4/2/2019 Chương 5: Sàng lọc enzyme Enzyme screening Tại sàng lọc enzyme • Tìm loại enzyme có đặc tính cải tiến (pH, nhiệt độ, đặc hiệu chất…) • Tìm kiếm enzyme cho phản ứng  việc lựa chọn bảo tồn loại enzyme có giá trị cho ứng dụng cơng nghệ giai đoạn ban đầu quan trọng công tác sàng lọc Sàng lọc enzyme 4/2/2019 Sàng lọc enzyme • Phương pháp sàng lọc cổ điển • Phương pháp sàng lọc phân tử • Phương pháp sàng lọc gen từ mẫu môi trường tự nhiên Sàng lọc enzyme Phương pháp sàng lọc cổ điển Nguyên tắc: • Thu mẫu từ địa điểm phù hợp (suối nước nóng, hồ nước mặn,…), sử dụng mồi nhử (miếng cotton) • Sử dụng mơi trường đặc hiệu chứa chất phù hợp cho loại vi sinh vật, loại vi sinh vật có chứa enzyme phân giải chất có khả sinh trưởng phát triển • Ni cấy bình tam giác, tinh enzyme, sau mơ tả enzyme (toC, pH…) • Cải tiến q trình tổng hợp enzyme (chất cảm ứng, môi trường, điều kiện lên men) • Lên men quy mơ lớn, hình thành công thức tạo sản phẩm enzyme Sàng lọc enzyme 4/2/2019 Phát triển phương pháp sàng lọc You get what you screen for Sàng lọc enzyme Lưu ý • tiến hành sớm tốt thay đổi hóa học sinh lý dẫn đến chết vi sinh vật hay giảm hoạt tính chủng khác • cần phải làm giảm số lượng chủng vi sinh vật không mong muốn q trình sàng lọc pha lỗng hay dùng kháng sinh nhiệt để loại bỏ vsv không mong muốn Sàng lọc enzyme 4/2/2019 Khó khăn • Hình thái vsv giống • Một số loại tồn khơng cần dinh dưỡng • VSV tự nhiên có lượng enzyme quan tâm thấp • Chỉ 1% hệ vsv phát Sàng lọc enzyme Phương pháp sàng lọc phân tử - Tìm kiếm thơng tin enzyme (http://www.brenda.enzymes.info) - Tìm kiếm trình tự tương đồng (DNA, cấu trúc protein ) sở liệu (http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/) - Tìm kiếm trình tự gen “giả định” (putative) - Lựa chọn gen tạo dòng - Biểu gen - Ưu: nhanh đơn giản - Nhược: cần phải biết trình tự ban đầu Sàng lọc enzyme 4/2/2019 Thư viện DNA Sàng lọc enzyme Sàng lọc gen từ mẫu môi trường tự nhiên - Metagenom • Metagenom phân tích DNA đa hệ gen (DNA metagenome) tất vi sinh vật thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường tự nhiên • Metagenom việc ứng dụng kỹ thuật di truyền đại nghiên cứu quần xã vi sinh vật cách trực tiếp môi trường tự nhiên chúng mà không cần phải phân lập ni cấy chúng phòng thí nghiệm Sàng lọc enzyme 10 4/2/2019 Thu nhận DNA/RNA từ mẫu Cắt DNA thành mảnh nhỏ Tạo dòng Biến nạp vào vật chủ Tinh enzyme Sàng lọc enzyme 11 Phương pháp thực • Metagome dựa vào chức • Metagenome dựa liệu giải trình tự DNA đa hệ gen Sàng lọc enzyme 12 4/2/2019 Metagenom dựa vào chức Mục tiêu sàng lọc đặc tính có lợi khả chịu mặn, tạo kháng sinh mới, hay hoạt tính enzyme cao Sau xác định nguồn gốc phát sinh DNA tạo dòng Sàng lọc enzyme 13 Ví dụ: β-glucosidase từ cỏ bò • Hemi-cellulase dùng để phân hủy cellulose sx cồn sinh học • Chi phí cao, hoạt tính thấp • 2004: sử dụng hỗn hợp enzyme (endogluconase, exogluconase β-glucosidase) giảm giá thành cellulase thương mại 20-30 lần • Để giảm chi phí nữacần xác định enzyme kết hợp với enzyme thương mai Sàng lọc enzyme 14 4/2/2019 Ví dụ: β-glucosidase từ cỏ bò • Thuộc gia đình GH3, sử dụng cho đường hóa chất trung gian glucose-oligosaccharide (các chất sản phẩm phản ứng xúc tác endoglucanase) • GH3 vi khuẩn có khoảng 2000 enzyme • Hệ tiêu hóa động vật, mối, dế nơi chứa hệ glucanase phong phú • Sử dụng phương pháp “metagenomics dựa vào chức năng” Sàng lọc enzyme 15 Sàng lọc β-glucosidase từ cỏ bò • Từ cỏ 17,000 dòng • Phương pháp sàng lọc: khả phân hủy p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) p-nitrophenyl-β-D-cellobioside (pNPβC) • enzyme glucosidase sàng lọc, biểu E coli, tinh mơ tả • Phân tích hoạt động glucosidase tinh chất tự nhiên cello-oligosaccharide • Phân tích cấu trúc 3D Sàng lọc enzyme 16 4/2/2019 Sàng lọc enzyme 17 Nhược điểm – Metagenom theo chức • tốn nhiều thời gian công sức, phải sàng lọc khối lượng lớn dòng ngân hàng • Cách tiếp cận khơng u cầu số lượng dòng ngân hàng phải lớn mà chất lượng ngân hàng phải cao Sàng lọc enzyme 18 4/2/2019 Metagenom dựa vào liệu trình tự DNA đa hệ gen • Mục tiêu: sàng lọc dòng mang đoạn trình tự tương đối ngắn, bảo thủ đặc trưng cho lồi (16S rRNA), sau giải trình tự tồn dòng để xác định trình tự gen khác; • liên quan đến q trình giải trình tự tồn DNA đa hệ gen cơng nghệ giải trình tự hệ Sàng lọc enzyme 19 Sàng lọc enzyme 20 Sanger sequencing • 96 trình tự lần chạy • 650 bp 10 4/2/2019 Next Generation Sequencing technologies-NGS • Cơng nghệ giải trình tự 454 hay pyrosequencing • Iron Torrent PGM • Cơng nghệ giải trình tự hệ Illumina Sàng lọc enzyme 21 Cơng nghệ giải trình tự 454 hay pyrosequencing Nguyên tắc: Mỗi lần nucleotide thêm vào một, pyrophosphate (PPi) đồng thời giải phóng từ phản ứng tổng hợp DNA, sau biến đổi thành tín hiệu ánh sáng Ánh sáng thoát từ hàng triệu vi giếng chứa đoạn DNA xác định hệ thống máy tính chuyển đổi thành trình tự nucletide Sàng lọc enzyme 22 11 4/2/2019 Sàng lọc enzyme 23 Sàng lọc enzyme 24 12 4/2/2019 Cơng nghệ giải trình tự 454 hay pyrosequencing Ưu: đọc hàng trăm, hàng nghìn trình tự lần chạy Nhược: - Đoạn đọc ngắn