Phân tích SAPONIN GVHD: Cô TRINH THI ĐIÊP HVTH: ĐƯỜNG THI HƯƠNG GIANG MSHV: 1801089 GIỚI THIỆU  Saponin gọi saponosid nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi thực vật  Saponin có nhiều lồi thực vật, thực vật hoang dại lẫn thực vật gieo trồng  Do tính chất hoạt động mặt tẩy rửa, saponin tác nhân tạo bọt tốt cho dung dịch cần có bọt bền  Dịch chiết Yucca Quillaja dùng công nghệ đồ uống để gây bọt cho nước uống Cũng đặc tính hoạt động bề mặt, dịch chiết dùng cơng nghiệp tách quặng, làm chất nhũ hóa chế tạo phim ảnh mỹ phẩm son mơi shampoo NƠI DUNG CHINH I Đặc điểm cấu trúc II Tính chất vật lý hóa học đặc trưng III Phương pháp chiết xuất nhóm chất saponin IV Định tính saponin V Phân tích TLC VI Phân tích HPLC VII Ví dụ phân tích saponin sâm I Đặc điểm cấu trúc Đăc điêm câu truc Phân loại saponin Nhóm olean Phần lớn saponin triterpenoid tự nhiên thuộc nhóm Phần aglycon thường có vòng thường dẫn chất 3- hydroxy olean 12 – ene Chứa nhiều cam thảo Nhóm ursan  Cấu trúc nhóm ursan tương tự nhóm olean khác nhóm methyl C-30  khơng đính vào vị trí C-20 mà lại đính vị trí C-19  Các sapogenin nhóm ursan thường dẫn chất 3- hydroxy ursan 12-ene, tức là -amyrin  Những saponin nhóm có canh ki na rau má Nhóm lupan Cấu trúc nhóm lupan có vòng A,B,C,D giống nhóm trên, khác vòng E vòng cạnh, C-20 ngồi vòng thường có nối đơi vị trí 2029 Chứa rễ Ơ rơ Acanthus iliciformis Linn Nhóm hopan  Cấu trúc nhóm hopan có vòng A,B,C,D giống nhóm trên, khác vòng E vòng cạnh, C-22 ngồi vòng nhóm methyl góc đính C-18 thay C-17 chứa cỏ Mollugo hirta L Nhóm dammaran  Phần aglycon gồm vòng mạch nhánh Thường gặp : nhân sâm, rau đắng biển, hạt đại táo, tam thất… Phân tích saponin TLC Ưu điểm: - Chỉ cần lượng mẫu để phân tích Có thể phân tích đồng thời mẫu chất chuẩn đối chứng điều kiện phân tích - Thời gian nhanh chóng Sử dụng loại axit mạnh như: H2SO4, HNO3 … để phát vết Tất hợp chất mẫu phân tích định vị sắc kí mỏng Phân tích saponin TLC Nhược điểm: - Sắc kí lớp mỏng phản ứng xảy nhiệt độ thấp cho kết khơng mẫu thử sẽ làm ấm lên mao dẫn - Phần lớn hợp chất hữu khơng có màu nên sắc kí giấy sẽ khơng cho thấy vị trí mẫu chất q trình dung mơi di chuyển lên giấy Phân tích saponin HPLC  Pha tĩnh - Pha tĩnh cho sắc ký lỏng cao áp với saponin thường pha đảo PR-18 - Pha tĩnh theo chế rây phân tử dùng  Hệ dung môi - Hệ dung môi sử dụng sắc ký hỗn hợp nước – methanol – acetonitril với tỉ lệ khác nhau, có hay khơng có dung dịch đệm - Chương trình dung mơi isocratic hay gradient Phân tích saponin HPLC  Detector: - Detector dùng để phát gồm xác định sổ khúc xạ (RI), hay tán xạ bay (ELSD) - Detector có nhiều ưu điểm detector khối phổ (MS hay MS/MS với kỹ thuật ion hóa ESI hay APCI) - Do saponin có nối đơi, nối đơi liên hợp nên thường có hấp thu tử ngoại vùng sóng ngắn 210 -195 nm nên việc sử dụng detector UV tương đối hạn chế phân tích saponin Phân tích saponin HPLC Hê thống săc ky long hiêu cao Phân tích saponin HPLC Ưu điểm: - So vơi săc ky lơp mong thi săc kí HPLC có hiêu tách cao - Nhiều nhà nghiên cứu sử dụng thiết bị ghép nối LC –MS – NMRCD đê phân tích thành phân dịch chiết và xác định câu truc chât mà không cân tách riêng