4/2/2019 Enzyme cố định Vì sản xuất enzyme cố định (khơng tan) • Enzyme hòa tan dễ bị hoạt tính điều kiện pH, nhiệt độ, dung mơi khơng phù hợp • Chi phí sản xuất enzyme hòa tan cao, nhiều cơng đoạn • Khơng thể thu hồi enzyme hòa tan sau phản ứng xúc tác Enzyme cố đinh 4/2/2019 Định nghĩa • Enzyme cố định (hay enzyme không tan) enzyme định vị vật lý vào vài vùng xác định chất mang mà giữ hoạt tính sử dụng lặp lại nhiều lần • Hoặc nói “enzyme cố định enzyme có tham gia hoạt động không gian bị giới hạn” Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoạt enzyme cách gắn vào pha cách ly tách rời khỏi pha lỏng tự có khả tiếp xúc với phần tử chất, effector hay inhibitor (chất ức chế) Pha gắn enzyme thường khơng tan nước polyme ưa nước Enzyme cố đinh Ưu điểm enzyme cố định (không tan)  Sử dụng lặp lại nhiều lần  giảm giá thành Chế phẩm bền điều kiện pH, nhiệt độ, áp xuất thẩm thấu tối ưu, tốc độ phản ứng lớn  Sản phẩm phản ứng không lẫn lộn với enzyme không gây ảnh hưởng xấu đến màu sắc mùi vị sản phẩm Dễ tổ chức sản xuất mức độ tự động hố cao Có thể làm ngừng nhanh chóng phản ứng cần thiết cách tách enzyme khỏi chất Chế tạo enzyme tương đối dễ, đầu tư xây dựng sản xuất tương đối Có thể dễ dàng tổ chức sản xuất sản phẩm lên men enzyme ngoại bào như: rượu etylic, axit hữu cơ, axit amin, vitamin Enzyme cố đinh 4/2/2019 Nhược điểm enzyme cố định (không tan) Sự chuyển khối bị hạn chế Có thể hoạt tính sau cố định Khơng có hiệu cao chất rắn Mất tính thích nghi hình thể Enzyme cố đinh Ứng dụng enzyme cố định (khơng tan) • Tổng hợp hợp chất lượng chuyển đổi sinh học • Xử lý chọn lọc chất ô nhiễm để giảm thiểu nhiễm mơi trường • Phân tích liên tục hợp chất khác với tính đặc thù chọn lọc cao • Ứng dụng y dược tạo loại thuốc hay phận, quan nhân tạo Enzyme cố đinh 4/2/2019 Lịch sử 1916: Nelson Griffin - enyme invertase từ nấm men bị hấp phụ than hoạt tính có khả xúc tác thủy phân đường 1953: Grubhofer Schleith - cố định nhiều loại enzyme (carboxypeptidase, disastase, pepsin ribonuclease) lên nhựa diazotized polyaminostyrene liên kết cộng hóa trị 1956: Mitz - liên kết ion calalase chất mang DEAE-cellulose vào năm 1956 1964: Bernfeld Wan - bao gói trypsin, papain với glutaraldehyde 1971: Gregoriadis - cố định enzyme amyloglucosidase liposome ứng dụng liệu pháp trị bệnh Enzyme cố đinh Lịch sử • Năm 1969, Chibata cộng công ty Tanabe Seiyaky, Nhật Bản lần thành công việc ứng dụng enzyme cố định quy mơ cơng nghiệp • Enzyme aminoacylase (E.C 3.5.1.14) cố định DEAESephadex liên kết ion sử dụng để thủy phân N-acyl-D-amino acid để thu L-amino acid N-acyl-D-amino acid • Ứng dụng cố định tế bào vi khuẩn khác thực Chibata cộng năm 1973 hướng đến tổng hợp L-aspartate từ ammonium fumarate cách cố định tế bào vi khuẩn E coli có hoạt tính aspartase cao gel polyacrylamide Enzyme cố đinh 4/2/2019 Sự lựa chọn chất mang • Các nhóm chức đồng • Tính chất vật lý (đường kính, độ uốn dẻo, độ bền cơ, độ nén…) • Tính nước hay kỵ nước chất mang • Hình dạng kích cỡ • Gồm hai loại: vô hữu Enzyme cố đinh Chất mang vơ • thường hay sử dụng đặc tính học, độ bền nhiệt khả kháng vi sinh dung môi hữu tốt • Silica gel (Promaxon): • bề mặt gắn kích thước lỗ xác định, giá thành cao độ bền điều kiện kiềm • trơ mặt hóa học, nên cần hoạt hóa biến đổi hóa chất khác • Organopolysiloxanes cấu tạo nên hợp chất vô tổng hợp mang nhóm chức hữu cơ, có sẵn thị trường (Deoxan, Degussa AG) • tính kháng với biến đổi hóa học có sức chứa enzyme lớn • nhóm chức vơ cho phép liên kết cộng hóa trị với glutadialdehyde Enzyme cố đinh 10 4/2/2019 Chất mang hữu • Chất mang hữu tự nhiên: • rẻ tiền, sẵn có • Carbohydrate (alginate, carrageenan, chitin hay chitosan) quan tâm đặc biệt an tồn sinh học có tính nước cao • Chất mang hữu tổng hợp: • đa dạng cao đặc điểm lý hóa • thích nghi tốt với điều kiện quy trình sản xuất liên quan đến enzyme • trơ với cơng vsv, có sẵn thị trường dạng hạt hấp thụ tinh khiết Enzyme cố đinh 11 Chất mang hữu tự nhiên • Agarose: • Tính xốp agarose cao làm gia tăng lượng enzyme gắn • có đặc tính nước, dễ dàng biến đổi, khơng có nhóm tích điện có sẵn thị trường thương mại • Nhược điểm agarose giá thành cao • Sepharose tên thương mại agarose ứng dụng cố định liên kết cộng hóa trị • Cellulose: • rẻ tiền có sẵn thị trường • lực cố định enzyme cellulose thấp agarose • Nhược điểm: khơng phù hợp với ứng dụng áp lực cao, cellulose bị phân hủy cellulase từ vi sinh vật Enzyme cố đinh 12 4/2/2019 Chất mang hữu tổng hợp • Polystyren: • Sự gắn chủ yếu lực hấp thụ • Q trình gắn tính nước chất mang thường làm biến đổi cục enzyme, hoạt độ enzyme bị giảm • Polymer acrylic Eupergit C (Rohm, Darmstadt, Đức) Enzyme cố đinh 13 Eupergit C • độ bền hóa học học cao • tạo liên kết cộng hóa trị vơi nhóm amino enzyme thơng qua nhóm oxirane Enzyme cố đinh 14 4/2/2019 Nhóm chức enzyme • Phản ứng hóa học enzyme chủ yếu xảy nhóm chức thuộc gốc amino acid phân tử enzyme • nhóm alkyl: trơ mặt phản ứng hóa học • nhóm aliphatic hydroxyl gốc serine threonine: dẫn xuất nước, có phản ứng yếu đông đảo phân tử nước mơi trường xung quanh • Chín nhóm bên góp phần quan trọng phản ứng hóa học enzyme với phân tử khác: Guanidinyl (arginine), γ-carboxyl (glutamic acid), β-carboxyl (aspartic acid), sulfhyfryl (cysteine), imidazolyl (histidine), ε- amino (lysine), thioether (methionine), indolyl (tryptophan) phenolic hydroxyl (tyrosine) Enzyme cố đinh 15 Enzyme cố đinh 16 Nhóm alkyl 4/2/2019 Nhóm aliphatic hydroxyl Enzyme cố đinh Guanidinyl sulfhyfryl 17 β-carboxyl γ-carboxyl imidazolyl ε- amino Enzyme cố đinh 18 4/2/2019 thioether phenolic hydroxyl indolyl Enzyme cố đinh 19 Nhóm chức enzyme • Bản chất phản ứng enzyme phản ứng nhân: Nhóm sulfhydryl cysteine nhóm nhân mạnh (đặc biệt dạng thiolate, RS-) Nitrogen nhóm amino (yếu sulfhydryl): số lượng nhiều phân tử enzymemục tiêu quan trọng phản ứng • Các nhóm phản ứng khác biến đổi phản ứng hóa học đặc biệt để sử dụng cho mục đích cố định enzyme Chẳng hạn, chuyển đổi carboxylic acid thành amine để thu nhận nhóm phản ứng nhân tích điện bề mặt Enzyme cố đinh 20 10 4/2/2019 Để khắc phục nhược điểm cần:  Lựa chọn điều kiện pH, nhiệt độ điều kiện khác q trình trùng hợp cho ảnh hưởng đến hoạt động enzyme  Kích thước mắt lưới đủ bé để enzyme khó sử dụng, phải đủ lớn để chất bị khuếch tán vào kết hợp với enzyme  Sản phẩm tạo thành khuếch tán mắt lưới Enzyme cố đinh 45 Phương pháp kiểu mắt lưới Phương pháp kiểu mắt lưới (lattice) sử dụng rộng rãi kiểu cố định bao gói Việc đưa enzyme vào gel cách trùng hợp gel dung dịch enzyme có nồng độ cao nhờ tác dụng hóa chất gel polyacrylamide, polymer tự nhiên (alginate, k-carreageenan); nhờ xạ (gel polyvinyl alcohol, pyrrolidone); nhờ ánh sáng (polyethylenglycol dimetacrylate) Enzyme cố đinh 46 23 4/2/2019 Polyacrylamide • Nguyên tắc: Trong quy trình này, monomer acrylamide (22) N,N’-methylenebisacrylamide (23) trộn với dung dịch có chứa enzyme trùng hợp diễn diện chất khởi đầu (K2S2O8, potassium persulfate) chất kích thích (3đimethylaminopropionitrile) (DMAPN) hay N,N,N,N’tetramethylenediamine (TEMED) Enzyme cố đinh 47 Alginate • Alginate (acid alginic) acid polyuronic tách từ rong biển, bao gồm đơn vị cấu tạo acid D-mannuronic Lguluronic kết hợp với liên kết β-1,4 • Đây nguyên liệu tự nhiên tuyệt vời sử dụng rộng rãi để bao gói enzyme Enzyme cố đinh 48 24 4/2/2019 Alginate Nguyên tắc: Muối natri alginate (sodium alginate I) với khả hòa tan nước, hòa trộn với dung dịch enzyme Sau đó, thêm giọt dung dịch calcium chloride tạo thành gel calcium alginat khơng tan có chứa enzyme • Ưu điểm phương pháp: đơn giản, nguyên liệu an tồn, rẻ tiền, dễ kiếm • Nhược điểm: loại gel bị hòa tan dần diện tác nhân bao gói khác ion phosphate Enzyme cố đinh 49 κ-Carrageenan • κ-Carrageenan hỗn hợp polysaccharide tương tự agaragar chiết tách tảo đỏ, hòa tan nước dung dịch muối, có khoảng 4-5% carragenin, polysaccharide có chứa galactose galactose sulfate Enzyme cố đinh 50 25 4/2/2019 κ-Carrageenan Nguyên tắc: Khi thêm từ từ dung dịch chất tạo gel (như potasium chloride, cation khác ammonium, calcium, aluminum) vào dung dịch muối κ-Carrageenan có chứa enzyme, gel tạo thành bao gói enzyme thu nhận chế phẩm enzyme cố định Glutaraldehyde hexamethylenediamine có tác dụng làm gel cứng enzyme giữ gel bền Ứng dụng: cố định tế bào vi khuẩn sản xuất L-aspartate L-malate quy mô công nghiệp Enzyme cố đinh 51 Phương pháp tiền polyme Mục đích: bao gói Enzyme loại gel có đặc tính hóa lý kiểm sốt phát triển loại tiền polymer nhựa tổng hợp có nhiều ưu điểm  đơn giản, thực điều kiện êm dịu không chứa monomer nên không làm biến đổi hoạt tính enzyme Mạng lưới cấu trúc (kích thước mắt lưới) gel dễ dàng điều chỉnh theo u cầu Các tính chất hóa lý gel thay đổi Tiền polymer tạo liên kết ngang tác dụng ánh sáng (photo-cross- linkable resin prepolymer) có đặc tính nước gốc R hydro đặc tính kỵ nước gốc R CH3 Enzyme cố đinh 52 26 4/2/2019 Phương pháp tiền polyme • Nguyên tắc: Khi chiếu tia xạ UV có bước sóng dài vài phút vào hỗn hợp tiền polymer enzyme có mặt chất làm nhạy thích hợp (benzoinethylether), tạo thành liên kết chéo prepolymer, gel hình thành, nhốt enyme lỗ gel • Phương pháp áp dụng cho quy mô thử nghiệm tổng hợp ethanol hệ nấm men cố định Enzyme cố đinh 53 Phương pháp tiền polyme • Ví dụ, bao gói tiền polymer urethane (28) với tính kỵ nước, nước chiều dài chuỗi khác • Khi tiền polymer dạng lỏng trộn với dung dịch enzyme, tiền polymer phản ứng với để hình thành liên kết urea giải phóng CO2 Enzyme cố đinh 54 27 4/2/2019 Cố định enzyme bề mặt tế bào vi sinh vật Protein enzyme gắn lên bề mặt tế bào vi sinh vật cách lai chúng với đoạn gắn (móc neo, anchoring motif) nhiều phương thức khác Enzyme cố đinh 55 Đặc điểm đoạn móc neo (đoạn gắn) • có tín hiệu tiết hay tín hiệu vận chuyển hiệu cho phép protein trưởng thành (mature protein) vượt qua lớp màng trong; • có cấu trúc bền, để trì gắn protein lai bề mặt tế bào; • “hợp tác” tương thích với protein đích (đoạn móc neo gắn bền vững với protein đích); (3) kháng với công protease diện chu chất hay ngồi mơi trường Enzyme cố đinh 56 28 4/2/2019 Đặc điểm đoạn móc neo (đoạn gắn) • Vị trí đoạn móc neo để cố định protein đóng vai trò quan trọng lẽ ảnh hưởng đến hiệu cố định, độ bền, hoạt độ riêng (specific activity) trình điều hòa sau dịch mã protein đích • Cần thiết phải xác định dự đoán vùng đoạn móc neo biểu ngồi tế bào Enzyme cố đinh 57 Đặc điểm protein đích Ảnh hưởng lớn đến trình vận chuyển cố định lên bề mặt tế bào Các protein đích khác lai với đoạn móc neo vận chuyển đến vị trí khác vật chủ biểu - Cấu trúc gập protein (hình thành cầu disulfide) vị trí màng ngồi khoang chu chất - Các gốc tích điện ảnh hưởng khơng tốt đến q trình tiết protein đích cần phải xóa gốc để tăng hiệu tiết Tuy nhiên, cần ý thay đổi amino acid chuỗi protein làm thay đổi chức protein - Kích thước nguồn gốc protein đích Enzyme cố đinh 58 29 4/2/2019 Đặc điểm vật chủ biểu • phù hợp với protein đích dễ dàng ni cấy mà không bị phân hủy điều kiện môi trường xung quanh • phải có hoạt tính protease ngoại bào thành tế bào thấp Enzyme cố đinh 59 Đặc điểm vật chủ biểu • Vi khuẩn Gram âm (E coli): thành tế bào mỏng nghiên cứu rộng rãi • Vi khuẩn Gram dương: thành tế bào cứng, nghiên cứu phát triển thành hệ thống xúc tác tồn tế bào • Nấm men: phù hợp với protein đích có nguồn gốc từ động vật Enzyme cố đinh 60 30 4/2/2019 Cơ chế cố định protein bề mặt vi khuẩn Lactobacillus plantarum • Bằng liên kết cộng hóa trị: • Sử dụng đoạn gắn lipoprotein • Sử dụng đoạn bảo thủ LPTG • Bằng liên kết khơng cộng hóa trị: • Sử dụng đoạn gắn chuyển màng đầu N: • Sử dụng đoạn gắn lên thành tế bào không qua liên kết cộng hóa trị Enzyme cố đinh Móc neo chuyển màng đầu N Móc neo lipoprotein Móc neo chứa vùng LysM 61 Móc neo peptidoglycan chứa LPxTG Thành tế bào Enzyme cố đinh 62 31 4/2/2019 Sử dụng đoạn gắn lipoprotein Cơ chế gắn lipoprotein dựa vào đoạn motif lipobox nằm đầu C vùng tín hiệu tiết Sau protein tiết theo đường Sec, enzyme diacylglycerol transferase nối cystein bảo thủ hộp lipobox với phospholipid màng tế bào liên kết cộng hóa trị, đồng thời tín hiệu tiết loại bỏ nhờ enzyme lipobox-specific peptidase (enzyme đặc thù nhận biết trình tự cắt vùng lipobox) Enzyme cố đinh 63 Sử dụng đoạn gắn lipoprotein • Trong Lb plantarum, hai đoạn gắn loại lipoprotein, Lp_1261 (76 amino acid) Lp_1452 (142 amino acid), sử dụng để cố định đoạn có kích thước khác kháng ngun Inv, phân lập từ chủng gây độc cho người Yersinia pseudotuberculosis Cả hai đoạn gắn cố định thành công tế bào có kích thích đáp ứng miễn dịch tốt • Nguyễn Hồng Minh cộng sử dụng đoạn gắn Lp_1261 để thử khả cố định hai loại enzyme khác mannanase chitosanase khác lên bề mặt tế bào L plantarum WCFS1 Cả hai enzyme có KLPT khác nên cho kết cố định khác Enzyme cố đinh 64 32 4/2/2019 Sử dụng đoạn gắn lên thành tế bào nhờ đoạn bảo thủ LPTG Cơ chế: protein tiết mang đoạn gắn đầu C chứa vùng bảo thủ LPTG (LPQTE Lb plantarum), theo sau vùng kỵ nước vùng tích điện dương Vùng kỵ nước vùng tích điện dương giữ cho protein khơng bị giải phóng khỏi mơi trường, cho phép enzyme sortase vùng chuyển màng nhận biết vùng bảo thủ LPTG Enzyme sortase cắt liên kết peptide threonine glycine vùng bảo thủ nối threonine với peptidoglycan màng Enzyme cố đinh 65 Sử dụng đoạn gắn lên màng tế bào nhờ đoạn bảo thủ LPTG • Phản ứng nối đặc thù sử dụng nhiều công nghệ ứng dụng đánh dấu protein bề mặt tế bào sống, sản xuất vaccine sống, hay sản xuất hệ xúc tác toàn tế bào • Gần đây, đoạn gắn thành tế bào (cell wall anchor 2-cwa2) từ Lb plantarum WCFS1 sử dụng để cố định hai enzyme mannanase chitosanse Cả hai enzyme xác định diện thành công bề mặt có khả phân giải chất tốt So với enzyme tự do, enzyme cố định có hoạt tính thấp khoảng lần Kết mở nhiều hội để ứng dụng công nghệ nhiều lĩnh vưc Enzyme cố đinh 66 33 4/2/2019 Sử dụng đoạn gắn chuyển màng đầu N Cơ chế: Sự tiết phân tử protein mơi trường bên ngồi qua hệ thống tiết Sec phụ thuộc vào hoạt động enzyme tiết (signal peptidase) Enzyme nhận biết trình tự đặc thù cắt tín hiệu tiết, đồng thời giải phóng protein trưởng thành ngồi mơi trường Nhưng lý đó, vùng tín hiệu tiết bị thiếu trình tự cắt enzyme peptidase, sự gắn khơng cộng hóa trị protein vào vỏ tế bào Trong hoàn cảnh này, đoạn tín hiệu tiết khơng cắt bỏ đóng vai trò đoạn gắn kỵ nước cố định phân tử protein lên màng tế bào vị trí đầu N Nhờ vào chế này, enzyme quan tâm lai với đoạn gắn hệ thống vectơ phù hợp với vật chủ Enzyme cố đinh 67 Sử dụng đoạn gắn lên thành tế bào không qua liên kết cộng hóa trị • Q trình gắn khơng qua liên kết cộng hóa trị thực đoạn gắn khác protein lớp bề mặt (Surface-layer proteinSLP), đoạn bảo thủ LysM hay WxL • Các protein lớp bề mặt (SLP) mạng lưới tinh thể protein hay glycoprotein có KLPT từ 40-200 kDa, gồm vùng chức chính: vùng tự xếp vùng gắn vào thành tế bào qua liên kết không cộng hóa trị Các vùng chức SLP nghiên cứu rộng rãi, chẳng hạn SA of Lb acidophilus ATCC 4356, SlpA of Lb brevis ATCC 8287 , CbsA of Lb crispatus JCM 5810 Enzyme cố đinh 68 34 4/2/2019 Những điều cần lưu ý thực việc cố định enzyme • Enzyme phải ổn định điều kiện xảy phản ứng • Trung tâm hoạt động enzyme phải luôn bảo vệ • Khi rửa thiết bị phản ứng để phục hồi enzyme, không làm ảnh hưởng xấu đến hoạt tính enzyme gắn vào chất mang • Khi lựa chọn chất mang (hệ cố định)  không làm ảnh hưởng chí huỷ hoại thân chất mang sản phẩm phản ứng không ức chế hoạt động enzyme Enzyme cố đinh 69 Ảnh hưởng cố định đến hoạt tính enzyme • Hoạt tính enzyme cố định phụ thuộc vào chất chất mang • “hiệu ứng phân phối” (hay “hiệu ứng đẩy – kéo”) • “hiệu ứng ngăn chặn” • Hoạt tính enzyme cố định phụ thuộc vào khuếch tán chất, sản phẩm phân tử khác • Tốc độ khuếch tán chất, sản phẩm phụ thuộc vào yếu tố: kích thước lỗ gel chất mang polyme; trọng lượng phân tử chất; sai khác “hiệu ứng phân phối” Enzyme cố đinh 70 35 4/2/2019 Phân tích chế phẩm enzyme cố định • Để đánh giá chất lượng chế phẩm enzyme cố định, cần thiết phải xác định hoạt độ chế phẩm dùng phương pháp quang học • Lượng enzyme cố định chất mang xác định gián tiếp hiệu số nồng độ protein dịch enzyme trước cố định nồng độ protein dịch sau cố định (phần không chứa enzyme cố định) • Hiệu suất cố định (immobilization yield) tỉ lệ hoạt tính enzyme cố định tổng hoạt tính enzyme tự trước cố định Enzyme cố đinh 71 Các reactor chứa enzyme cố định • Reactor (cột phản ứng) chứa enzyme sử dụng để tạo tiếp xúc enzyme chất khoảng thời gian đủ lớn để tiến hành phản ứng xúc tác, đồng thời tách sản phẩm phản ứng - để lại enzyme • Reactor hoạt động theo chu kỳ • Reactor hoạt động theo kiểu dòng chảy • nhóm có khuấy trộn • nhóm khơng khuấy trộn Enzyme cố đinh 72 36 4/2/2019 Enzyme cố đinh 73 37 ...4/2/2019 Định nghĩa • Enzyme cố định (hay enzyme khơng tan) enzyme định vị vật lý vào vài vùng xác định chất mang mà giữ hoạt tính sử dụng lặp lại nhiều lần • Hoặc nói enzyme cố định enzyme có... dụng Enzyme cố định dễ dàng tiếp xúc với chất enzyme gắn bề mặt chất mang Tính bền nhiệt tăng liên kết bền enzyme chất mang Enzyme cố đinh 30 15 4/2/2019 Ưu nhược điểm phương pháp cố định enzyme. .. Lượng enzyme cố định thường thấp so với phương pháp khác • Hoạt tính enzyme giảm biến đổi cấu trúc hình thể enzyme trình cố định tiếp xúc hạn chế chất trung tâm hoạt động enzyme Enzyme cố đinh