BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY VƯƠNG TÙNG TẠI NINH BÌNH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG Mã sinh viên: 1401636 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY VƯƠNG TÙNG TẠI NINH BÌNH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Quốc Huy DS Phạm Thị Linh Giang Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực khóa luận tốt nghiệp dược sĩ này, em nhận giúp đỡ bảo tận tình thầy giáo, anh chị Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, gia đình bạn bè Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Quốc Huy (Cục khoa học công nghệ đào tạo - BYT) – người thầy quan tâm hướng dẫn em thời gian em thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên bạn sinh viên nghiên cứu khoa học Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ em thời gian tham gia nghiên cứu khoa học thực khóa luận mơn Trong q trình thực khóa luận, em xin cảm ơn giúp đỡ góp ý nhiệt tình Ds Phạm Thị Linh Giang Ds Lê Thiên Kim (Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội) – thầy cô người anh, người chị em, động lực giúp em vượt qua giai đoạn nản chí Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ em suốt trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè – người động viên tạo điều kiện để em hồn thành tốt q trình học tập thực khóa luận Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Trịnh Thị Huyền Trang MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Murraya J Koenig ex Linnaeus 1.1.1 Vị trí phân loại chi Murraya J Koenig ex Linnaeus .2 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân loại chi Murraya J Koenig ex Linnaeus 1.1.3 Thành phần hóa học chi Murraya J Koenig ex Linnaeus .4 1.1.4 Phân bố chi Murraya J Koenig ex Linnaeus .9 1.1.5 Tác dụng sinh học chi Murraya J Koenig ex Linnaeus .9 1.2 Tổng quan ứng dụng sắc kí lớp mỏng (TLC) sắc kí khí kết nối khối phổ (GC-MS) kiểm nghiệm tinh dầu .10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu .12 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 12 2.2.1 Hóa chất .12 2.2.2 Dụng cụ máy móc 13 2.3 Nội dung nghiên cứu 13 2.4 Phương pháp nghiên cứu 14 2.4.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 14 2.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 14 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Thực nghiệm kết 18 3.1.1 Đặc điểm thực vật Vương Tùng 18 3.1.2 Nghiên cứu thành phần hóa học chét VT01 VT02 27 3.2 Bàn luận 36 3.2.1 Về dặc điểm thực vật giám định tên khoa học .36 3.2.2 Về thành phần hóa học 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt GC-MS Viết đầy đủ Gas chromatography- mass spectrometry (Sắc kí khí kết hợp với khối phổ) HLTD Hàm lượng tinh dầu M Murraya NXB Nhà xuất R-T R-Time (thời gian lưu) SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TLC Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Bảng mã hóa ký hiệu mẫu nghiên cứu 12 Bảng 2.2 Chương trình nhiệt độ 17 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất 28 Bảng 3.2: Phân tích sắc kí đồ hai mẫu VT01-4 VT02-4 31 Bảng 3.3 Thành phần tinh dầu hai mẫu VT01-4 VT02-4 32 Bảng 3.4 Kết định lượng tinh dầu mẫu theo thời gian 33 Bảng 3.5 Kết phân tích sắc kí đồ mẫu theo thời gian 35 Bảng 3.6 Kết xác định thành phần tinh dầu mẫu theo thời gian 36 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc số thành phần thường gặp timh dầu chi Murraya Hình 1.2: Cấu trúc khung carbazole alcaloid Hình 1.3: Cấu trúc khung indol alcaloid Hình 1.4: Cấu trúc khung euflavonoid Hình 2.1 Bộ dụng cụ xác định hàm ẩm phương pháp cất với dung mơi 15 Hình 2.2 Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu nhẹ nước Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội 16 Hình 3.1 Cây Vương tùng vùng núi đá vơi Ninh Bình 18 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái cành mẫu VT01 19 Hình 3.3 Đặc điểm hình thái hoa mẫu VT01 21 Hình 3.4 Đặc điểm hình thái hạt mẫu VT01 21 Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu thân mẫu nghiên cứu 23 Hình 3.6 Đặc điểm vi phẫu gân mẫu nghiên cứu 24 Hình 3.7 Đặc điểm vi phẫu phiến mẫu nghiên cứu 25 Hình 3.8 Đặc điểm bột mẫu nghiên cứu 26 Hình 3.9 Đặc điểm bột thân mẫu nghiên cứu 27 Hình 3.10: Hình ảnh sắc kí đồ hai mẫu VT01-4 VT02-4 31 Hình 3.11 Kết chồng pic sắc kí đồ hai mẫu VT01-4 VT02-4 32 Hình 3.12: Sự thay đổi HLTD VT01 VT02 theo thời gian 34 Hình 3.13 Sắc kí đồ mẫu theo thời gian 34 Hình 3.14 Kết chồng pic mẫu tinh dầu VT01 35 Hình 3.15 Kết chồng pic mẫu tinh dầu VT02 35 Hình 3.16 Cấu trúc hai thành phần tinh dầu VT01 39 Hình 3.17 Cấu trúc thành phần tinh dầu VT02 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Tinh dầu sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên sử dụng từ lâu đời với nhiều công dụng khác nhau, có ứng dụng rộng rãi Y dược sống đời thường Trong đó, số loại tinh dầu từ họ Cam (Rutaceae) tinh dầu vỏ bưởi, tinh dầu hoa bưởi, tinh dâu vỏ chanh, tinh dầu vỏ quýt,… ưa chuộng với nhiều tác dụng quan trọng đặc biệt làm đẹp, kĩ nghệ sản xuất mỹ phẩm, nước hoa, hương lệu [1] Trong thực tế, gần đây, nguồn tinh dầu từ chi Murraya J Koenig ex Linnaeus thuộc họ Cam (Rutaceae) bắt dầu nghiên cứu cho kết khả quan với hàm lượng cao đa dạng chemotype khác loài cấu tử thành phần tinh dầu Tại Ninh Bình, lồi gỗ nhỏ có tên thường gọi Vương tùng, mọc hoang vùng núi đá vôi, hay người dân địa phương dùng để chữa cảm cúm, cảm sốt, đau nhức Qua quan sát nhận thấy mẫu có đặc điểm hình thái phù hợp với đặc điểm chi Muraya J Koenig ex Linnaeus họ Cam Mặt khác, qua quan sát ban đầu, lồi Vương tùng mọc vùng có nhiều túi tiết tinh dầu với mật độ cao Đặc biệt, mùi hương tinh dầu có khác rõ rệt nhóm khác thời điểm khác năm Vương tùng Ninh Bình thường có hai loại mùi hương tinh dầu đặc trưng: loại có xu hướng giống mùi tinh dầu bạc hà, loại lại có xu hướng giống mùi tinh dầu sả chanh Để xác định tên loài tiềm khai thác tinh dầu loài đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học Vương tùng Ninh Bình” thực với hai mục tiêu: - Mơ tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học giám định tên khoa học mẫu Vương tùng thu hái Ninh Bình - Định tính nhóm chất hữu chính, định lượng, xác định thành phần tinh dầu biến đổi thành phần tinh dầu năm mẫu Vương tùng thu hái Ninh Bình CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Murraya J Koenig ex Linnaeus 1.1.1 Vị trí phân loại chi Murraya J Koenig ex Linnaeus Theo tài liệu [3], [6] chi Murraya J Koenig ex Linnaeus xếp vào họ Cam (Rutaceae) Trong hệ thống phân loại thực vật, vị trí chi Murraya J Koenig ex Linnaeus tóm tắt đây: Ngành Ngọc lan – Magnoliophyta Lớp Ngọc lan – Magnoliopsida Phân lớp Hoa hồng – Rosidae Bộ Cam – Rutales Họ Cam – Rutaceae Chi Murraya 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân loại chi Murraya J Koenig ex Linnaeus 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái Theo Thực vật chí Trung Quốc [37] tài liệu đầy đủ chi Muraya nay, chi Murraya mô tả J Koenig ex Linnaeus vào năm 1771, có đặc điểm chung sau: Cây gỗ nhỏ nhỡ, khơng có gai, khơng có lơng tơ hay vảy ngọn, chồi nách cụm hoa non Lá mọc so le, kép lông chim lẻ Cụm hoa ở nách, kiểu chùm kép cắt giảm thành xim hai ngả xim ngả Hoa lưỡng tính, hình bầu dục tới hình trứng nụ Đài 5, rời hàn liền đến nửa chiều dài chúng Tràng hoa 5, tiền khai hoa kiểu vặn lợp Nhị từ đến 10, rời, không giống chiều dài, nhị mảnh mảnh, thẳng khơng thẳng Đĩa hình nhẫn, phồng lên hình cột Bộ nhụy 2-5 noãn, hàn liền, vách ngăn thẳng từ trung tâm trở ra, noãn chứa 1-2 nỗn Vòi nhụy 3-7 cho bầu nhụy, rụng đồng loạt rụng không hết tạo Quả mọng với thịt nhầy, khơng có khoảng trống quả, vỏ mọng nước Hạt có lớp vỏ mỏng dầy, nội nhũ ít, mầm thẳng, mầm hình elip, bên lồi bên phẳng, không cuộn vào không gập lại, thân mầm phân gắn mầm Trên giới, tính đến có lồi thuộc chi Murraya công nhận là: Murraya alata Drake, Murraya crenulata (Turcz.) Oliv, Murraya euchrestifolia Hayata, Murraya koenigii (L.) Spreng, Murraya kwangsiensis (C.C Huang) C.C Huang, Murraya microphylla (Merr & Chun) Swingle, Murraya paniculata (L.) Jack, Murraya tetramera C.C Huang [40] 1.1.2.2 Phân loại chi Murraya J Koenig ex Linnaeus Theo Thực vật chí Trung Quốc [37] tài liệu đầy đủ chi Muraya nay, khóa phân loại chi Murraya thể sau: 1a Cánh hoa 1-2 cm, hạt có lơng nhỏ 2a Cuống chét cấp có cánh…………………….…………… M alata 2b Cuống chét cấp khơng có cánh 3a Phiến chét hình từ gần tròn đến hình ovan đến hình elip,rộng 1,5 đến cm…………………………………………………… …………… M paniculata 3b Phiến chét hình trứng, phiến rộng phần gốc phiến lá, rộng từ 0.5-3 cm .3 M exotica 1b Cánh hoa khơng dài q 0.8 cm, hạt khơng có lơng 4a Tràng hoa - nhiều, nhị 10 5a Phiến chét hình mũi mác, rộng 0.8-2 cm, gân phụ không rõ ràng M tetramera 5b Phiến chét hình ovan đến elip hình mũi mác hình trứng ngược; rộng từ 2-4 cm, gân phụ mặt nhô ra……………………………….…………………………………….5.M.euchrestifolia 4b Tràng hoa - nhiều, nhị 10 6a Lá kép 11-31 chét 7a Phiến chét rộng mm, 3-6 đỉnh tròn….………………………………………… ……………6.M.microphylla 7b Phiến chét rộng 5-20mm, đỉnh có mũi nhọn ngắn nhô ra…………………………………………………….………….7 M koenigii 6b Lá kép 3-11 chét 8a Mặt phiến có nhiều lơng ngắn……………………………………………….……….9 M kwangsiensis 8b Phiến khơng có lông 9a Phiến chét 5-6 x 2-3 cm……………… ………8 M .crenulata 9b Phiến chét 7-18 x 4-10 cm………….……….9.M kwangsiensis Theo đặc điểm dùng để nhận biết lồi chi là: Kích thước cánh hoa; hạt (có lơng hay khơng có lơng); số lượng cánh hoa; nhị; cuống chét Tiêu “Guangxi Bontanical Garden of Medicinal Plant” Số hiệu tiêu GXMG0116786 57 Tiêu mẫu VT01 lưu phòng tiêu Bộ môn thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội Số hiệu tiêu HNIP/18555/19 58 Tiêu mẫu VT02 lưu phòng tiêu Bộ mơn thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội Số hiệu tiêu HNIP/18556/19 59 PHỤ LỤC Kết định lượng tinh dầu mẫu Mẫu VT01-1 Lần HA (%) M (g) V (ml) HL (%) 15,99 35,0012 0,9 3,06 14,67 35,0216 0,9 3,01 15,98 35,0009 1,0 3,40 14,66 35,0112 1,0 3,35 14,65 35,0311 1,0 3,34 15,98 35,0319 0,8 2,72 14,67 35,0005 0,7 2,34 14,67 35,0023 0,7 2,34 16,00 35,0011 0,8 2,72 17,33 35,0021 0,7 2,42 14,67 35,0015 0,7 2,34 16,00 35,0222 1,0 3,40 14,67 35,0016 1,0 3,35 14,67 35,0020 0,9 3,01 17,33 35,0014 0,8 2,76 16,00 35,0111 0,8 2,72 14,67 35,0023 0,8 2,68 14,67 35,0017 0,8 2,68 16,00 35,0014 0,8 2,72 14,67 35,0020 0,7 2,34 HLTDtb(%) RSD(%) 3,04 1,16 3,36 0,96 2,47 8,89 2,49 8,03 3,25 6,52 2,72 1,47 2,58 8,09 VT01-2 VT01-3 VT01-4 VT02-2 VT02-3 VT02-4 60 PHỤ LỤC Kết xử lý sắc kí đồ (SKLM) phần mềm VideoScan 61 62 63 64 PHỤ LỤC Kết GC-MS VT01-1 65 VT01-2 66 VT01-3 67 VT01-4 68 VT02-4 69 PHỤ LỤC Các hình ảnh đặc điểm hình thái VT02 Đặc điểm hình thái cành mẫu VT02 Chú thích: Cành mang ; Cách mọc lá; Bề mặt cành ; Các kiểu kép; Các chét kép; Cách mọc chét kép; 7.Mép lá; Ngọn lá; Gốc cuống lá; 10 Bề mặt lá; 11 Bề mặt lá; 12 Túi tiết tinh dầu phiến mép lá; 13 Kích thước túi tiết tinh dầu 70 Đặc điểm hoa mẫu VT02 Chú thích: Cụm non; Bộ nhị nhụy; Cụm nụ hoa non 71 ... tài: Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học Vương tùng Ninh Bình thực với hai mục tiêu: - Mơ tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học giám định tên khoa học mẫu Vương tùng thu... kết nối máy tính 2.3 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm thực vật + Đặc điểm hình thái + Giám định tên khoa học + Đặc điểm vi học - Nghiên cứu thành phần hóa học + Định tính sơ nhóm chất:...BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG Mã sinh viên: 1401636 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY VƯƠNG TÙNG TẠI NINH BÌNH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP