1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Thalasemia gây thiếu máu tan máu bệnh thường gặp trẻ em Việt Nam bệnh đơn gen phổ biến giới Bệnh có hai biểu bật thiếu máu ứ sắt thể Trẻ bị bệnh Thalasemia thường chậm phát triển thể chất, chưa có phương pháp điều trị khỏi bệnh, chủ yếu điều trị triệu chứng suốt đời, tạo gánh nặng cho gia đình, xã hội Tại Việt Nam, tỷ lệ người mang gen bệnh phân bố nước khác tùy địa phương, nhóm dân tộc Đặc biệt, tỷ lệ mang gen bệnh cao dân tộc người như: Mơng (25%), Catu (14%), Tày (11%), Pako (8.33%) [5] Theo thống kê, nước quản lý khoảng 20.000 bệnh nhân, trung bình năm có khoảng 2.000 trẻ sinh bị bệnh Tổ chức y tế giới WHO xác định Thalasemia vấn đề sức khỏe ngiêm trọng khuyến cáo nước Đông Nam Á nên chọn Thalasemia ưu tiên di truyền người β-Thalasemia đột biến gen β-globin, nằm cánh ngắn NST 11, gây giảm tổng hợp chuỗi globin-β Cho đến nay, có khoảng 200 đột biến tìm thấy gen β-globin [9] Ở người Việt Nam, theo nghiên cứu M.L Saovaros Svasti cộng năm 2002 cho thấy có đột biến gây 95% trường hợp β-Thalasemia Dựa vào biểu lâm sàng, bệnh β-Thalasemia chia làm thể chính: Thể nhẹ, thể trung gian, thể nặng Bệnh nhân thể nặng hay gọi thể Cooley, đồng hợp tử dị hợp tử kép hai đột biến khác bị thiếu máu nặng, có chất lượng sống thấp Bệnh nhân thể nhẹ dị hợp tử với đột biến gen β-globin thường khơng có biểu lâm sàng, thể phát triển bình thường, có thiếu máu nhược sắc công thức máu Những người kết truyền gen bệnh cho cái, nguồn phát tán gen bệnh chủ yếu cộng đồng Bệnh chưa có phương pháp điều trị triệt để, liệu pháp gen ghép tế bào nguồn có bước đầu thành cơng nhiên cách tốn lúc thực Bệnh β-Thalasemia chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm sàng xét nghiệm huyết học Các xét nghiệm di truyền phân tử xác định đột biến gen β-globin điều kiện cần thiết để khẳng định rõ thể bệnh, thực chẩn đoán trước sinh bệnh β-Thalasemia, góp phần lớn cơng tác tư vấn tiền hôn nhân bệnh di truyền Các kỹ thuật xác định đột biến gen Realtime PCR, Multiplex PCR, ARMS-PCR, giải trình tự gen…đang bước áp dụng chẩn đoán bệnh, nhiên chưa phổ biến triển khai rộng rãi Việc phát người lành mang gen bệnh để tư vấn tiền nhân, chẩn đốn trước sinh nhằm hạn chế thai nhi bị bệnh biện pháp thiết yếu hữu hiệu nhằm giảm tỷ lệ mắc bệnh cộng đồng.Tuy nhiên Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu tồn diện người lành mang gen bệnh β-Thalasemia Căn từ thực tế trên, với nghiên cứu Phạm Thanh Loan phát đột biến gen gây bệnh β-Thalasemia kĩ thuật Multiplex ARMS-PCR, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bước đầu phát người lành mang gen bệnh β-Thalasmia thành viên gia đình bệnh nhân” với mục tiêu: Khảo sát người lành mang gen β-globin dị hợp tử thành viên gia đình bệnh nhân β-Thalassmia CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH β-THALASEMIA 1.1.1 Những đặc điểm chung 1.1.1.1 Lịch sử nghiên cứu β-Thalasemia phát tương đối sớm, từ năm 1910 Jame Henrick năm 1925 Lee Cooley, người bệnh phát có nguồn gốc Hy Lạp Italia Năm1936, Whippe Bradford phát nhiều bệnh nhân thiếu