Nghiên cứu tác dụng và bước đầu nghiên cứu cơ chế hóa sinh của cao chiết saponin lá chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer

67 11 0
  • Loading ...
1/67 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 31/07/2019, 11:32

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI *** NGUYỄN HỮU SƠN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HOÁ SINH CỦA CAO CHIẾT SAPONIN LÁ CHÈ ĐẮNG (Ilex kudingcha C.J.Tseng) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN GÂY BỆNH ALZHEIMER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI *** NGUYỄN HỮU SƠN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HOÁ SINH CỦA CAO CHIẾT SAPONIN LÁ CHÈ ĐẮNG (Ilex kudingcha C.J.Tseng) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN GÂY BỆNH ALZHEIMER KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Phạm Thị Nguyệt Hằng PGS.TS Nguyễn Thị Lập Nơi thực hiện: Viện Dược liệu Bộ mơn Hố sinh HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, trưởng khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu Cơ người trực tiếp hướng dẫn em trình nghiên cứu khoa học khoa, bên cạnh động viên cổ vũ tôi, dìu dắt em thực tốt khố luận Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Lập, mơn Hóa sinh – trường Đại học Dược Hà Nội Cô cho em hội nghiên cứu khoa học môi trường chuyên nghiệp, đưa lời khuyên quý báu, giúp đỡ em suốt trình thực khoá luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị khoa Dược lý – Sinh hóa – Viện Dược liệu giúp đỡ, hướng dẫn em kỹ thuật tạo điều kiện để em hồn thành nghiên cứu thực nghiệm khoa Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian em học tập trường Cuối cùng, em xin bày tỏ yêu thương biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè bên em, ủng hộ động viên em, chỗ dựa tinh thần vững em gặp khó khăn học tập sống Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận có nhiều thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Hữu Sơn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu nghiên cứu: Chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) 1.1.1 Tên gọi – Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố 1.1.3 Thành phần hoá học 1.1.4 Một số nghiên cứu thực chè đắng 1.2 Tổng quan bệnh Alzheimer 1.2.1 Sơ lược bệnh Alzheimer 1.2.2 Dịch tễ 1.2.3 Nguyên nhân gây bệnh yếu tố di chuyền học 1.2.4 Yếu tố nguy bảo vệ .8 1.2.5 Cơ chế bệnh sinh 1.2.6 Một số mô hình nghiên cứu 12 1.3 Tổng quan ruồi giấm chuyển gen 15 1.3.1 Tên gọi, vị trí phân loại .15 1.3.2 Đặc điểm .15 1.3.3 Ưu điểm sử dụng ruồi giấm phòng thí nghiệm 15 1.3.4 Hệ thống GAL4/UAS 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị: 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Động vật thí nghiệm 19 2.1.3 Dụng cụ, hoá chất nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang bệnh Alzheimer cung cấp Viện Công nghệ Kyoto 21 2.2.2 Đánh giá tác dụng cao chiết saponin từ chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) mơ hình ruồi giấm gây bệnh Alzheimer thử nghiệm hành vi 22 2.2.3 Tìm hiểu chế cao saponin từ chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) thông qua mức độ biểu protein APP 30 2.3 Xử lý thống kê 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Đánh giá tác dụng cao chiết saponin chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) mơ hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer thử nghiệm hành vi 35 3.1.1 Đánh giá khả vận động ruồi giấm 35 3.1.2 Đánh giá khả nhớ mùi ruồi giấm trưởng thành 37 3.1.3 Đánh giá khả sống sót ruồi giấm trưởng thành 40 3.2 Tìm hiểu chế tác dụng chè đắng Ilex kudingcha C.J.Tseng thông qua việc đánh giá mức độ biểu protein tiền chất amyloid (Amyloid precusor protein –APP) não ruồi giấm 41 CHƯƠNG BÀN LUẬN 45 4.1 Về mơ hình nghiên cứu 45 4.1.1 Về việc lựa chọn mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer 45 4.1.2 Về để lựa chọn mức liều mg/ml mg/ml 46 4.1.3 Về việc lựa chọn Amyloid precusor protein 46 4.2 Về kết nghiên cứu 47 4.2.1 Đánh giá khả vận động ruồi giấm 47 4.2.2 Đánh giá khả nhớ mùi ấu trùng ruồi giấm 48 4.2.3 Đánh giá khả sống sót ruồi giấm trưởng thành 49 4.2.4 Tìm hiểu chế tác dụng cao chiết chè đắng Ilex kudingcha C.J.Tseng thông qua việc đánh giá mức độ biểu protein tiền chất amyloid APP 49 4.2.5 Về mức liều cao chiết saponin chè đắng: 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ theo Tiếng Viết đầy đủ theo Tiếng Việt STT Viết tắt AA Alzheimer's Association Hiệp hội Alzheimer AchE Acetylcholin esterase Acetylcholin esterase AD Alzheimer disease Bệnh Alzheimer AM n- Amyl acetat n- Amyl acetat ApoE Apolipoprotein E Apolipoprotein E Anh Amyloid precursor APP protein Protein tiền chất amyloid ATCI Acetylthiocholin iodid Acetylthiocholin iodid Aβ β-amyloid β-amyloid 10 BPB Bromophenol blue Bromophenol blue 11 CĐ Ilex kudingcha Chè đắng Enzym Horseradish 12 HRP Horseradish peroxidase peroxidase 13 IK Ilex kudingcha Chè đắng Neuroblastoma x glyoma 14 NG 108-15 hybrid cell, 108CC15 Olfactory bulbectomized Tế bào lai u nguyên bào thần kinh glyoma (một khối u não phổ biến) Phẫu thuật loại bỏ vùng khứu 15 OBX giác 16 OCT 1-octanol 1-octanol 17 PVDF Polyvinyllidene difluoride Polyvinyllidene difluoride 18 ROS Reactive oxygen species Gốc oxy hoá tự 19 SDS Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE 20 polyacrylamide gel Điện di polyacrylamide với electrophoresis SDS 21 TBS Tris buffer saline Đệm tris 22 βAP β-amyloid peptid β-amyloid peptid DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1: Hình ảnh chè đắng búp chè đắng khô (Ilex kudingcha C J Tseng) Hình 2: Sự hình thành Amyloid beta mảng bám tế bào[46] 10 Hình : Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) 15 Hình 4: Hệ thống biểu GAL4/UAS với UAS-hAPP 17 Hình 1: Thiết kế nghiên cứu 18 Hình 2: Mơ hình kiểm tra trí nhớ ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm 29 Hình 1: Tốc độ di chuyển ấu trùng .35 Hình 2: Điểm leo trèo trung bình lô ruồi sau nở ngày, ngày 10 ngày 37 Hình 3: Giá trị PREFAM AM kết hợp với phần thưởng 38 Hình 4: Giá trị PREFOCT OCT kết hợp với phần thưởng .39 Hình 5: Chỉ số học tập (LI scores) 40 Hình 6: Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ sống sót ruồi theo ngày 41 Hình 7: Sự biểu protein tiền chất amyloid theo cường độ tín hiệu hố phát quang thu 42 Hình 8: Tỉ lệ hAPP/beta-actin lô ruồi 43 