BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ NGỌC ANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NYSTOSE CỦA BA KÍCH TẠI TÂY GIANG, QUẢNG NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ NGỌC ANH MÃ SINH VIÊN: 1401016 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NYSTOSE CỦA BA KÍCH TẠI TÂY GIANG, QUẢNG NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hoàng Quỳnh Hoa DS Phạm Thị Linh Giang Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận em xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân Ban giám hiệu thầy cô môn Thực Vật trường Đại học Dược Hà Nội quan tâm bảo tận tình em trình thực đề tài Đặc biệt với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Hoàng Quỳnh Hoa DS Phạm Thị Linh Giang, người dìu dắt, động viên, tận tình bảo trực tiếp hướng dẫn em suốt trình thực khóa luận Em xin cảm ơn chị kỹ thuật viên bạn sinh viên khóa 69 nghiên cứu môn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình nghiên cứu thực nghiệm Con xin cảm ơn gia đình ln ủng hộ, khích lệ, tạo điều kiện tốt cho suốt năm học thời gian thực khóa luận Sau cùng, em xin kính chúc thầy, môn Thực Vật thật dồi sức khỏe, công tác tốt Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Đinh Thị Ngọc Anh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan lồi Ba kích Morinda officinalis How 1.1.1 Đa dạng sinh học 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Thành phần hóa học rễ Ba kích 1.1.4 Tác dụng sinh học 1.1.5 Công dụng theo Y học cổ truyền 1.1.6 Tổng quan nystose 1.1.6.1 Công thức phân tử 1.1.6.2 Tính chất nystose 1.1.6.3 Tác dụng sinh học 1.1.6.4 Một số phương pháp xác định hàm lượng nystose rễ Ba kích 1.2 Một số nghiên cứu Ba kích Việt Nam CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 2.1.3 Thiết bị dùng nghiên cứu 10 2.2 Nội dung nghiên cứu 10 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 10 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 11 2.3 Phương pháp nghiên cứu 11 2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 11 2.3.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu 11 2.3.3 Nghiên cứu đặc điểm bột rễ 11 2.3.4 Giám định tên khoa học 11 2.3.5 Xây dựng thẩm định phương pháp bán định lượng nystose rễ Ba kích HPTLC 12 2.3.5.1 Xây dựng phương pháp bán định lượng 12 2.3.5.2 Thẩm định phương pháp bán định lượng 13 2.3.5.3 Bán định lượng hàm lượng nystose mẫu rễ Ba kích 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 17 3.1 Kết thực nghiệm 17 3.1.1 Đặc điểm hình thái 17 3.1.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu BK2 18 3.1.1.2 Đặc điểm hình thái mẫu BK4 19 3.1.1.3 Đặc điểm hình thái mẫu BK6 20 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 21 3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu 21 3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân 22 3.1.2.3 Đặc điểm vi phẫu rễ 24 3.1.3 Đặc điểm bột rễ 26 3.1.4 Giám định tên khoa học 28 3.1.5 Bán định lượng nystose rễ Ba kích HPTLC 28 3.1.5.1 Xây dựng phương pháp bán định lượng nystose rễ Ba kích HPTLC 28 3.1.5.2 Thẩm định phương pháp bán định lượng Nystose rễ Ba kích HPTLC 29 3.1.5.3 Bán định lượng nystose mẫu rễ Ba kích 33 3.3 Bàn luận 34 3.3.1 Hình thái thực vật 34 3.3.2 Bán định lượng thẩm định phương pháp 40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU AOAC Association of Official Analytical Chemists – Hiệp hội nhà hóa phân tích thống DĐVN Dược điển Việt Nam DNA Deoxyribo Nucleic Acid ELSD Evaporative Light Scattering Detector- Detector tán xạ bay FOS HPLC Fructose Oligosaccharide High Performance Liquid Chromatography- Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography- Sắc ký lớp mỏng hiệu cao ITS RADP Internal Transcribed Spacer- Vùng phiên mã bên Random Amplified Polymorphic DNA- Đa hình phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên rDNA Rf Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid Retention factor- Hệ số lưu giữ RSD Relative Standard Deviation- Độ lệch chuẩn tương đối TLC Thin Layer Chromatography- Sắc ký lớp mỏng UV- VIS Bức xạ tử ngoại- khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Ký hiệu mẫu Ba kích Bảng 3.1 Một số đặc điểm khác biệt vi phẫu mẫu Ba kích 22 Bảng 3.2 Một số đặc điểm khác biệt vi phẫu thân mẫu Ba kích .24 Bảng 3.3 Kết tỷ lệ Spic m cân dung môi chiết 29 Bảng 3.4 Kết thẩm định độ tuyến tính 31 Bảng 3.5 Kết thẩm định độ thích hợp hệ thống .32 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại 33 Bảng 3.7 Kết bán định lượng hàm lượng Nystose mẫu nghiên cứu 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo nystose Hình 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu BK2 18 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái mẫu BK4 19 Hình 3.3 Đặc điểm hình thái mẫu BK6 20 Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu BK4 21 Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu thân BK6 23 Hình 3.6 Đặc điểm vi phẫu rễ BK4 25 Hình 3.7 Hình ảnh đặc điểm bột dược liệu rễ BK2 26 Hình 3.8 Hình ảnh đặc điểm bột dược liệu rễ BK4 27 Hình 3.9 Hình ảnh đặc điểm bột dược liệu rễ BK6 27 Hình 3.10 Hình ảnh mỏng hệ dung môi triển khai TLC sau phun thuốc thử 28 Hình 3.11 Kết chồng pic mẫu: chuẩn, thử, trắng 31 Hình 3.12 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích pic lượng chất nystose 32 Hình 3.13 Đặc điểm hình thái rễ mẫu Ba kích 35 Hình 3.14 Đặc điểm hình thái thân mẫu Ba kích 36 Hình 3.15 Đặc điểm hình thái kèm mẫu Ba kích .36 Hình 3.16 Đặc điểm hình thái mẫu Ba kích 37 Hình 3.17 Đặc điểm hình thái cụm hoa mẫu Ba kích 38 Hình 3.18 Đặc điểm hình thái tràng hoa mẫu Ba kích 38 Hình 3.19 Đặc điểm hình thái nhụy mẫu Ba kích 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Ba kích thuốc quý nhân dân ta sử dụng từ lâu đời biết đến có nhiều cơng dụng bổ thận dương, mạnh gân cốt, trừ phong thấp, tăng cường sức đề kháng cho thể [19] Ngày nay, nhu cầu sử dụng Ba kích đời sống hàng ngày chế phẩm thuốc thực phẩm chức từ dược liệu ngày tăng với mức 205 tấn/ năm [16] Cũng nhu cầu sử dụng tăng vọt giúp cho Ba kích không vị thuốc dân gian, sử dụng nhỏ lẻ mà vươn lên thành chủ lực, nguồn nguyên liệu, dược liệu quý để sản xuất dược phẩm, phát triển kinh tế địa phương Theo dải phân bố tự nhiên, Ba kích mọc hoang rừng thưa rừng thứ sinh, hay gặp tỉnh miền núi phía Bắc Quảng Ninh, Lạng Sơn, Yên Bái, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Thanh Hóa Thời gian gần đây, số giống ba kích phát trồng trọt số tỉnh miền Trung miền Nam Việt Nam Quảng Trị, Quảng Nam Phú Yên Tại huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam Ba kích địa sinh trưởng phát triển tốt vành đai ôn đới độ cao 700m, khác biệt so với Ba kích vùng miền núi phía Bắc mọc độ cao gần so với mực nước biển (< 500m) Đồng thời, qua khảo sát ban đầu nhận thấy giống Ba kích Tây Giang tương đối đa dạng có số đặc điểm khác với Ba kích miền Bắc Mặt khác, địa phương, Ba kích từ rừng người dân Cơ Tu nhân giống trồng trọt, đem lại giá trị kinh tế cao quyền địa phương trọng phát triển sản phẩm từ Ba kích khn khổ dự án OCOP (Mỗi làng xã sản phẩm) Nhằm bước đầu nghiên cứu đa dạng chất lượng Ba kích Tây Giang, Quảng Nam, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật khảo sát hàm lượng nystose Ba kích Tây Giang, Quảng Nam” tiến hành với mục tiêu sau: - Mơ tả đặc điểm hình thái, vi học giám định tên khoa học số mẫu Ba kích Tây Giang, Quảng Nam - Xây dựng phương pháp bán định lượng xác định hàm lượng nystose rễ mẫu Ba kích Tây Giang, Quảng Nam CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan loài Ba kích Morinda officinalis How 1.1.1 Đa dạng sinh học Ba kích mọc hoang rừng thứ sinh, trung du miền núi Cây trồng nhiều nơi, trồng đoạn rễ đất nhiều màu, ẩm, mát, che bóng có giá tựa cho leo Ba kích thường phân bố số tỉnh trung du vùng núi thấp phía bắc Quảng Ninh, Hà Nội, Ninh Bình, Phú Thọ, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Tun Quang, n Bái, Hòa Bình, Bắc Giang, Bắc Ninh Còn có Trung Quốc [7], [8], [19] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Tên khoa học: Morinda officinalis How., họ Cà phê: Rubiaceae Tên thường gọi: Ba kích Một số tên gọi khác: Ba kích thiên, Dây ruột gà, Chẩu phóng xì (Hải Ninh), Thau tày cáy (Tày), Chồi hồng kim, Sáy cáy (Thái), Chày kiang dòi (Dao), Ba kích nhục, Liên châu ba kích, Medicinal indian Mulberry (Anh) [17], [19] Cây thảo sống lâu năm, leo thân quấn, dài hàng mét, sống lâu năm Rễ hình trụ, mập, vặn vẹo, mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc, có lõi Thân non có cạnh, màu tím, có lơng, sau nhẵn bóng Lá mọc đối, phiến hình mác bầu dục, thn nhọn, dày cứng, dài 6-14 cm, rộng 2.5- cm, cuống ngắn , non có lơng dày mặt dưới, thường tập trung gân mép lá, sau già lơng hơn, gân phụ 8-9 cặp Lá kèm bé, mỏng, ôm sát vào thân Hoa tập trung đầu cành thành tán nhỏ, hoa lúc non có màu trắng sau vàng, dài 0,3- 1,5 cm Đài hình chén hay hình ống gồm đài nhỏ phát triển khơng Tràng hàn liền phía thành ống ngắn Nhị 4, bầu hạ Quả hình cầu, rời dính liền thành khối, chín màu đỏ, mang đài tồn đỉnh [2], [3], [6], [13], [19] 1.1.3 Thành phần hóa học rễ Ba kích Thành phần hóa học rễ Ba kích biết gồm có : Các dẫn chất anthranoid: nhiều anthraquinon phân lập từ Ba kích như: 1,6-dihydroxy-2,4-dimethoxy-anthraquinon, methoxyanthraquinon, methylisoalizarin, 1,6-dihydroxy-2- methyliso-alizarin-1-methyl ether, physcion,, 1-hydroxyanthraquinon, 2-methylanthraquinon, rubiadin, rubiadin-12 17 18 phụ Domatia 23 24 Chiều dài phiến (cm) Chiều rộng phiến (cm) Chỉ số Hình dạng tràng Kích thước đài Số tràng Số bầu 25 Số vòi nhụy 19 20 21 22 Có Có 5- Có rõ mặt 7- 11 Có khơng 4- 11,5 7- 2,5- 2,5- 2,5- 1,5- 5,5 2,5- Hình trụ Hình chum Hình chum Ngắn Ngắn Ngắn 1,5- Chum trụ Dài 3-4 3- 4 3- 4 3- 2- 1 2- Phụ lục 2: Giấy chứng nhận mã số tiêu Hình 2.1 Giấy chứng nhận mã số tiêu BK2 Hình 2.3 Giấy chứng nhận mã số tiêu BK2 Hình 2.2 Tiêu mẫu khơ mẫu BK2 Hình 2.3 Giấy chứng nhận mã số tiêu BK4 Hình 2.4 Tiêu mẫu khơ mẫu BK4 Hình 2.5 Giấy chứng nhận mã số tiêu BK6 Hình 2.6 Tiêu khô mẫu BK6 Phụ lục 3: Giấy giám định tên khoa học Phụ lục 4: Hình ảnh sắc ký đồ Hình 4.1 Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết xuất Hình 4.2 Sắc ký đồ độ thích hợp hệ thống Hình 4.3 Sắc ký đồ độ lặp Hình 4.4 Hình ảnh sắc ký đồ bán định lượng mẫu Ba kích Hình 4.5 Sắc ký đồ định lượng Track 1, 2, 3: BK4; Track 4, 5, 6: BK2; Track 7, 8, 9: BK6 ... từ Ba kích khn khổ dự án OCOP (Mỗi làng xã sản phẩm) Nhằm bước đầu nghiên cứu đa dạng chất lượng Ba kích Tây Giang, Quảng Nam, đề tài Nghiên cứu đặc điểm thực vật khảo sát hàm lượng nystose Ba. .. 1401016 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NYSTOSE CỦA BA KÍCH TẠI TÂY GIANG, QUẢNG NAM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hoàng Quỳnh Hoa DS Phạm Thị Linh Giang Nơi thực. .. dung nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật Mô tả đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu Mơ tả đặc điểm vi học mẫu nghiên cứu: - Vi phẫu: rễ, thân, - Soi bột: rễ 10 Xác định tên khoa học mẫu nghiên