máu vùng Địa Trung Hải giống thiếu máu Cooley gọi Thalasemia (Tiếng Hy Lạp “thiếu máu vùng biển”) [4] Những cơng trình nghiên cứu sau thấy có biến đổi đặc biệt hồng cầu Theo Aksoy cộng sự, hemoglobin trung bình hồng cầu 18-22 pg, thể tích hồng cầu trung bình 55-81fl (femtoliter) Modell cộng thấy hemoglobin trung bình hồng cầu bệnh  -Thalasemia 15-26 pg thể tích hồng cầu trung bình 57-75fl Các tác giả thống hồng cầu nhược sắc thể tích hồng cầu trung bình nhỏ thiếu hụt tổng hợp mạch  ảnh hưởng đến tổng hợp hemoglobin, hồng cầu chứa hemoglobin Do vậy, áp lực keo bên hồng cầu giảm, lượng dịch bên hồng cầu [28] Theo Astaldi cộng (năm 1992) tượng bật bệnh  -Thalasemia tăng sinh hồng cầu không hiệu [29] Ở người bị bệnh  -Thalasemia thể nặng (dạng đồng hợp tử) lượng HbF tăng cao 10-90% so với Hb toàn phần (Viechio Singer, 1948), coi dấu hiệu có ý nghĩa chẩn đốn; đồng thời có lượng mạch  tự do, lượng HbA1 40-70% so với Hb toàn phần (Fessas Loukopoulos, 1964) [28] 1.1.1.2 Định nghĩa Thalasemia dạng bệnh hemoglobin (Hb) chuỗi αglobin giảm khơng tạo thành gọi bệnh α-Thalasemia, chuỗi β- globin giảm không tạo thành gọi bệnh β-Thalasemia Bệnh  -Thalasemia bệnh di truyền đơn gen hay gặp Ở Việt Nam, theo Nguyễn Công Khanh, bệnh β- Thalasemia nguyên nhân hàng đầu gây thiếu máu, tan máu nặng trẻ em [3] 1.1.1.3 Tình hình mắc bệnh β-Thalasemia loại bệnh di truyền, phân bố bệnh tần số có liên quan chặt chẽ đến nguồn gốc dân tộc, di cư tập quán kết hôn Bệnh phát nhiều nước giới, chủ yếu vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Cận Đông, Viễn Đông, Bắc Phi, Đông Nam Á [31] Theo ước tính WHO (1981), có tới 241 triệu người mang gen bệnh β-Thalasemia giới, riêng châu Á có khoảng 60 triệu người mang gen bệnh β-Thalasemia, Châu Âu 4800 người, Bắc Phi khoảng 2577 người [6] Cũng theo WHO (2008) hàng năm số trẻ đẻ bị Thalasemia thể nặng ước tính vào khoảng 300.000 người [4] Ở Việt nam, cơng trình nghiên cứu thống bệnh Hb phát thấy α-Thalasemia, β-Thalasemia HbE Bệnh βThalasemia phát thấy tất tỉnh nước,gặp nhiều người dân tộc người miền Bắc, người Mường 25%, người Thái 16,6%, người Nùng 7,1% [2] Một nghiên cứu gần Nguyễn Thanh Liêm cộng (2009) khảo sát bệnh Thalasemia nhóm người dân tộc Mường huyện Kim Bơi tỉnh Hịa Bình cho thấy bệnh β-Thalasemia phổ biến dân tộc Mường, Kim Bơi, Ḥịa Bình với tần suất 10,67% Từ năm 1963 dến 1982, Bạch Quốc Tuyên cộng nghiên cứu 415 bệnh nhân bị bệnh Hb bệnh viện Bạch Mai cho thấy bệnh Hb phổ biến Việt Nam, phân bố khắp địa phương nước, hai bệnh phổ biến  -Thallasemia HbE,  -Thallasemia chiếm 91,8% trường hợp bệnh Hemoglobin [45] 1.1.2 Sinh lý hemoglobin 1.1.2.1 Hemoglobin bình thường Hemoglobin cấu trúc nằm hồng cầu, chất phân tử protein có sắc tố hem làm cho hồng cầu có màu đỏ Hb có khả kết hợp phân ly với oxy (O2) carbonic (CO2), có vai trị quan trọng việc vận chuyển oxy đến tổ chức đồng thời vận chuyển sản phẩm chuyển hóa tổ chức (H+ CO2) đến thận phổi để đào thải Ngồi hemoglobin cịn có chức enzym hệ thống đệm [7] Cấu trúc phân tử Hb gồm thành phần: Phần Globin phần Hem Phần hem: Hem cấu tạo nhân protoporphyrin ion sắt hóa trị (Fe2+) Mỗi nhóm Hem có chứa ion sắt tích điện dương (Fe 2+) liên kết thuận nghịch với phân tử O2 Khi có mặt Fe2+, cấu trúc hình thái Hb thay đổi để thích hợp với việc liên kết vận chuyển O đến khu vực khác thể [7] Phần globin: Globin có chất protein Ở người, globin cấu tạo bốn chuỗi polypeptid, giống đơi Hình 1.1: Mơ hình cấu trúc phân tử hemoglobin người trưởng thành [8] Mỗi chuỗi polypeptid gắn với Hem Vì phân tử Hb có hai chuỗi kép polypeptid bốn Hem có khả vận chuyển bốn phân tử O2 [9] Chuỗi globin gồm acid amin, chuỗi globin khác số lượng acid amin khác trật tự acid amin khác Trong trình phát triển thể, loại chuỗi polypeptid có chuyển đổi, loại thay loại tạo nên loại Hb khác Các loại chuỗi polypeptid ký hiệu chữ Hy Lạp (ε, ζ,  ,  ,  , ) Chuỗi alpha (α): 141 acid amin, gen α-globin nằm cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 quy định tổng hợp Chuỗi beta (α), delta (δ), gamma (γ): 146 acid amin, cụm gen quy định tổng hợp chuỗi nằm cánh ngắn NST 11 1.1.2.2 Các loại Hemoglobin sinh lý Ở người, có loại Hb bình thường xuất thời kỳ phơi thai, thai nhi, trẻ em người lớn (bảng 1.1) Thời gian xuất thành phần loại Hb thay đổi tùy thời kỳ phát triển thể [10], [11] (hình 1.2) - Hemoglobin phơi: Có loại, Hb Porland, Hb Gower 1, Hb Gower 2, tạo tổ hợp hai số chuỗi ζ, chuỗi , chuỗi ε, chuỗi  - Hemoglobin thai nhi: Chủ yếu HbF, tổng hợp suốt đời sống bào thai giảm dần sau sinh, gồm chuỗi α chuỗi  (α2γ2) - Sau sinh loại hemoglobin: HbA1, HbA2 HbF , HbA1 chủ yếu, gồm chuỗi α, chuỗi β; HbA gồm chuỗi α, chuỗi δ có Thành phần loại hemoglobin có tỷ lệ giới hạn định theo lứa tuổi, thay đổi tỷ lệ trở thành bệnh lý: Khi sinh: HbF có tỷ lệ cao, chiếm 60-80% lượng Hb HbA1 (α 2β2) có 20 - 40% HbA2 (α2δ2) 0,03 - 0,6% Nhưng sau thời kỳ sơ sinh: Lượng HbF giảm nhanh: từ lúc tuổi đến trưởng thành HbF 2% HbA1 tăng nhanh Hb chủ yếu người trưởng thành, chiếm 97 - 98% lượng Hb HbA2 tăng dần sau sinh, lượng ít, từ - 3% lượng Hb Hình 1.2: Các loại hemoglobin người [12] Giai đoạn trước sinh có loại chuỗi globin: ξ, ε, γ, α, β, δ Các chuỗi ξ ε xuất tuần đầu phôi; Hb Porland tồn 2-3 tuần đầu (2 chuỗiξ, chuỗi γ) ; Hb Gower (2 chuỗi ξ, chuỗi ε) Hb Gower (2 chuỗi α, chuỗi ε) xuất hiện, tồn từ 2-3 tuần đầu đến hết tháng; thời kì bào thai, chuỗi α γ chiếm ưu thế, kết hợp với tạo nên HbF Các chuỗi α, β, γ tồn suốt thời kì bào thai sau sinh Sau sinh chuỗi γ giảm nhanh sau cịn ít; chuỗi α β chiếm ưu thế, kết hợp với tạo nên HbA Hb chủ yếu người bình thường Chuỗi δ xuất từ sau sinh kết hợp với chuỗi α tạo HbA2 chiếm tỷ lệ nhỏ Trước sinh, quan tạo máu túi nỗn (thời kì phơi), gan lách (thời kì thai); sau sinh tủy xương Bảng 1.1: Các chuỗi hemoglobin theo lứa tuổi [3] Hb sinh lý Cấu trúc Thời kỳ xuất Hb Porland globin 22 Phôi thai 2-3 tuần Hb Gower1 22 Thai 2-3 tuần, có tháng đầu thai HbGower 22 Xuất có Hb Gower1 HbF 22 Bào thai tuần, Hb chủ yếu thai nhi HbA2 22 Thai nhi gần đẻ, Hb người bình thường HbA1 22 Bào thai tuần, Hb chủ yếu người bình thường 1.1.3 Sinh lý bệnh Hb Thành phần Hb người bình thường HbA 95- 96% có nhiệm vụ chuyên chở oxy cho mô HbA kết nối chuỗi α β dựa vào lực hút tĩnh điện: Chuỗi α điện tích dương, chuỗi β điện tích âm Điện tích âm chuỗi β mạnh chuỗi globin δ chuỗi γ nên người bình thường có kết nối α-β ưu kết nối α với δvà γ Trong bệnh Thalasemia có tượng chung thiếu hụt loại chuỗi polypeptid phần Globin, gây thừa tương đối tuyệt đối loại chuỗi Nếu thiếu hụt chuỗi β gọi bệnh β-Thalasemia, chuỗi β giảm chuỗi α nối với β bị giảm chuỗi α dư tăng nối với chuỗi δvà chuỗi γ Còn thiếu hụt chuỗi α gọi bệnh α-Thalasemia, chuỗi α-globin giảm, β-globin tăng nối với globin lại tượng xảy mức độ khác phụ thuộc vào thể bệnh, song hậu q trình: Giảm tổng hợp Hb thiếu phần Globin Mất cân chuỗi α β * Hiện tượng thứ nhất: Giảm tổng hợp Hb Quá trình bệnh lý thứ hậu trực tiếp việc thiếu hụt tổng hợp phần globin Vì thiếu loại chuỗi polypeptid mà việc tổng hợp globin bị giảm Biểu việc giảm tổng hợp Hb hồng cầu nhược sắc tăng sinh hồng cầu non tủy * Hiện tượng thứ hai: Mất cân hai loại chuỗi globin Hiện tượng hậu thứ hai việc thiếu hụt loại chuỗi globin Việc thiếu hụt loại chuỗi globin gây dư thừa tương đối loại kia.Trong β-Thalasemia thiếu chuỗi β gây dư chuỗi α Trong αThalasemia thiếu chuỗi α gây dư chuỗi β, , Trong bệnh β-Thalasemia chuỗi α dư tạo thành hạt tủa xuống màng nguyên sinh chất HC trưởng thành, HC non tủy Chúng làm màng HC độ mềm dẻo, HC trở thành tế bào cứng đờ nên khó vượt qua màng lọc lách Mặt khác chúng cịn gây tăng diện tích tiếp xúc màng, dễ bị tác nhân oxy hóa phá hủy, gây kali tế bào làm cho HC bị vỡ sớm gây nên tượng tan máu Còn tủy xương, hạt tủa gắn lên nguyên sinh chất, màng HC non làm chúng bị chết trước trưởng thành làm tăng sinh mạnh HC non tủy, gây nên biến dạng xương, tăng hấp thu sắt gây nhiễm sắt cho thể Hiện tượng HC non bị chết sớm không đến giai đoạn trưởng thành gọi tượng sinh HC không hiệu chế chủ yếu gây biến đổi lâm sàng huyết học bệnh nhi βThalasemia thể nặng 10 Hình 1.3: Cơ chế bệnh sinh bệnh β-Thalasemia 1.1.4 Hậu bệnh Thalasemia * Thiếu máu mạn nặng: Do đời sống hồng cầu bị giảm, thay đổi hình dang, chất lượng Tủy xương tăng tổng hợp hồng cầu non bị bù, * Tăng sản tủy xương: Thiếu oxy mô gây tăng sản xuất erythropoietin, tủy tăng hoạt động để tạo hồng cầu non nên bị rộng ra, vỏ xương mỏng gây biến dạng hộp sọ tạo u trán, u chẩm, xương chi mỏng dễ gãy, dễ sâu * Quá tải sắt: Khi tải sắt, độ bão hòa sắt cao 50%, dễ dàng bị thay đổi trạng thái từ sắt III sang sắt II sinh ion hình thành gốc tự do, làm tế bào chết hình thành tổ chức sợi Các tổ chức bị tổn thương tải sắt là: 34 KẾ HOẠCH TIẾN HÀNH Nội dung công việc Thu thập tài liệu Hồn thành thơng qua đề cương Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất Thu thập số liệu Làm phân tích xử lý số liệu sơ Phân tích số liệu viết luận văn Làm Slide tập báo cáo thử Báo cáo luận văn thức 10/2013 11-12/2013 1-2/2014 3-5/2014 6-7/2014 8/2014 9/2014 10/2014 35 DỰ TRÙ KINH PHÍ Kinh phí thực đề tài từ đề tài cấp PGS.TS NGUYỄN ĐỨC HINH làm chủ nhiệm trường Đại học Y Hà Nội làm chủ trì 36 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU Các đối tượng tham gia nghiên cứu cung cấp đầy đủ thông tin nghiên cứu, cụ thể là: Giới thiệu người nghiên cứu: BS Lê Thị Thu Hương Quy trình thực nghiên cứu: Nếu bệnh nhân hay người nhà bệnh nhân định tham gia vào nghiên cứu thực số cơng việc sau đây: - Bệnh nhân thăm khám lâm sàng, làm xét nghiệm cần thiết để chẩn đoán xác định bệnh β-Thalasemia - Bệnh nhân người nhà bệnh nhân đề nghị lấy khoảng ml máu để xác định đột biến chẩn đoán người mang gen Những rủi ro xảy đối tượng tham gia nghiên cứu: xảy Những lợi ích đối tượng tham gia nghiên cứu: - Bệnh nhân trả tiền thăm khám lâm sàng để phát xem có bị bệnh β-Thalasemia hay không - Bệnh nhân người nhà bệnh nhân thông báo thông tin liên quan đến tình trạng sức khoẻ Trả cơng cho đối tượng tham gia nghiên cứu: Bệnh nhân người nhà bệnh nhân tiền bồi dưỡng cho q trình khám lấy máu Đảm bảo bí mật riêng tư đối tượng nghiên cứu: Các thông tin bệnh nhân người nhà bệnh nhân cung cấp cho chúng tơi giữ bí mật 37 Nghĩa vụ người tham gia nghiên cứu: Bệnh nhân người nhà bệnh nhân có trách nhiệm cung cấp đầy đủ thông tin liên quan đến tình hình bệnh tật Sự tình nguyên tham gia rút lui khỏi nghiên cứu: Sự tham gia bệnh nhân người nhà bệnh nhân hồn tồn tự nguyện, nên lý bệnh nhân người nhà tự rút lui khỏi chương trình nghiên cứu Phương thức liên hệ với người tổ chức nghiên cứu PHỤ LỤC Quy trình tách chiết DNA từ máu tồn phần (phương pháp phenol-chloroform)[8] Thiết bị Ống Eppendorf 1,5ml Máy lắc Máy ly tâm Hóa chất Các dung dịch đệm phosphat (PBS) pH: 7,4 Dung dịch phá vỡ hồng cầu RBC Proteinase K Phenol Chloroform Isoamyl(25:24:1) Chloroform Isoamyl (24:1) Ethanol 100% lạnh ethanol 0% lạnh Giấy thấm Dung dịch tách triết DNA khuôn mẫu: TE (Tris-EDTA) Giấy thấm Nước cất Quy trình Bước 1: Phá vỡ hồng cầu Cho vào ống Eppendorf 1,5ml: 0,5ml máu toàn phần 1ml dung dịch lysis buffer RBC Invert (không votex)→để phút nhiệt độ phòng Invert tiếp → ly tâm 4000v/phút/5’/4◦C Bỏ dịch nổi, thu cặn Lặp lại lần đến thu cặn trắng Bước 2: Phá vỡ bạch cầu Cho tiếp vào ống Eppendorf 1ml dung dịch PBS Invert → ly tâm 4000v/phút/5’/4◦C → bỏ dịch nổi, thu cặn Cho tiếp vào ống: 600 μl dung dịch lysis buffer HD 15 μl proteinase K μl Mecapto Ethanol 0,2% Ủ 56◦C/1h (tan hết cặn) Bước 3: Tủa DNA Cho thêm vào ống Eppendorf 500l μl dung dịch P:C:I(25:24:1) Votex→ly tâm 15000v/p/10’/4◦C→dịch ống chia phân chia thành lớp→ thu dịch suốt lớp chứa DNA cho sang ống Eppendorf mới, bỏ lớp dịch phía Cho thêm 500 μl dung dịch C:I (24:1) Votex→ly tâm→15000v/p/10’/4◦C→thu dịch suốt lớp chứa DNA cho sang ống Eppendorf mới, bỏ lớp dịch phía Cho thêm vào ống: 2,5V ethanol 100% 0,1V sodiumacetat 3M Lắc đều, ủ qua đêm -20◦C Sáng hôm sau: Ly tâm 15000v/p/20’/4◦C→thu tủa, bỏ dịch Cho thêm 1ml Ethanol 70%→ly tâm 15000v/p/20’/4◦C Lặp lại lần Thu tủa, bỏ dịch → để khơ tự nhiên→hịa tan tủa nước cất lần đệm TE Bước 4: Kiểm tra nồng độ độ tinh sản phẩm tách chiết DNA phương pháp đo mật độ quang máy Nano Drop bước sóng 260/280 (độ tinh khoảng 1,8-2,0 đạt yêu cầu Bảo quản: Ở 4◦C thời gian ngắn; -20◦C thời gian dài Quy trình kỹ thuật Multiplex - ARMS PCR [8], [9] Thiết bị Máy ly tâm loại nhỏ Máy PCR Bể điện di Hóa chất Các cặp mồi (Primers) DNA khuôn mẫu: TE (Tris-EDTA) GoldTaq Nước cất lần Đệm tra mẫu: Gel Loading Buffer Thạch điện di (electrophoresis agarose) Dung dịch đệm điện di TAE Ethidium bromide Thang chuẩn DNA (DNA ladder) Marker Quy trình Bổ sung hóa chất vào ống eppendorf 0.2ml Nước cất lần GoldTaq Mồi chung DNA khuôn Các cặp mồi đặc hiệu với loại đột biến( mồi Wild Type mồi Mutant) Tỷ lệ thành phần thiết kế để phản ứng xảy tối ưu nhất, tổng thể tích 20 μl Sử dụng đầu pipet cho loại dung dịch nhỏ vào vị trí khác thành ống Sau mix thành phần ống→ly tâm giây Đặt ống PCR vào máy PCR, tạo chu trình nhiệt Lấy ống khỏi máy PCR Dùng μl sản phẩm PCR để chạy điện di gel agarose sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp với kích thước gen đích Phân tích kết dựa kích thước đoạn DNA biết trước, so sánh kết điện di với thang chuẩn DNA để biết đột biến thuộc loại 3.Quy trình kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR [8] Thiết bị Ống eppendorf 1,5ml Thiết bị đốt nóng bể điều nhiệt Vật liệu hóa chất Ni tơ lỏng đá khơ DNA khuôn tinh chế Mồi Dung dịch đệm giải trình tự Quy trình Tinh chế sản phẩm PCR Trộn 0,1-0,5μg DNA khuôn tinh chế với pmol mồi μl nước đốt nóng 100C phút Chuyển sang nitơ lỏng đá khô phút để đơng đá Để tan nhiệt độ phịng, thêm 2μl đệm giải trình tự 10x để nhiệt độ phịng 20 phút để mồi gắn vào DNA khn Tiến hành phản ứng giải trình tự theo dẫn nhà sản xuất máy Phân tích kết BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -& LÊ THỊ THU HƯƠNG BƯỚC ĐẦU PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH β-THALASEMIA Ở CÁC THÀNH VIÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2014 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -& LÊ THỊ THU HƯƠNG BƯỚC ĐẦU PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH β-THALASEMIA Ở CÁC THÀNH VIÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN VÂN KHÁNH HÀ NỘI - 2014 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ARMS : Amplification Refractoy Mutation System (hệ thống khuếch đại đột biến bền với nhiệt) CTM : Công thức máu DNA : Deoxyribonucleic acid HBB : Hemoglobin beta Hb : Hemoglobin IVS : Intervening sequences (trình tự chèn hay instron) MCV : Mean Corpuscular Volum (thể tích trung bình hồng cầu) MCH : Mean Corpuscular Hemoglobin (lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu) NST : Nhiễm sắc thể NCBI : National Center for Biotechnology Information (Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học) PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng kéo dài chuỗi) RBC : Red blood cell (hồng cầu) RNA : Ribonucleic acid WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) HC : Hồng cầu ĐB : Đột biến MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH β-THALASEMIA 1.1.1 Những đặc điểm chung 1.1.2 Sinh lý hemoglobin 1.1.3 Sinh lý bệnh Hb .8 1.1.4 Hậu bệnh Thalasemia 10 1.1.5 Chẩn đoán điều trị bệnhβ-Thalasemia 11 1.2 DI TRUYỀN HỌC BỆNH β-THALASEMIA 13 1.3 Gen mã hóa đột biến gen β-globin gây bệnh β-Thalasemia 14 1.3.1 Vị trí cấu trúc gen HBB .14 1.3.2 Các đột biến gây bệnh 16 1.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN .19 1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH β-THALASEMIA VÀ ĐỘT BIẾN GEN β-GLOBIN Ở VIỆT NAM 23 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25 2.1.1 Nhóm đối chứng 25 2.1.2 Nhóm nghiên cứu 25 2.2 DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Dụng cụ máy móc .25 2.2.2 Hóa chất 26 2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 27 2.4 PHƯƠNG `PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.4.1 Mơ hình nghiên cứu .27 2.4.2 Nội dung nghiên cứu 27 2.4.3 Kỹ thuật nghiên cứu 28 2.5 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ .29 CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Kết tách chiết DNA người nhà bệnh nhân β-Thalasemia 30 3.2 Tỷ lệ phát người lành mang gen β globin đột biến thành viên gia đình có quan hệ huyết thống 30 3.3 Dự kiến bảng phân tích theo kết nghiên cứu 30 CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 31 4.1 Bàn luận dựa vào kết thu được, phân tích so sánh với nghiên cứu tác giả khác nước .31 4.2 Kết luận: dựa vào mục tiêu nghiên cứu 31 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 31 KẾ HOẠCH TIẾN HÀNH 32 DỰ TRÙ KINH PHÍ 33 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các chuỗi hemoglobin theo lứa tuổi .8 Bảng 1.2 Kiểu gen bố mẹ tỉ lệ bị bệnh hệ 14 Bảng 1.3 Một số kiểu đột biến gây β0 , β+ -Thalasemia biến thể hemoglobin 17 Bảng 3.1 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm bố mẹ bệnh nhân .30 Bảng 3.2 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm anh chị bệnh nhân.30 Bảng 3.3 Tỷ lệ thành viên gia đình có khơng mang gen đột biến 30 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mơ hình cấu trúc phân tử hemoglobin người trưởng thành Hình 1.2: Các loại hemoglobin người Hình 1.3: Cơ chế bệnh sinh bệnh β-Thalasemia 10 Hình 1.4: Bệnh nhân β-Thalasemia với biểu biến dạng xương 12 Hình 1.5: Sơ đồ chế di truyền bệnh β-Thalasemia bố mẹ mang gen dị hợp tử với đột biến, nguy lần sinh sau 13 Hình 1.6: Mơ hình cấu trúc gen HBB 15 Hình 1.7: Quá trình tổng hợp phân tử β-globin gen HBB 16 Hình 1.8: Minh họa chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 21 Hình 1.9: Minh họa kỹ thuật ARMS-PCR 22 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Mơ hình nghiên cứu bệnh β-Thalasemia 27 ... tài: ? ?Bước đầu phát người lành mang gen bệnh β- Thalasmia thành viên gia đình bệnh nhân? ?? với mục tiêu: Khảo sát người lành mang gen β- globin dị hợp tử thành viên gia đình bệnh nhân β- Thalassmia... cứu 2.4.2.1 Lựa chọn bệnh nhân β- Thalasemia phát đột biến gen β- globin - Xây dựng bệnh án lập phả hệ gia đình 2.4.2.2 Phát người lành mang gen bệnh thành viên gia đình người bệnh đối tượng liên... Bảng 3.1 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm bố mẹ bệnh nhân .30 Bảng 3.2 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm anh chị bệnh nhân. 30 Bảng 3.3 Tỷ lệ thành viên gia đình có khơng mang gen đột biến