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Hoá chất .19 Bảng 2: Dụng cụ, thiết bị 20 Bảng 1: Mức độ biểu protein lô ruồi 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Alzheimer (Alzheimer's disease hay AD) hay đơn giản Alzheimer chứng trí phổ biến Chứng trí ảnh hưởng xấu tới chức nhận thức khả hoạt động hàng ngày Điều nguy hiểm triệu chứng sa sút trí tuệ tiến triển cách âm thầm ngày trở nên tồi tệ theo năm tháng Người bệnh phải chăm sóc người thân gia đình Đây thực áp lực lớn mặt xã hội, tâm lý, sức khỏe, kinh tế sống người chăm sóc Ở nước phát triển, Alzheimer bệnh tốn cho xã hội tìm loại thuốc chiến lược phát triển thuốc giúp ngăn ngừa, điều trị chứng trí có hiệu an tồn vơ cần thiết Chè Đắng có tên khoa học Ilex kudingcha C.J.Tseng (IK) (Ilex latifolia) loài thân gỗ sống lâu năm mọc vùng núi đá vôi Việt Nam, phân bố chủ yếu số tỉnh Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình Ninh Bình Trong y học cổ truyền Việt Nam, Chè đắng sử dụng làm vị thuốc để loại bỏ độc tố, kháng khuẩn, giảm khát ho, ngứa mắt, mắt đỏ, đặc biệt để tăng cường tập trung cải thiện trí nhớ Triterpenoid, axit phenolic, flavonoid tinh dầu chất Chè đắng thành phần có tác dụng bảo vệ hệ thống mạch máu, điều hòa q trình chuyển hóa lipid, có tác dụng chống oxy hoá, hạ đường huyết ức chế khối u [31] Trong nghiên cứu tác giả Kim cộng Chè đắng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần kinh điểm thiếu máu cục chuột nhắt [25] Hơn nữa, có nghiên cứu cho tác dụng bảo vệ thần kinh chống lại protein amyloid β (Aβ)- yếu tố gây suy giảm trí nhớ yếu tố gây độc tế bào thần kinh vỏ não chuột [26] Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu tác dụng chè đắng bệnh Alzheimer Vì lý trên, đề tài thực với mục tiêu: Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết saponin Chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) mơ hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer Nghiên cứu chế hoá sinh giúp cải thiện trí nhớ cao chiết saponin Chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) mơ hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer (4mg/ml) giảm biểu APP nhiều hơn, khoảng nửa so với lơ chè đắng có nồng độ thấp (2mg/ml) 44 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Về mơ hình nghiên cứu 4.1.1 Về việc lựa chọn mơ hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer Ruồi giấm có tên khoa học Drosophila melanogaster, giải trình tự tồn hệ gen, cho thấy có 70% gen tương đồng với gen người [50] Ruồi giấm nhiều ưu điểm nghiên cứu Thứ nhất, Sử dụng ruồi giấm nghiên cứu vấp phải vấn đề liên quan tới đạo đức nghiên cứu y sinh học tiến hành thử nghiệm lên động vật bậc cao hay động vật có vú khỉ Thứ hai, ruồi giấm có vòng đời ngắn nên cho phép tạo lượng lớn ruồi giấm thời gian ngắn Một phôi xuất vòng 24 sau thụ tinh trứng Phơi sau trải qua ba giai đoạn ấu trùng khác cuối trưởng thành thành ruồi giấm trưởng thành Sự phát triển ruồi trưởng thành 10 ngày kể từ thụ tinh Ruồi tạo tới 1500 trứng suốt đời cung cấp lượng ruồi giấm liên tục cho nghiên cứu di truyền Thứ ba, ruồi giấm có kích thước nhỏ nên tốn diện tích, ngun vật liệu để ni dưỡng thí nghiệm Thứ tư, ruồi giấm có hệ gen đơn giản: Yếu tố di truyền làm cho loài ruồi trở thành sinh vật mẫu lý tưởng D.melanogaster có bốn cặp nhiễm sắc thể so với 23 cặp người Sự đơn giản lý chúng sinh vật sử dụng nghiên cứu di truyền Thứ năm, đặc điểm giải phẫu: D.melanogaster có đặc điểm giải phẫu (như cánh mắt) cho phép dễ dàng mô tả đặc điểm Những dấu hiệu di truyền dễ dàng xác định kính hiển vi (như mắt đỏ, cánh cong,…) Các hành vi ăn, giao phối ngủ quan sát thấy người nhìn thấy Drosophila Do đó, ảnh hưởng có di truyền đến hành vi người đánh giá thơng qua ruồi giấm Thêm vào đó, ruồi giấm có cấu trúc não phân hóa cao điều khiển hành vi tinh vi sử dụng rộng rãi làm mơ hình để nghiên cứu liên kết nhớ Hoạt động nhớ động vật bậc cao có chế tương tự ruồi giấm [38] Nhận thức tính cần thiết việc nghiên cứu bệnh, tạo mơ hình để nghiên cứu, có nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng ruồi giấm làm mơ hình nghiên cứu bệnh người có bệnh thối hóa thần kinh, ví dụ cơng bố nhóm nghiên cứu Parsa Kazemi-Esfarjani, Seymour Benzer việc ức chế 45 độc tính polyglutamine mơ hình ruồi giấm Nhóm tác giả John M Warrick (năm 2005) ứng dụng mơ hình tương tự cho nghiên cứu tác dụng ức chế polyglutamine Ataxin-3 [52] Nhóm Botella cộng năm 2009 2011 dùng ruồi giấm làm mơ hình nghiên cứu bệnh Parkinson [9], [19] Các nhà nghiên cứu Nhật Bản, nhóm tác giả Hideya Mizuno (năm 2011) dùng mơ hình ruồi giấm chuyển gen alpha-synuclein làm mơ hình nghiên cứu bệnh Parkinson yếu tố liên quan [39] Nhóm tác giả Masamitsu Yamaguchi (2017) số nhóm nghiên cứu khác dùng mơ hình ruồi giấm đột biến gen ATP binding cassette subfamily A member 13 (ABCA13) làm mơ hình nghiên cứu bệnh tự kỷ [47], [50] Do có nhiều ưu điểm, dễ dàng quan sát định lượng nên định sử dụng mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP để nghiên cứu tác dụng chè đắng Ilex kudingcha C.J.Tseng bệnh Alzheimer Mặc dù có lợi việc sử dụng D.melanogaster để nghiên cứu bệnh người, có số nhược điểm giải phẫu não quan khác ruồi khác với người Thiếu phương pháp để đo lường xu hướng hành vi, thiếu khả nhận thức sâu sắc, thiếu hệ thống miễn dịch thích nghi tác dụng thuốc khác biệt đáng kể so sánh với nghiên cứu người Nhìn chung, D.melanogaster sinh vật mẫu tốt nhiều lý do, chúng có nhược điểm Những ruồi cung cấp hiểu biết vô giá bệnh khơng thể có mơ hình người hỗ trợ tìm kiếm phương pháp điều trị phù hợp 4.1.2 Về để lựa chọn mức liều mg/ml mg/ml Chúng tiến hành dò liều dải nồng độ lớn từ từ 0,5 mg/ml đến 10 mg/ml, vào tỷ lệ sống sót ruồi trưởng thành tác dụng cải thiện triệu chứng bệnh Alzheimer nhận thấy nồng độ mg/ml mg/ml phù hợp để đưa vào nghiên cứu thức 4.1.3 Về việc lựa chọn Amyloid precusor protein Nghiên cứu di truyền, sinh hóa hành vi cho thấy việc tạo chất độc thần kinh Aβ peptid từ protein tiền chất amyloid (APP) bước quan trọng phát triển 46 AD [42] Protein tiền chất amyloid (APP) protein màng tham gia vào trình phân giải protein phức tạp APP dẫn xuất chứng minh đóng vai trò trung tâm bệnh Alzheimer (AD) Drosophila melanogaster hệ thống mơ hình phù hợp để nghiên cứu vai trò APP bệnh Alzheimer Bộ não ruồi có tổ chức cao, trì số hình thức học tập trí nhớ điều khiển nhiều hành vi phức tạp Điều quan trọng phân tử chế trình nhớ bảo tồn từ ruồi đến động vật có vú Trong não ruồi có protein tương đồng với APP người gọi APP-Like (APPL) Việc thực chiến lược RNA in vivo sụp đổ (Knockdown) Appl MB – trung tâm cho nhớ khứu giác não ruồi giấm - dẫn đến trí nhớ Một số dẫn xuất APPL đóng vai trò khác loại giai đoạn nhớ Hơn nữa, biểu mức amyloid peptide Drosophila làm trầm trọng thêm tình trạng thiếu hụt nhớ gây giảm APPL, làm suy giảm trí nhớ [43] Kết sau tiến hành thí nghiệm cho thấy cao chiết saponin chè đắng có tác dụng cải thiện hành vi trí nhớ ruồi giấm gây bệnh Alzheimer Vì vậy, chúng tơi tiến hành định lượng APP não ruồi giấm để nghiên cứu chế tác dụng cao chiết saponin chè đắng theo hướng làm giảm biểu protein tiền chất amyloid APP 4.2 Về kết nghiên cứu 4.2.1 Đánh giá khả vận động ruồi giấm Giảm chức vận động chẩn đốn thơng thường để sàng lọc mơ tả mơ hình liên quan tới vấn đề thần kinh Mức độ di chuyển thể mối liên hệ với mức độ bệnh *Về khả bò ấu trùng ruồi giấm Cải thiện tốc độ di chuyển tiêu chí đánh giá tác dụng thuốc lên chức vận động ấu trùng ruồi giấm Kết nghiên cứu hình 3.1 cho thấy ấu trùng ruồi giấm mang gen hAPP sử dụng cao chiết chè đắng nồng độ nghiên cứu cải thiện khả bò so với lơ bệnh lý Tốc độ bò trung bình hai nồng độ gần cho thấy hai 47 nồng độ 2mg/ml 4mg/ml có tác dụng cải thiện khả bò ấu trùng ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer *Về khả leo trèo ấu trùng ruồi giấm Cải thiện khả leo trèo tiêu chí đánh giá tác dụng thuốc lên chức vận động ruồi giấm trưởng thành Kết nghiên cứu hình 3.2 cho thấy, vào ngày 3, ngày ngày 10 sau nở, khả trèo ruồi giầm trưởng thành sử dụng cao chiết chè đắng nồng độ cải thiện so với nhóm bệnh lý Ở ngày thứ 3, điểm leo trèo trung binh hai lô nồng độ mg/ml mg/ml tương tự Tuy nhiên, ngày thứ 7, điểm leo treo trung bình lơ nồng độ mg/ml cao khoảng 11.5% so với lơ mg/ml kết ngày thứ 10 lại cho thấy điểm leo trèo lô mg/ml thấp lô mg/ml khoảng 9% Từ ta thấy tuổi thọ ruồi cao hơn, chè đắng với nồng độ cao có độc tính ảnh hưởng tới khả vận động ruồi giấm Tuy nhiên khác biệt ngày thứ thứ 10 chưa đạt ý nghĩa thống kê nên cần tiến hành thí nghiệm với cỡ mẫu lớn để làm sáng rõ điều Kết đánh giá khả vận động cho thấy cao chiết chè đắng có tiềm điều trị vấn đề suy giảm chức thần kinh bệnh Alzheimer 4.2.2 Đánh giá khả nhớ mùi ấu trùng ruồi giấm Đặc trưng bệnh Alzheimer suy giảm trí nhớ, khó nhớ việc xảy khơng có khả để tiếp thu thông tin Để đánh giá khả ghi nhớ học tập ruồi giấm, sử dụng mơ hình thử nghiệm khả nhớ mùi ruồi giấm giai đoạn ấu trùng (Odor taste) nhằm mục đích đánh giá trí nhớ ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm Kết hình cho thấy nhóm chứng sinh lý (Elav-GFP) có điểm học tập LI cao nhóm chứng bệnh lý (hAPP) khác biệt có ý nghĩa thống kê với p
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu tác dụng và bước đầu nghiên cứu cơ chế hóa sinh của cao chiết saponin lá chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer, Nghiên cứu tác dụng và bước đầu nghiên cứu cơ chế hóa sinh của cao chiết saponin lá chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn