Chương 5: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Chuẩn bị mẫu • Thu mẫu ngẫu nhiên, nhiều vị trí để có tính đại diện • Mẫu chứa bình nhựa hay bao nilon • Bảo quản lạnh q trình vận chuyển • Bảo quản -200C phân tích 040C vòng 36h • Giải đông 2-50C 18h 450C 15 phút • Đồng mẫu trước phân tích • Phương pháp MPN (most probable number): phương pháp định lượng theo số lượng VSV có xác xuất cao dựa vào kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha loãng khác Các loại mơi trường ni cấy VSV • - Về chất thành phần môi trường: Môi trường tự nhiên Môi trường tổng hợp Môi trường bán tổng hợp Mt tổng hợp bán tổng hợp dạng đông khô thương phẩm hãng MERCK, OXOID,DIFCO, BBL, HIGH-MEDIA • - Về tính chất vật lý: Mơi trường lỏng Môi trường rắn Môi trường bán rắn (xốp) • - Về công dụng: Môi trường tiền tăng sinh Môi trường tăng sinh Môi trường chọn lọc Môi trường thử nghiệm sinh hóa QUI TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ • Chỉ thị mức độ vệ sinh thực phẩm, đánh giá chất lượng mẫu VSV, nguy hư hỏng, thời hạn bảo quản sản phẩm • Xác định phương pháp đếm khuẩn lạc • Biểu diễn đơn vị CFU/g hay CFU/ml Mẫu Dung dịch nước muối pepton Lắc đều, phút Đồng mẫu Pha loãng thành dãy nồng độ thập phân Chọn nồng độ pha lỗng thích hợp, chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vô trùng ( nồng độ đĩa) Cấy mẫu pp hộp đổvới 10-15ml mt Plate Count Agar Ủ 300C, 72h Đếm khuẩn lạc QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ Cách tính kết • Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 • Mật độ VK 1g hay 1ml mẫu: A= N n1Vf1 + …+ niVfi A: số tế bào VK 1g hay 1ml mẫu N: số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni: số lượng đĩa cấy độ pha lỗng thứ I V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa fi: độ pha loãng tương ứng • Mt nước muối pepton (SPW) - 8,5g NaCl - 1g pepton - Nước cất cho đủ 100ml Qui trình định tính nấm mốc Đống mẫu SDB thành độ pha loãng 10-1, ủ 300C, 1-7 ngày Cấy canh trường có nấm mốc mọc lên đĩa SDA, MEA hay PDA, ủ 300C ngày Kết luận có hay khơng có nấm mốc • - Mt SDB (Sabouraud’s Dexrotrose Broth) Polypepton: 10g Dextrose: 40g Nước cất: lít • - Mt PDA (Potato Dextrose Agar) Khoai tây: 200g Dextrose: 20g Agar: 15-20g Nước cất: lít • - Mt MEA (Malt Extract Agar) Cao malt: 30g Agar: 15-20g Nước cất: lít Qui trình định lượng tống số nấm men nấm mốc Đồng pha loãng mẫu thành độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC DG18, ủ ngửa đĩa 250C, 5-7 ngày Đếm khuẩn lạc nấm men, nấm mốc, tính mật độ (CFU/g) Cấy lên ống thạch nghiêng SDA, ủ 300C, ngày Định danh • - Mt DG 18 (Dichloran 18% glycerol) Glucose: 10g Pepton: 5g KH2PO4: 1g MgSO4: 0,5g Dichloran (0,2% etanol): 1ml Glycerol: 220 ml Agar: 15g Choramphenicol: 0,1g Nước cất: lít Các phương pháp đại • • • • Phương pháp phát quang ATP Phương pháp ELISA Phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR Phương pháp phát quang sinh học ATP giám sát vệ sinh • ATP dấu hiệu nhận biết tồn vật chất sống • Có thể phát nhanh ATP lượng ánh sáng phát ATP kết hợp với enzym luciferase E + LH2 + ATP + O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + PPi (E: Luciferase, LH2:luciferin) • Oxyluciferin phát ánh sáng vàng xanh ghi nhận trị số ánh sáng phát máy đo ánh sáng • ATP eukaryote tách chiết chất tẩy không ion Triton X-100 ATP tách trước bị thủy phân ATPase bổ sung vào Sau trích ly ATP từ VSV trichloacetic acid 5% Quệt bề mặt kiểm tra Thực phản ứng Đọc kết máy đo sáng Qui trình phát VSV bề mặt dụng cụ Clean-Track Phương pháp ELISA (Enzyme- Linked ImunoSorbent Assay) • Phương pháp miễn dịch phản ứng kết hợp tế bào (kháng nguyên) với kháng thể đặc hiệu • Tín hiệu phản ứng miễn dịch nhận biết thông qua ngưng tủa hay kết dính kháng nguyên- kháng thể cách sử dụng kháng thể đánh dấu chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym) Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzym (ELISA) sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngồi đĩa giếng Khi có kháng nguyên mục tiêu mẫu, gắn kết với kháng thể có giếng Sau phức hợp phát cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn enzym horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase Khi bổ sung chất đặc hiệu enzym vào giếng, enzym xúc tác phản ứng thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Từ định lượng kháng nguyên Phương pháp lai phân tử • Dựa phản ứng bắt cặp mẫu dò (oligonucleotit) với DNA/RNA mục tiêu mẫu Mẫu dò ln đánh dấu chất phát huỳnh quang để nhận biết có phản ứng bắt cặp xảy • Trình tự: - Phá vỡ tế bào thu nhận DNA RNA - Mẫu dò có gắn oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) mẫu dò phát chứa fluorescein isothiocyanate (F) đầu 5’ 3’ phân tử đặt vào phản ứng - Que thử bao bọc với polydeoxythymidine (dT) để gắn với oligodA mẫu dò - Que thử đặt vào ống đo chứa mẫu dò phát đánh dấu enzym - Sau rửa loại phần enzym thừa, que thử đặt vào ống đo chứa chất tạo màu - Sau ủ để màu, màu phát bước sóng 450nm Phương pháp PCR • Khuyếch đại trình tự DNA nhờ mồi chuyên biệt nhận biết sản phẩm khuyếch đại điện di sau nhuộm với ethidium bromide ... thử nghiệm sinh hóa QUI TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ • Chỉ thị mức độ vệ sinh thực phẩm, đánh giá chất lượng mẫu VSV, nguy hư hỏng, thời hạn bảo quản sản phẩm. .. trước phân tích • Phương pháp MPN (most probable number): phương pháp định lượng theo số lượng VSV có xác xuất cao dựa vào kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha loãng khác Các loại mơi trường... Đếm số ống canh (+) (sinh hơi), tính mật độ Coliforms Chọn ống canh (+)( sinh hơi) Thử nghiệm Indol Thử nghiệm IMViC Đếm số ống canh EC(+) Indol (+) Đếm số ống canh EC(+) IMViC (++ ), tra bảng