chât - Phương pháp này có thê phân tích nhiều mâu và chât tách khoi côt thu lại đê có chât tnh khiết Nhược điểm: - Chi phí máy móc cao nên sử dụng trường hợp không tách chât bằng phương pháp săc kí khác VII Ví dụ phân tích saponin thực vật PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CÁC SAPONIN CHÍNH TRONG SÂM VIỆT NAM NUÔI CẤY MÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KY LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyên liệu Mẫu Bộ phận dùng Độ ẩm Nguồn cung cấp Sâm Việt Nam Rễ củ 6,56% Sở Y tế Kontum (SVN) Sâm Việt Nam Căn hành: 60% Tiền nuôi cấy mô (SVN NCM) con: 20% Plbs1: 20% 10,88% Công ty TNHH Quốc tế Hoàng Gia (*) Hóa chất và dụng cụ máy móc  Chất chuẩn: saponin chuẩn, gồm: G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M R2Chất chuẩn: saponin chuẩn, gồm: G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, MR2 có độ tinh khiết > 97% Máy HPLC LC-10 AD – Shimadzu, Nhật Bản, cột Supelcosil RP-C18 (150 x 4,6 mm, 5,0 µm), kèm theo cột bảo vệ Supelguard (20 x 4,6 mm), detector photodiode array (SPD-M10A VP Shimadzu, Nhật Bản) đặt bước sóng 203 nm detector RI, tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Chuẩn bị mẫu phân tích Mẫu dược liệu o - Sấy nhiệt độ 60 ± C 2-3 - Kiểm tra SKLM (đảm bảo chiết hết saponin) Nghiền thành bột mịn (cân xác khoảng g) Chiết MeOH, Chiết Soxhlet Dịch MeOH o o - Lọc cô chân không đến cắn (t C ≤ 50 C) - Cân cắn thu được, cho lượng thích hợp vào cột diaion HP-20 (2,5 x 30 cm) - Chiết xuất nước, MeOH,CHCl3 H2O MeOH CHCl3 Dịch H2O Dịch MeOH (hợp chất (hợp chất đường) saponin) Dịch CHCl3 (hợp chất béo) Quy trình phân tích HPLC Dịch MeOH (hợp chất saponin) o o Cô chân không (t C ≤ 50 C) Cắn saponin - Cân xác mg cắn - Hòa tan ml MeOH - Lọc qua lọc 0,45 μm - Bơm vào máy HPLC (20 μl) Săc ky đô Định tính sơ bô sắc ký lớp mỏng  Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử: hòa tan chất chuẩn cắn saponin vào methanol  Điều kiện sắc ký • Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 (Merck) lớp dưới) • Hệ dung mơi: CHCl3-MeOH-H2O (65: 35:10, • Thuốc thử màu: H2SO4 20%/EtOH 50%, sấy 105oC đến màu Kết quả phân tích SKLM Phân tích sơ SKLM cho thấy, sắc đồ SKLM SVN NCM xuất vết tương tự SVN, vết saponin tương ứng với vết saponin chuẩn Rf SVN NCM SVN G-Rb1 0,22 x x G-Re 0,30 x x N-R1 0,32 x x G-Rd 0,35 x x G-Rg1 0,44 x x M-R2 4,48 x x   Kết quả phân tích SK HPLC Kết định lượng cho thấy, mẫu SVN NCM có chứa saponin tương tự SVN hàm lượng saponin chưa cao, ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy thời gian nuôi cấy ... nhóm chất saponin IV Định tính saponin V Phân tích TLC VI Phân tích HPLC VII Ví dụ phân tích saponin sâm I Đặc điểm cấu trúc Đăc điêm câu truc Phân loại saponin Nhóm olean Phần lớn saponin. .. để tủa saponin  Saponin trung tính bị tủa chì acetat, bari hydroxyd Saponin acid tan dung dịch kiềm bị tủa amoni sulfat  Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất để tinh chế saponin. .. 1N, có mầm khoai tây • Ngoài nhóm saponin steroid kê người ta gặp số saponin steroid có câu truc mạch nhánh khác ví dụ polypodosaponin và oslandin Jizba phân lập 1971 từ thân rễ cây Polypodium