT SA A RY KV P DE EL PG L VS DS P DE EL PG L VS DS VK L LY GI NP L Q YA AR AH FH AL AL AR T Y AS KS M D A E I 0 r w A AM AL RG RG RG RG V V II GN R II GN R EK GV V MV MV VL VI IY YQ IY YQ VI VM RS N N N DR r I 0 0 E D RT 0 0 0 0 n a s G e n a n G w o s n a i n e o s n n h n e o a e o a s i h s i h s i s e o n h i s i s e o n s n n h e o h i n s h i s i s e n n G n s n s n n G a i P s n n G a i P n G w S a G i P n G w S i P r A P w S i P r A w S E r S r A w S 0 E r G r A n G i P A 0 r D T r r I RI RI 0 i P w S E I DR N r A E I KV P w S r A QS QS GV GV K MR KV i S r A K K L L E r H AG 0 E r A GY GY IQ P P GD GD 2 A GI SD SD r I E r L EE EE R RT RT VA VA AN AN DA T T VA VR K R LY SV AL AL NE F VR A TF TF Y SV ML ML TL TL 0 VV LE LD LD PE G V KP LE NL T T DD GA LL LL D QR D NL M AS YQ GM I I GV GV LS 1 GP TN TN G V AH NP EY K TV GP AD TK TK DI VP VP G VL HL AD IS I I P G GI GI DV L IS A RY SA SA AT RP G G N N G KA EN L K KA GY N o a n s n h e o i n s h 4.1 Nghiên cứu lựa chọn hệ vector biểu L-asparaginase…………………… 99 4.2 Nghiên cứu tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp rASPG ………………………103 4.3 Đánh giá tính chất enzyme ……………………………………………… 108 4.4 Hoạt tính ức chế sinh trƣởng rASPG số dòng tế bào ung thƣ 114 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 118 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ……………………………………………………………………………………120 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH - 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHẦN PHỤ LỤC - vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phản ứng xúc tác enzyme L-asparaginase Hình 1.2 Phân loại L-asparaginase Hình 1.3 Cấu trúc tetramer (A) mononer (B) L-asparaginase Hình 1.4 Cơ chế phản ứng chung xúc tác L-asparaginase… Hình 1.5 Tế bào máu bình thường tế bào máu ung thư 12 Hình 1.6 Cơ chế kháng tế bào ung thư L-asparaginase 15 Hình 1.7 Một số biệt dược L-asparaginase sử dụng 20 Hình 2.1 Đường chuẩn NH3 45 Hình 2.2 51 Đường chuẩn BSA Hình 2.3 Đồ thị phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo Lineweaver-Burk 52 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 58 Hình 3.1 Biểu đồ số thông số gene sau tối ưu 59 Hình 3.2 So sánh trình tự trước (X12746) sau tối ưu codon (aspg) thuật toán OptimumGeneTM 60 Hình 3.3 Trình tự amino acid suy diễn L-asparaginase 61 Hình 3.4 Thiết kế plasmid pE22aspg 62 Hình 3.5 Cấu trúc biểu pE22aspg 63 Hình 3.6 Biểu pE22aspg E coli BL21(DE3) 63 Hình 3.7 Thiết kế plasmid pE21maspg 64 Hình 3.8 Cấu trúc biểu pE21maspg 65 Hình 3.9 SDS-PAGE protein tổng số E coli tái tổ hợp mang plasmid pE21maspg 66 Hình 3.10 Tinh rASPG từ E coli/pE21maspg cột ProBond Nikel 66 Hình 3.11 Thiết kế plasmid pE21maspg-nonhis 68 Hình 3.12 Cấu trúc biểu pE21maspg-nonhis 68 vii Hình 3.13 Biểu pE21maspg-nonhis E coli BL21(DE3) 69 Hình 3.14 Điện di SDS_PAGE đánh giá mức độ biểu dạng tan rASPG…… 70 Hình 3.15 Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến tổng hợp rASPG 71 Hình 3.16 Ảnh hưởng nồng độ tiếp giống đến tổng hợp rASPG 72 Hình 3.17 73 Ảnh hưởng nồng độ ampicillin đến tổng hợp rASPG Hình 3.18 Ảnh hưởng pH ban đầu tới tổng hợp enzyme 73 Hình 3.19 Ảnh hưởng số nguồn Carbon đến tổng hợp rASPG 74 Hình 3.20 Ảnh hưởng số ion tới tổng hợp rASPG 74 Hình 3.21 Biểu đồ đường đông mức thể tương tác tham số Hình 3.22 SDS-PAGE mẫu biểu điểm tối ưu 78 Hình 3.23 SDS_PAGE mẫu rASPG qua cột Sephacryl S-20 Hình 3.24 SDS-PAGE rASPG qua cột DEAE-Sepharose 81 Hình 3.25 Phổ khối ion phân đoạn peptide 82 Hình 3.26 So sánh độ tương đồng trình tự ba đoạn peptide thu 77 79 (peptide) với L-asparaginase từ GenBank (WP-039108651) 83 Hình 3.27 Đồ thị biến thiên vận tốc phản ứng rASPG theo nồng độ chất L-asparagine 84 Hình 3.28 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính enzyme 85 Hình 3.29 85 Ảnh hưởng pH tới hoạt tính enzyme Hình 3.30 Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền enzyme 86 Hình 3.31 Ảnh hưởng pH tới độ bền enzyme 86 Hình 3.32 Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ enzyme 87 Hình 3.33 Mối tương quan nồng độ rASPG thử nghiệm % tế bào ung thư bạch cầu lympho chuột P388 sống sót sau 72 90 Hình 3.34 Mối tương quan nồng độ rASPG thử nghiệm % tế bào ung thư tủy P3X63Ag8 sống sót sau 72 90 Hình 3.35 Mối tương quan nồng độ rASPG thử nghiệm % tế bào ung thư tủy SP2/0-Ag14 sống sót sau 72 91 viii Phụ lục Mức độ biểu rASPG hệ biểu E coli/ pE21maspg Làn 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 Băng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Rf 0,081 0,132 0,183 0,217 0,242 0,265 0,282 0,317 0,354 0,371 0,386 0,404 0,436 0,462 0,568 0,614 0,64 0,681 0,742 0,786 0,816 0,073 0,177 0,21 0,24 0,263 0,304 0,345 0,397 0,429 0,455 0,494 0,563 0,612 0,645 0,669 0,694 0,729 0,781 0,076 0,108 OD 0,082 0,092 0,175 0,165 0,116 0,191 0,199 0,107 0,168 0,16 0,17 0,178 0,291 0,253 0,623 0,241 0,143 0,09 0,114 0,06 0,052 0,047 0,076 0,072 0,058 0,107 0,05 0,068 0,078 0,078 0,136 0,134 0,516 0,153 0,088 0,076 0,056 0,076 0,041 0,101 0,074 AmplOD 0,035 0,042 0,121 0,109 0,058 0,131 0,139 0,045 0,104 0,094 0,104 0,11 0,221 0,181 0,555 0,179 0,083 0,034 0,063 0,015 0,009 0,006 0,033 0,029 0,015 0,063 0,006 0,021 0,029 0,029 0,086 0,082 0,456 0,087 0,024 0,02 0,006 0,031 0,043 0,014 IntOD 0,384 0,416 2,472 1,713 0,605 1,498 1,939 0,868 1,336 1,141 0,986 1,387 4,087 2,885 28,268 28,268 2,159 2,159 1,662 0,416 0,416 0,13 0,548 0,587 0,587 0,714 0,099 0,422 0,402 0,34 0,897 0,959 19,758 19,758 0,243 0,455 0,455 0,85 0,835 0,567 0,168 Ampl*Int 0,0134 0,017472 0,299112 0,186717 0,03509 0,196238 0,269521 0,03906 0,138944 0,107254 0,102544 0,15257 0,903227 0,522185 15,68874 5,059972 0,179197 0,073406 0,104706 0,00624 0,003744 0,00078 0,018084 0,017023 0,008805 0,044982 0,000594 0,008862 0,011658 0,00986 0,077142 0,078638 9,009648 1,718946 0,005832 0,0091 0,00273 0,02635 0,024381 0,002352 Mức độ biểu rASPG (%) 65,10018 81,5424 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 0,127 0,101 0,041 0,134 0,151 0,089 0,178 0,229 0,163 0,21 0,207 0,139 0,229 0,178 0,108 0,258 0,229 0,157 0,272 0,204 0,13 0,306 0,132 0,054 0,344 0,201 0,122 0,364 0,238 0,156 0,396 0,196 0,11 0,423 0,284 0,196 0,453 0,284 0,194 0,563 0,645 0,561 0,614 0,265 0,191 0,643 0,191 0,121 0,681 0,143 0,08 0,732 0,163 0,107 0,781 0,092 0,044 0,803 0,08 0,035 0,83 0,047 0,006 0,076 0,076 0,033 0,105 0,058 0,015 0,135 0,06 0,015 0,173 0,148 0,1 0,209 0,141 0,091 0,227 0,101 0,05 0,252 0,16 0,108 0,286 0,082 0,028 0,308 0,088 0,032 0,335 0,109 0,051 0,36 0,101 0,041 0,37 0,109 0,049 0,384 0,105 0,045 0,414 0,158 0,096 0,442 0,191 0,127 0,564 0,709 0,602 0,642 0,168 0,012 0,682 0,168 0,06 0,737 0,178 0,11 0,778 0,06 0,01 0,8 0,047 0,002 Mức độ biểu trung bình (%) 0,817 0,817 3,628 1,668 1,287 1,917 1,862 0,884 1,547 3,124 1,326 2,546 4,07 31,311 31,311 2,063 1,774 2,526 0,599 0,373 0,699 0,405 0,175 0,239 1,935 1,172 0,535 1,9 0,73 0,73 0,639 0,583 0,501 0,66 1,351 1,538 38,456 0,183 0,941 2,161 0,189 0,084 0,033497 0,072713 0,591364 0,231852 0,138996 0,300969 0,24206 0,047736 0,188734 0,487344 0,14586 0,499016 0,78958 17,56547 5,980401 0,249623 0,14192 0,270282 0,026356 0,013055 0,004194 0,013365 0,002625 0,003585 0,1935 0,106652 0,02675 0,2052 0,02044 0,02336 0,032589 0,023903 0,024549 0,0297 0,129696 0,195326 23,15051 0,002196 0,05646 0,23771 0,00189 0,000168 62,62701 94,56841 75,95 Phụ lục Mức độ biểu rASPG từ hệ biểu E coli/pE21maspg-nonhis Làn 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Băng Rf 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 0,039 0,088 0,11 0,132 0,152 0,177 0,193 0,227 0,251 0,299 0,316 0,343 0,38 0,415 0,449 0,477 0,502 0,545 0,581 0,614 0,624 0,694 0,744 0,804 0,834 OD 0,052 0,125 0,094 0,078 0,112 0,08 0,08 0,114 0,141 0,244 0,207 0,099 0,107 0,344 0,16 0,109 0,114 0,066 0,05 0,07 0,052 0,076 0,052 0,084 0,09 AmplOD IntOD 0,008 0,071 0,036 0,016 0,048 0,012 0,01 0,046 0,075 0,18 0,143 0,037 0,047 0,286 0,106 0,057 0,063 0,019 0,008 0,029 0,013 0,04 