TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN NGUYỄN THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Hà Nội, tháng năm 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN NGUYỄN THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Ngƣời hƣớng dẫn: TS CAO BÁ CƢỜNG Hà Nội, tháng năm 2019 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc neomycin sulfate vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy môi trƣờng chuẩn” nhận đƣợc hƣớng dẫn, giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, gia đình bạn bè Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội Đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Cao Bá Cƣờng, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, hƣớng dẫn tận tình việc lựa chọn đề tài nghiên cứu, bảo, giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu chỉnh sửa thiếu sót q trình nghiên cứu để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cô giáo Khoa Sinh - KTNN thầy, cô Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi tận tình giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Đặc biệt, tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, quan tâm động viên gia đình, bạn bè suốt q trình hồn thành khố luận Tuy thân có nhiều cố gắng nhƣng lần đầu tham gia nghiên cứu khoa học, kiến thức kinh nghiệm hạn chế nên khóa luận khơng thể tránh đƣợc thiếu sót Vì vậy, tơi mong nhận đƣợc góp ý q thầy để khóa luận đƣợc hồn chỉnh Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Hƣơng LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc neomycin sulfate vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy mơi trƣờng chuẩn” cơng trình nghiên cứu tơi thực dƣới hƣớng dẫn TS Cao Bá Cƣờng Các kết số liệu đƣợc trình bày khóa luận trung thực, khách quan chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu tác giả khác Nếu sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Hƣơng DANH LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VLC Vật liệu cellulose G xylinus Gluconacetobacter xylinus HS Môi trƣờng chuẩn OD Mật độ quang phổ PBS Phosphate buffered saline DANH LỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học VLC Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo neomycin sulfate 10 Hình 2.1 Quy trình thu nhận màng VLC tinh khiết 16 Hình 3.1 Màng VLC ni cấy tĩnh HS phòng thí nghiệm 20 Hình 3.2 Quy trình tạo màng VLC tinh khiết 21 Hình 3.3 Màng VLC tinh khiết sau đục nhỏ 22 Hình 3.4 Kết kiểm tra độ tinh màng VLC 22 Hình 3.5 Phƣơng trình đƣờng chuẩn NS PBS (pH = 7,4) 23 Hình 3.6 Màng VLC hấp thụ thuốc neomycin sulfate 24 Hình 3.7 Hiệu suất hấp thụ neomycin sulfate độ dày màng h; 1,5 h; h 26 DANH LỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần môi trƣờng chuẩn lên men thu màng VLC Bảng 2.1 Thành phần HS lên men thu màng VLC 14 Bảng 2.2 Môi trƣờng đệm PBS với pH = 7,4 17 Bảng 3.1 Kết độ dày màng VLC thô (n = 3) 19 Bảng 3.2 Mật độ quang dung dịch neomycin sulfate giá trị OD277 nm (n = 3) 23 Bảng 3.3 Giá trị OD trung bình dung dịch neomycin sulfate ngâm màng VLC h, 1,5 h, h (n = 3) 25 Bảng 3.4 Lƣợng thuốc Neomycin sulfate hấp thụ qua màng VLC h; 1,5 h; h (n = 3) 26 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quan đối tƣợng lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1 Vật liệu cellulose lên men từ môi trƣờng chuẩn 1.1.1.1 Cấu trúc VLC 1.1.1.2 Một vài đặc điểm vật liệu cellulose 1.1.1.3 Đặc tính vật liệu cellulose 1.1.1.4 Vi sinh vật tổng hợp cellulose 1.1.1.5 Môi trƣờng nuôi cấy G xylinus nhằm thu màng VLC 1.1.2 Tổng quan neomycin sulfate 1.1.2.1 Công thức 1.1.2.2 Tính chất lí hóa 10 1.1.2.3 Dƣợc lí dƣợc động học 10 1.1.2.4 Chỉ định chống định 11 1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 11 1.2.1 Tình hình nghiên cứu vật liệu cellulose 11 1.2.2 Tình hình nghiên cứu neomycin sulfate 12 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu nghiên cứu 13 2.1.1 Giống vi khuẩn 13 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 13 2.1.3 Thiết bị đƣợc sử dụng nghiên cứu 13 2.1.4 Dụng cụ đƣợc sử dụng nghiên cứu 14 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Chuẩn bị màng vật liệu celulose 14 2.2.1.1 Tạo màng VLC thô từ môi trƣờng chuẩn 14 2.2.1.2 Tạo màng VLC tinh khiết 15 2.2.2 Chế tạo màng VLC nạp thuốc neomycin sulfate 16 2.2.2.1 Chuẩn bị hệ đệm 16 2.2.2.2 Xây dựng đƣờng chuẩn thuốc neomycin sulfate 17 2.2.2.3 Nạp thuốc neomycin sulfate vào màng VLC 17 2.2.3 Phƣơng pháp xử lý thống kê 18 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Thu màng VLC từ môi trƣờng chuẩn 19 3.2 Tạo màng VLC tinh khiết từ màng VLC thô 20 3.3 Đƣờng chuẩn hấp thụ thuốc neomycin sulfate PBS (pH = 7,4) 23 3.4 Khả hấp thụ thuốc neomycin sulfate vào màng VLC nuôi cấy môi trƣờng chuẩn 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29 Kết luận 29 Kiến nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 Trong đó: mht: khối lƣợng thuốc neomycin sulfate hấp thụ vào màng (mg) m1: khối lƣợng thuốc neomycin sulfate ban đầu dung dịch (mg) m2: khối lƣợng thuốc neomycin sulfate sau khoảng thời gian tƣơng ứng màng hấp thụ thuốc (mg) Đánh giá hiệu suất nạp thuốc vào màng VLC đƣợc tính theo công thức: EE (%) = mht (mg/ cm3 ) x 100% (2) m0 (mg/ cm3 ) Trong đó: EE (%): hiệu suất nạp thuốc neomycin sulfate màng VLC mht (mg/cm3): khối lƣợng thuốc neomycin sulfate hấp thụ đơn vị thể tích màng m0 (mg/cm3): khối lƣợng thuốc neomycin sulfate đơn vị thể tích dung dịch ban đầu Mỗi thí nghiệm đƣợc thực lặp lại ba lần 2.2.3 Phƣơng pháp xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại lần, kết để tính tốn đƣợc lấy trung bình, số liệu thống kê đƣợc thể dƣới dạng “số trung bình ± SD” Các số liệu thực nghiệm thu đƣợc tính hiệu suất hấp thụ thuốc đƣợc phân tích phần mềm Microsofl Excel Xử lý số liệu thông qua phần mềm kiểm định giả thuyết giá trị trung bình hai mẫu cách sử dụng hàm: t - Test: Two Sample Assuming Unequal Variences với mức ý nghĩa α = 0,05 Nếu giá trị p < 0,05 khác biệt giá trị trung bình đƣợc coi có ý nghĩa thống kê 18 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu màng VLC từ môi trƣờng chuẩn Khi nuôi cấy tĩnh vi khuẩn G xylinus nhiệt độ phòng, ngày vi khuẩn bắt đầu vào làm quen với môi trƣờng, chuẩn bị dinh dƣỡng lƣợng cung cấp cho giai đoạn sinh trƣởng tiếp theo, acid bắt đầu đƣợc sinh với lƣợng nhỏ làm cho môi trƣờng giảm nhẹ pH Ngày thứ hai, bình ni cấy xuất màng VLC có màu trắng ngà lẫn nhiều tạp chất bề mặt môi trƣờng, màng VLC dày dần lên môi trƣờng hết chất dinh dƣỡng Độ dày màng tùy thuộc vào độ dài thời gian nuôi cấy Khi thu màng VLC, để thu đƣợc màng có độ dày khác theo ý muốn thu thời điểm khác Khi màng đạt độ dày theo mong muốn, tiến hành thu màng VLC dày 0,3 cm sau khoảng ngày nuôi cấy, màng dày 0,5 cm sau khoảng ngày nuôi cấy Sử dụng loại màng để thực bƣớc trình nghiên cứu Màng VLC thơ có màu trắng ngà, dễ dàng tách khỏi mơi trƣờng ni cấy, có độ dẻo dai chứa nhiều nƣớc Tiến hành thu màng đo kích thƣớc độ dày màng, thu đƣợc kết độ dày màng theo bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết độ dày màng VLC thô (n = 3) STT Thời gian nuôi cấy (ngày) Độ dày màng (cm) Màng 0,3 ± 0,0006 Màng 0,5 ± 0,0011 Màng VLC nuôi cấy tĩnh môi trƣờng chuẩn đƣợc thể nhƣ hình 3.1 19 a) Ngày b) Ngày thứ c Ngày thứ Hình 3.1 Màng VLC nuôi cấy tĩnh HS phòng thí nghiệm 3.2 Tạo màng VLC tinh khiết từ màng VLC thô Xử lý màng VLC thô giúp loại bỏ tạp chất Đây bƣớc quan trọng trƣớc nạp thuốc vào màng nhằm hấp thụ đƣợc lƣợng thuốc tối đa vào màng Thực theo quy trình trình bày hình 2.1 Màng VLC tinh khiết 20 thu đƣợc có màu trắng sáng, mềm mại, có độ dẻo dai độ đàn hồi cao Hình ảnh màng VLC trình tinh chế đƣợc trình bày hình 3.2 a Màng VLC thơ b Màng VLC xả nƣớc c Màng VLC tinh khiết Hình 3.2 Quy trình tạo màng VLC tinh khiết * Sau thu đƣợc màng VLC tinh khiết, tiến hành đục màng theo khn có đƣờng kính (d = 1,5 cm) thành viên nhỏ rửa nƣớc 21 Hình ảnh VLC sau đƣợc đục nhỏ thể qua hình 3.3 Hình 3.3 Màng VLC tinh khiết sau đục nhỏ * Kết thí nghiệm kiểm tra độ tinh màng VLC thể hình 3.4 Hình 3.4 Kết kiểm tra độ tinh màng VLC Kết thí nghiệm khơng có tƣợng vẩn đục, chứng tỏ khơng tìm thấy diện protein màng VLC tinh khiết Tiến hành sử dụng màng VLC mang hấp thụ thuốc neomycin sulfate 22 3.3 Đƣờng chuẩn hấp thụ thuốc neomycin sulfate PBS (pH = 7,4) Ghi kết OD tính giá trị OD trung bình neomycin sulfate bƣớc sóng 277 nm đƣợc thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Mật độ quang dung dịch neomycin sulfate giá trị OD277 nm (n = 3) Nồng độ 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,0049 ± 0,013 ± 0,021 ± 0,029 ± 0,037 ± 0,044 ± 0,0001 0,001 0,0015 0,001 0,002 0,0012 (mg/ml) OD Sử dụng máy quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản) đo mật độ quang neomycin sulfate nồng độ khác phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng - Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2, sau sử dụng phần mềm Excel 2010 để xử lí số liệu cho kết phƣơng trình đƣờng chuẩn neomycin sulfate là: Phƣơng trình đƣờng chuẩn: y = 0,1574x - 0,0027 (R = 0,9995) Trong đó: y: mật độ hấp thụ thuốc OD 277 nm x: Nồng độ neomycin sulfate (mg/ml) R : hệ số tƣơng quan bình phƣơng Phƣơng trình đƣờng chuẩn neomycin sulfate môi trƣờng đệm PBS (pH = 7,4) đƣợc trình bày hình 3.5 Mật độ hấp thụ OD 277nm OD277nm 0.05 y = 0.1574x - 0.0027 R² = 0.9995 0.04 0.03 0.02 OD277nm 0.01 Linear (OD277nm) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 Nồng độ neomycin sulfate (mg/ml) 0.35 Hình 3.5 Phƣơng trình đƣờng chuẩn NS PBS (pH = 7,4) 23 3.4 Khả hấp thụ thuốc neomycin sulfate vào màng VLC nuôi cấy môi trƣờng chuẩn Sử dụng màng VLC đƣợc xử lý có độ dày phù hợp (0,3 cm; 0,5 cm) để hấp thụ thuốc Tiến hành loại bỏ 60% nƣớc màng cách ép loại bỏ nƣớc Tiếp theo, chuẩn bị bình tam giác có chứa 100 ml dung dịch đệm PBS (pH = 7,4) có chứa thuốc neomycin sulfate nồng độ mg/ml Tiến hành cho màng có độ dày khác vào bình tam giác chuẩn bị trên, bình chứa màng Sau rung động 180 vòng/phút 400C khoảng thời gian h; 1,5 h; h Màng VLC hấp thụ thuốc neomycin sulfate thể hình 3.6 Hình 3.6 Màng VLC hấp thụ thuốc neomycin sulfate Sau cho thuốc neomycin sulfate hấp thụ vào VLC khoảng thời gian lần lƣợt h; 1,5 h; h lấy dung dịch bình tam giác đo quang phổ UV – 2450 để xác định lƣợng thuốc neomycin sulfate hấp thụ vào màng Kết đo đƣợc thể bảng 3.3 24 Bảng 3.3 Giá trị OD trung bình dung dịch neomycin sulfate ngâm màng VLC 1h, 1,5h, 2h (n = 3) Độ dày màng VLC (cm) Giá trị OD trung bình khoảng thời gian 1h 1,5 h 2h 0,3 0,0293±0,0001 0,0263±0,0002 0,0261±0,0001 0,5 0,0305±0,0001 0,0296±0,0001 0,0295±0,0002 Từ kết thu đƣợc bảng 3.3 ta thấy giá trị OD 277 nm giảm dần từ h; 1,5 h đến h gần nhƣ không thay đổi hai độ dày màng Chứng tỏ lƣợng thuốc neomycin sulfate hấp thụ vào màng đạt cực đại Từ kết bảng 3.3, lấy giá trị OD đo đƣợc thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn neomycin sulfate: y = 0,1574x - 0,0027 (R = 0,9995) từ tính đƣợc khối lƣợng thuốc neomycin sulfate có dung dịch sau khoảng thời gian định màng hấp thụ thuốc (m2) Sau tính đƣợc m2, thay giá trị m2 vào cơng thức (1) ta tính đƣợc khối lƣợng neomycin sulfate hấp thụ vào màng VLC (mht) Tiếp tục lấy giá trị mht thay vào công thức (2) ta thu đƣợc hiệu suất hấp thụ thuốc neomycin sulfate màng VLC Kết đƣợc trình bày bảng 3.4 25 Bảng 3.4 Lƣợng thuốc Neomycin sulfate hấp thụ qua màng VLC h; 1,5 h; h (n = 3) Độ dày Thời gian m1 (mg) 1h y ( OD 277 nm) m2 (mg) 0,0293 ± 0,0001 0,2032± 0,0010 1,7968± 0,0007 89,84± 0,0361 1,5 h 0,0263± 0,0002 0,1844± 0,0010 1,8156± 0,0010 90,77± 0,0473 2h 0,0261± 0,0001 0,1830± 0,001 1,8170± 0,0006501 90,85± 0,0351 1h 0,0305± 0,0001 0,2112± 0,0009 1,7888± 0,0009 89,43± 0,0436 1,5 h 0,0296± 0,0001 0,2050± 0,0004 1,7950± 0,0004 89,75± 0,02 2h 0,0295± 0,0002 0,2044± 0,001 1,7956± 0,00097 89,78± 0,0485 mht (mg) màng (cm) 0,3 0,5 EE (%) Hiệu suất hấp thụ thuốc neomycin sulfate thể hình 3.7 Hiệu suất hấp thụ thuốc (%) 91 90.85 90.77 90.5 90 89.5 89.84 89.75 89.78 0,3 89.43 0,5 89 88.5 1h 1,5h 2h Thời gian Hình 3.7 Hiệu suất hấp thụ neomycin sulfate độ dày màng h; 1,5 h; h 26 Từ kết bảng 3.4 hình 3.7 cho thấy: Lƣợng thuốc neomycin sulfate hấp thụ vào màng VLC tƣơng đối lớn (89,43% - 90,85%) Xét độ dày màng, chế độ rung 180 vòng/phút, nhiệt độ 400C, khác thời gian hấp thụ màng VLC hấp thụ thời gian h hấp thụ thuốc neomycin sulfate cao nhất, hấp thụ cao màng 1,5 h h; màng hấp thụ h hấp thụ thuốc thấp - Ở độ dày màng 0,3 cm: + Khối lƣợng thuốc hấp thụ vào màng h (1,8170 mg) cao nhất, cao màng 1,5 h (1,8156 mg) 0,0014 mg, cao màng h (1,7968 mg) 0,0202 mg + Ở h hiệu suất hấp thụ thuốc đạt 90,85% cao 1,5 h (90,77%), cao h (89,84%) - Ở độ dày màng 0,5 cm: + Khối lƣợng thuốc hấp thụ vào màng h (1,7956 mg) cao 1,5 h (1,7950 mg) 0,0006 mg, cao màng h (1,7888 mg) 0,0068 mg + Hiệu suất hấp thụ thuốc nạp vào màng h 89,78%, cao 1,5 h (89,75%), cao h (89,43%) Vậy độ dày màng, màng VLC hấp thụ thuốc neomycin sulfate cao h - Xét khác độ dày màng, điều kiện thời gian hấp thụ: + Xét màng h, màng có độ dày 0,3 cm có khối lƣợng thuốc hấp thụ vào màng 1,7968 mg, tỷ lệ hấp thụ thuốc 89,84%, cao màng có độ dày 0,5 cm 1,7888 mg 89,43% + Xét màng 1,5 h, màng có độ dày 0,3cm có khối lƣợng thuốc hấp thụ vào màng 1,8156mg, tỷ lệ hấp thụ thuốc 90,77%, cao màng có độ dày 0,5cm 1,7950mg 89,75% 27 + Xét màng 2h (thời gian hấp thu cực đại), màng có độ dày 0,3 cm có khối lƣợng thuốc hấp thụ vào màng 1,8170 mg, tỷ lệ hấp thụ thuốc 90,85% cao màng có độ dày 0,5 cm 1,7956 89,78% (tất số liệu có ý nghĩa thống kê với P(T