0,017 0,05 0,059 0,144 1,236 0,605 0,605 0,859 0,859 0,056 0,708 1,216 3,278 2,614 2,614 0,551 4,383 2,609 2,609 1,652 1,652 0,132 0,382 0,382 0,948 0,371 5,01 5,01 Amp*Int 0,001152 0,087756 0,02178 0,00968 0,041232 0,010308 0,00056 0,032568 0,0912 0,59004 0,373802 0,096718 0,025897 1,253538 0,276554 0,148713 0,104076 0,031388 0,001056 0,011078 0,004966 0,03792 0,006307 0,2505 0,29559 Mức độ biểu rASPG (%) 32,94987 Phụ lục Mức độ biểu rASPG sau trước tối ưu Làn 1 1 Băng Rf 0,072 0,109 0,137 0,164 0,216 OD 0,054 0,076 0,056 0,06 0,116 AmplOD 0,013 0,031 0,008 0,01 0,06 IntOD 0,184 0,343 0,145 0,145 1,118 Amp*Int Mức độ biểu rASPG (%) 0,002392 0,010633 0,00116 0,00145 0,06708 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0,244 0,267 0,312 0,33 0,403 0,452 0,493 0,509 0,533 0,563 0,605 0,641 0,702 0,776 0,793 0,857 0,927 0,956 0,098 0,13 0,161 0,198 0,231 0,249 0,298 0,387 0,41 0,491 0,515 0,545 0,579 0,626 0,685 0,741 0,759 0,859 0,915 0,945 0,105 0,092 0,12 0,099 0,116 0,099 0,125 0,129 0,132 0,16 0,103 0,092 0,278 0,116 0,084 0,099 0,118 0,092 0,074 0,056 0,056 0,086 0,082 0,07 0,101 0,082 0,088 0,103 0,094 0,114 0,066 0,064 0,175 0,07 0,078 0,06 0,064 0,058 0,045 0,03 0,055 0,033 0,048 0,031 0,057 0,062 0,064 0,092 0,035 0,022 0,208 0,05 0,02 0,041 0,066 0,042 0,031 0,011 0,01 0,038 0,032 0,019 0,047 0,024 0,032 0,049 0,04 0,06 0,014 0,014 0,117 0,025 0,035 0,025 0,034 0,03 0,471 0,289 0,972 0,972 1,271 0,359 0,953 0,778 1,006 1,267 0,785 0,239 3,213 0,918 0,477 1,098 1,15 0,351 0,285 0,154 0,091 0,735 0,343 0,221 0,78 0,281 0,265 0,835 0,543 0,896 0,357 0,15 1,548 0,292 0,935 0,611 0,572 0,31 0,021195 0,00867 0,05346 0,032076 0,061008 0,011129 0,054321 0,048236 0,064384 0,116564 0,027475 0,005258 0,668304 0,0459 0,00954 0,045018 0,0759 0,014742 0,008835 0,001694 0,00091 0,02793 0,010976 0,004199 0,03666 0,006744 0,00848 0,040915 0,02172 0,05376 0,004998 0,0021 0,181116 0,0073 0,032725 0,015275 0,019448 0,0093 46,22078 35,582 Phụ lục Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG tới sinh tổng hợp rASPG Nồng độ IPTG (mM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2 1,4 HT (U/ml) 52,319 49,524 41,352 45,438 50,384 41,782 45,008 HT (U/ml) HTR (U/mg) HTR (U/mg) HTTD1 (%) HTTD2 (%) 29,959 29,350 26,666 33,997 31,209 29,225 28,821 29,713 27,311 24,863 29,492 30,010 26,217 27,719 94,377 92,457 84,002 107,096 98,314 92,064 90,792 93,601 86,034 78,323 92,904 94,537 82,587 87,322 51,889 46,083 38,557 39,417 48,448 37,481 43,288 HTTDTB Sai số 0 93,989 0,549 89,245 4,542 81,163 4,015 100 10,035 96,426 2,670 87,326 6,701 89,057 2,454 HT: Hoạt tính L-asparaginase, HTR: Hoạt tính đặc hiệu L-asparaginase HTTD: Hoạt tính tương đối, HTTD TB: Hoạt tính tương đối trung bình Phụ lục Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ampicillin trước cảm ứng tới sinh tổng hợp rASPG Ampicillin (µg/ml) 25 50 100 150 200 250 HT HT (U/ml) (U/ml) 74,017 73,479 62,835 63,265 69,823 68,856 65,953 66,275 62,727 64,770 69,178 70,469 HTR HTR (U/mg) (U/mg) 36,040 35,779 29,268 29,469 32,928 32,472 30,654 30,804 29,712 30,680 31,764 32,356 HTTD1 100,364 81,506 91,698 85,365 82,742 88,455 HTTD2 99,636 82,063 90,427 85,782 85,437 90,105 HTTDTB 100,000 81,784 91,063 85,574 84,089 89,280 Sai số 0,515 0,394 0,899 0,295 1,905 1,167 Phụ lục Khảo sát ảnh hưởng nồng độ giống tới sinh tổng hợp rASPG Nồng độ giống tiếp (%) 0,5 HT (U/ml) 67,970 54,530 53,993 57,756 HT (U/ml) 67,074 53,634 56,322 61,340 HTR (U/mg) HTR (U/mg) HTTD1 TD-2 HTTDTB 37,456 26,333 30,726 26,500 36,963 25,901 32,052 28,145 100,663 70,770 82,576 71,219 99,337 69,607 86,139 75,639 100,000 70,189 84,358 73,429 Sai số 0,938 0,822 2,519 3,125 Phụ lục Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy tới sinh tổng hợp rASPG HT1 (U/ml) 52,411 58,341 HTR HTR HTTD- HTTD- HTTD(U/mg) (U/mg) TB 0 21,655 24,105 98,079 109,176 103,628 50,261 58,862 14,948 17,506 67,703 79,290 73,497 8,193 71,895 65,379 23,127 21,031 104,747 95,253 100 6,713 pH HT (U/ml) Sai số 0 7,847 Phụ lục Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon tới sinh tổng hợp rASPG, Nguồn C Lactose Fructose Glucose Maltose LB HT (U/ml) 33,774 46,937 26,215 23,153 52,411 HT (U/ml) 29,148 43,484 23,544 25,238 58,341 HTR (U/mg) 11,452 13,551 8,802 6,074 21,655 HTR (U/mg) 9,883 12,554 7,905 6,621 24,105 HTTD1 50,051 59,226 38,471 26,548 94,646 HTTDHTTDTB 43,195 46,623 54,868 57,047 34,551 36,511 28,940 27,744 105,354 100,000 Sai số 4,848 3,082 2,772 1,691 7,572 Phụ lục Khảo sát ảnh hưởng nguồn ion tới sinh tổng hợp rASPG, Khoáng KCl MgCl2 NaCl KH2PO4 HT (U/ml) 92,879 101,122 144,130 173,340 HT (U/ml) 80,156 88,399 160,438 179,254 HTR HTR HTTD(U/mg) (U/mg) 22,487 19,406 45,659 26,657 23,303 54,127 38,547 42,908 78,269 179,254 50,075 98,323 HTTD1 39,404 47,317 87,124 101,677 HTTDTB 42,532 50,722 82,697 100 Sai số 4,423 4,816 6,262 2,372 Phụ lục 10 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ rASPG, Nhiệt độ HT (U/ml) HT (U/ml) HTR (U/mg) HTR (U/mg) HT TD1 HT TD2 HTTD TB Sai số 25 15,146 14,142 191,690 178,989 65,256 60,933 63,095 3,057 30 19,447 16,938 246,122 214,370 83,786 72,977 78,382 7,643 35 18,730 20,020 237,050 253,379 80,698 86,257 83,477 3,931 37 20,164 271,523 255,194 263,359 92,434 86,875 89,654 3,931 45 22,744 23,676 287,853 299,646 97,993 102,007 100 2,839 55 22,099 19,375 279,688 245,215 95,213 83,477 89,345 8,298 65 19,160 19,662 242,493 248,843 82,551 84,713 83,632 1,529 Phụ lục 11 Ảnh hưởng pH tới hoạt độ rASPG, Đệm Acetat Phosphat Tris-HCL pH 4,5 5,5 6 6,5 7,5 8 8,5 10 HTR (U/mg) 0 34,746 51,075 53,797 321,419 173,546 167,196 339,563 244,307 215,277 237,050 101,878 94,620 HTR (U/mg) 0 31,117 39,282 41,096 302,368 147,238 148,145 303,275 239,772 247,936 208,927 121,836 103,692 HTTD-1 0 10,810 15,890 16,737 100,000 53,994 52,018 105,645 76,009 66,977 73,751 31,696 29,438 HTTD2 0 9,681 12,221 12,786 94,073 45,809 46,091 94,355 74,598 77,138 65,001 37,906 32,261 HTTDTB 0 10,246 14,056 14,762 97,036 49,901 49,054 100,000 75,303 72,058 69,376 34,801 30,850 Sai số 0 0,798 2,595 2,794 4,191 5,788 4,191 7,983 0,998 7,185 6,187 4,391 1,996 Phụ lục 12 Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền rASPG, Nhiệt độ (°C) 55 45 Thời gian ủ (phút) HTR (U/mg) HTR (U/mg) HTTD HTTD-2 20 40 60 80 100 100,971 58,333 73,755 58,333 41,096 40,189 20 40 60 80 100 20 100,971 67,405 60,147 53,797 36,560 39,282 131,262 122,308 HTTDTB 104,600 67,405 68,312 63,776 45,632 41,096 98,235 56,752 71,756 56,752 39,982 39,100 101,765 65,578 66,461 62,048 44,395 39,982 100,000 61,165 69,109 59,400 42,189 39,541 2,496 6,241 3,745 3,745 3,121 0,624 104,600 71,033 75,569 55,611 40,189 40,189 135,979 119,768 98,235 65,578 58,517 52,339 35,569 38,217 98,235 91,534 101,765 69,109 73,522 54,104 39,100 39,100 101,765 89,633 100,000 67,343 66,019 53,222 37,335 38,658 100,000 90,583 2,496 2,496 10,610 1,248 2,496 0,624 2,496 1,344 Sai số 37 40 60 80 100 121,519 115,105 97,623 108,265 118,797 110,750 99,165 98,467 90,943 86,143 73,060 81,024 88,906 82,884 74,214 73,691 89,925 84,514 73,637 77,358 1,440 2,304 0,816 5,185 Phụ lục 13 Ảnh hưởng pH tới độ bền rASPG, pH Thời gian ủ (phút) 20 40 60 80 100 HTR (U/mg) HTR (U/mg) HTTD HTTD-2 299,315 337,203 310,579 274,739 256,307 242,995 20 40 60 80 100 20 40 60 80 100 HTTDTB 338,227 347,443 340,275 258,355 235,827 235,827 93,897 105,782 97,430 86,187 80,405 76,229 106,103 108,995 106,746 81,047 73,980 73,980 100,000 107,388 102,088 83,617 77,192 75,104 8,632 2,271 6,587 3,634 4,543 1,590 334,131 369,971 355,635 362,803 276,787 246,067 308,531 414,003 324,915 308,531 232,755 261,427 103,983 115,137 110,676 112,906 86,138 76,577 96,017 128,840 101,115 96,017 72,435 81,358 100,000 121,989 105,895 104,461 79,286 78,967 5,633 9,689 6,760 11,943 9,689 3,380 417,075 529,715 490,803 436,531 377,139 363,827 420,147 543,027 523,571 405,811 312,627 292,147 99,633 126,541 117,246 104,281 90,093 86,913 100,367 129,721 125,073 96,942 74,682 69,790 100,000 128,131 121,159 100,612 82,387 78,351 0,519 2,249 5,535 5,189 10,897 12,108 Sai số Phụ lục 14 Ảnh hưởng EDTA ion kim loại tới hoạt độ rASPG Ion kim loại HTR (U/mg) HTR (U/mg) HTTD -1 HTTD-2 HTTDTB None 317,834 297,113 103,370 96,630 100,000 4,765 Mg2+ 335,292 326,809 109,047 106,289 107,668 1,951 Na+ 297,295 273,561 96,690 88,971 92,830 5,458 Ni2+ 276,243 256,153 89,843 83,309 86,576 4,620 EDTA 235,166 212,121 76,483 68,988 72,736 5,300 K+ 279,838 261,785 91,012 85,141 88,076 4,152 Sai số Fe3+ Ca2+ Fe2+ Ba2+ Cu2+ Al3+ 263,407 256,732 344,534 317,834 222,330 254,165 297,625 287,897 360,089 353,433 254,105 253,081 85,668 83,497 112,053 103,370 72,309 82,662 96,797 93,633 117,112 114,947 82,643 82,310 91,233 88,565 114,583 109,158 77,476 82,486 7,869 7,167 3,577 8,187 7,308 0,249 Mn2+ Hg2+ Pb2+ Zn2+ 368,153 224,897 327,590 294,728 388,761 221,849 326,809 321,689 119,735 73,144 106,542 95,855 126,437 72,152 106,289 104,623 123,086 72,648 106,415 100,239 4,739 0,701 0,180 6,200 Phụ lục 15 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt tới hoạt độ rASPG Nồng độ Chất hoạt động bề mặt ĐC Tween 20 1% Tween 80 Trixton X100 Trixton X114 Tween 20 5% Tween 80 Trixton X100 Trixton X114 HTR (U/mg) 202,035 193,843 123,187 101,683 100,659 HTR (U/mg) 212,275 173,363 117,043 113,971 106,803 HTTD1 97,528 93,574 59,466 49,086 48,591 HTTD2 102,472 83,688 56,500 55,017 51,557 HTTDTB 100,000 88,631 57,983 52,051 50,074 Sai số 0 92,467 0 57,651 0 44,637 0 27,830 0 36,233 0 11,884 3,495 6,991 2,097 4,194 2,097 Phụ lục 16 Ảnh hưởng DTT tới hoạt độ enzyme Chất thử DTT Nồng độ HTR (U/mg) HTR (U/mg) HTTD1 HTTD2 HTTDTB Sai số 0,1 mM 0,5 mM mM mM 201,881 228,761 278,681 254,361 198,041 217,241 310,681 227,481 99,120 112,318 136,828 124,887 97,235 106,662 152,539 111,689 98,177 109,490 144,683 118,288 1,333 3,999 11,110 9,332 Phụ lục 17 Đồ thị hàm lượng protein phân đoạn rASPG tinh qua cột Sephacryl S-200 Phụ lục 18 Đồ thị hàm lượng protein phân đoạn rASPG tinh qua cột DEAE-Sepharose 10 Điểm có ý nghĩa cho rASPG Phụ lục 19 Biểu đồ điểm số Mascot Điểm số Ion -10*Log (P), P sắc xuất tuyệt đối, Điểm số (score) > 44 có ý nghĩa (p 50 31,67 54,35 80,46 97,23 0,28 ĐC-: Đối chứng âm; TB: tế bào Phụ lục 22: Tác động rASPG lên phát triển tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8 Nồng độ (µg/ml) (ĐC-) 0,4 10 50 IC 50 rASPG % TB sống 100 99,44 87,21 72,82 46,32 Elipticine % TB ức chế ± 3,27 ± 2,53 ± 3,17 ± 1,56 41,67 0,56 12,79 27,18 53,68 ĐC-: Đối chứng âm; TB: tế bào % TB sống % TB ức chế 100 65,82 44,18 16,94 0,63 ± 2,98 ± 2,01 ± 0,97 ± 0,001 0,24 34,18 55,82 83,06 99,37 Phụ lục 23: Tác động rASPG lên phát triển tế bào ung thư tủy chuột SP2/0Ag14 Nồng độ (µg/ml) (ĐC-) 0,4 10 50 IC50 rASPG % TB sống % TB ức chế 100 0,98 12,79 ± 3,65 8,23 27,18 ± 2,68 19,45 53,68 ± 3,21 51,22 100 ± 1,58 48,09 ĐC-: Đối chứng âm TB: tế bào Elipticine % TB sống % TB ức chế 100 83,06 ± 1,69 33,87 99,37 ± 1,34 53,49 100 ±1,03 80,91 100 ± 0,05 98,22 0,27 12 Phụ lục 24: Tác động rASPG lên phát triển tế bào ung thư tủy mãn người K562 Nồng độ rASPG (µg/ml) (ĐC-) 2,65625 5,3125 10,625 21,25 42,5 85 IC50 % tế bào sống % tế bào ức chế 100 92,519 ± 2,52 88,392 ± 3,54 84,691 ± 4,34 83,413 ± 4,58 78,142 ± 3,43 74,574 ± 3,55 8,038 14,301 18,058 20,564 25,365 26,618 ĐC-: Đối chứng âm >50 Phụ lục 25: Tác động rASPG thuốc ONCOGINASE lên phát triển tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp HL60 Nồng độ µg/ml (ĐC-) 6,25 12,5 25 50 100 200 IC 50 rASPG % TB sống % TB ức chế 100 49,329 ± 3,773 50,674 48,833 ± 4,247 51,057 49,230 ± 1,275 50,769 46,696 ± 2,229 53,284 43,865 ± 1,610 56,094 36,910 ± 0,483 63,100 1,138 ĐC-: Đối chứng âm TB: tế bào ONCOGINASE % TB sống 100 56,582 ± 2,855 55,042 ± 2,948 50,671 ± 2,234 46,448 ± 1,891 % TB ức chế 53,552 49,329 44,958 43,418 32,825 13 Phụ lục 26: Tác động rASPG thuốc ONCOGINASE lên phát triển tế bào ung thư bạch cầu lympho người Jurkat Nồng độ (µg/ml) (ĐC-) 6,25 12,5 25 50 100 IC50 rASPG % TB sống ONCOGINASE % TB ức chế 100 65,731 ± 3,93 60,922 ± 4,23 62,625 ± 2,81 60,120 ± 4,94 61,122 ± 8,13 >50 34,115 38,965 37,258 39,679 38,589 % TB sống % TB ức chế 100 74,148 ± 7,64 63,327 ± 7,23 67,435 ± 5,92 64,228 ± 6,05 60,220 ± 4,44 ĐC-: Đối chứng âm TB: tế bào 25,515 36,368 32,314 35,510 39,584 >50 Phụ lục 27 Trình tự gene đặt tổng hợp Phụ lục 28 Các pic đọc trình tự 14 15 ... HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ HIỀN TRANG BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ MÁU CỦA ENZYME L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP TỪ Erwinia. .. tế bào ung thƣ máu enzyme L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi tiến hành thực với mục tiêu Biểu L-asparaginase tái tổ hợp từ Erw chrysanthemi có hoạt tính ức chế sinh trưởng với tế. .. đến hoạt tính enzyme; Đánh giá khả ức chế sinh trưởng L-asparaginase tái tổ hợp 5) số dòng tế bào ung thư máu ung thư rắn người chuột Đánh giá ảnh hưởng L-asparaginase tái tổ hợp tới tế bào thư ng
- Xem thêm -

Xem thêm: Biểu hiện và nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu của enzyme lasparaginase tái tổ hợp từ erwinia chrysanthemi , Biểu hiện và nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu của enzyme lasparaginase tái tổ hợp từ erwinia chrysanthemi

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn