BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẬU CHI MAI XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HORMON STEROID TRONG SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM TỪ SỮA BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẬU CHI MAI Mã sinh viên: 1401393 XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HORMON STEROID TRONG SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM TỪ SỮA BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn TS Trần Cao Sơn TS Lê Đình Chi Nơi thực Viện KNATVSTPQG HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy giáo TS Lê Đình Chi TS Trần Cao Sơn luôn tận tâm hướng dẫn, động viên giúp đỡ em trình học tập nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể thầy giáo mơn Hóa Phân Tích, chị Ths Vũ Ngọc Tú anh chị công tác Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tận tâm giảng dạy, tạo điều kiện học tập tốt cho em năm vừa qua Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn người bạn ln bên, quan tâm, giúp đỡ động viên em vượt qua khó khăn sống, học tập nghiên cứu năm qua Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2019 Sinh viên Đậu Chi Mai i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG i DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan số hormon steroid .2 1.1.1 Khái quát số hormon steroid 1.1.2 Độc tính số hormon steroid 1.2 Phương pháp xác định số hormon steroid 1.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 1.2.2 Kỹ thuật phân tích .11 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 15 2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 15 2.1.1.1 Thiết bị 15 2.1.1.2 Dụng cụ 15 2.1.2 Dung môi, hóa chất 15 2.1.3 Chất chuẩn 16 2.1.3.1 Chất chuẩn gốc 16 2.1.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2.2 Khảo sát, tối ưu điều kiện phân tích 18 2.2.2.1 Khảo sát, tối ưu điều kiện LC, MS 18 2.2.2.2 Khảo sát, tối ưu điều kiện xử lý mẫu 18 2.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng 19 2.2.3 Xác nhận giá trị sử dụng 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu .19 2.3.2 Phương pháp phân tích thiết bị LC-MS/MS 20 2.3.3 Phương pháp thẩm định .21 ii 2.3.3.1 Tính chọn lọc 21 2.3.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 21 2.3.3.3.Xây dựng đường chuẩn 21 2.3.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 22 2.3.4 Phương pháp lấy mẫu 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời số hormon LC-MS/MS .23 3.1.1 Tối ưu điều kiện phân tích 23 3.1.1.1 Điều kiện khối phổ 23 3.1.1.2 Điều kiện sắc ký lỏng 24 3.1.2 Khảo sát, tối ưu quy trình xử lý mẫu 26 3.1.2.1 Khảo sát ban đầu 26 3.1.2.2 Khảo sát pH 27 3.1.2.3 Khảo sát lượng enzym 28 3.1.2.4 Khảo sát nhiệt độ thủy phân 29 3.1.2.5 Khảo sát thời gian thủy phân 29 3.1.2.6 Khảo sát muối chiết 30 3.1.2.7 Khảo sát thành phần d-SPE 31 3.1.2.8 Đánh giá ảnh hưởng 33 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 34 3.2.1 Độ đặc hiệu 34 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 36 3.2.3 Xây dựng đường chuẩn 37 3.2.4 Độ lặp lại độ thu hồi .40 3.3 Kết xác định hormon steroid sữa sản phẩm sữa .42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Quy định hormon steroid thực phẩm Bảng 1.2 Một số ứng dụng thủy phân hormon steroid enzym Bảng 1.3 Một số kỹ thuật chiết làm 10 Bảng 1.4 Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật QuEChERS 11 Bảng 1.5 Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS 13 Bảng 2.1 Các loại hormon steroid sử dụng nghiên cứu .17 Bảng 3.1 Các điều kiện phân tích hormon steroid LC-MS/MS .23 Bảng 3.2 Các thông số tối ưu MS 24 Bảng 3.3 Kết khảo sát hệ dung môi pha động .25 Bảng 3.5: Số điểm IP hormon steroid 35 Bảng 3.6: Bảng tỷ lệ ion hormon steroid .35 Bảng 3.7 Giá trị LOD LOQ hormon steroid 36 Bảng 3.8 Đường chuẩn, hệ số tương quan hormon steroid mẫu sữa 38 Bảng 3.9 Đường chuẩn, hệ số tương quan hormon steroid mẫu bơ 39 Bảng 3.10 Độ lặp lại độ thu hồi hormon mẫu sữa mức thêm chuẩn 40 Bảng 3.11 Độ lặp lại độ thu hồi hormon mẫu bơ mức thêm chuẩn 41 Bảng 3.13 Tổng hợp kết xác định hormon steroid mẫu sữa bột 43 Bảng 3.14 Tổng hợp kết xác định hormon steroid mẫu sữa dạng lỏng 43 Bảng 3.15 Tổng hợp kết xác định hormon steroid sản phẩm sữa 44 i DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 3.1 Kết khảo sát ban đầu mẫu thực 27 Hình 3.2 Kết khảo sát pH 28 Hình 3.3 Kết khảo sát lượng enzym 28 Hình 3.4 Kết khảo sát nhiệt độ thủy phân .29 Hình 3.5 Kết khảo sát thời gian thủy phân 30 Hình 3.6 Kết khảo sát muối chiết 30 Hình 3.7 Kết khảo sát thành phần d-SPE 31 Hình 3.8 Quy trình chiết hormon steroid mẫu sữa sản phẩm sữa 32 Hình 3.9 Khảo sát ảnh hưởng mẫu sữa đến tín hiệu hormon 33 Hình 3.10 Khảo sát ảnh hưởng mẫu bơ đến tín hiệu hormon 34 Hình 3.11 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn testosteron nồng độ 10 µg/kg mẫu sữa 34 Hình 3.12 Sắc đồ hormon Trenbolon giá trị LOD 37 Hình 3.13 Đường chuẩn hormon sữa, bơ 38 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Acceptable Daily Intake Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân Communities tích thức Collisionally Activated Dissociation Áp suất va chạm Collision energy Năng lượng va chạm CUR Curtain Màn chắn (khí) d-SPE Dispersive solid phase extraction Chiết pha rắn phân tán ELISA Enzym-linked Immune-sorbent Assay Định lượng qua chất gắn miễn dịch kết nối enzyme ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử GC Gas chromatography Sắc ký khí GCB Graphite carbon black Than chì GS1 Ion Source Gas Áp suất khí nguồn tạo ion GS2 Ion Source Gas Áp suất khí nguồn tạo ion HLB Hydrophylic lipophilic balance Cân thân nước, thân dầu IS Internal standard Chất chuẩn nội ISV IonSpray Voltage Thế phun ion ADI AOAC CAD CE LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass Sắc ký lỏng khối phổ hai lần spectrometry LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Qualification Giới hạn định lượng iii Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Matrix effect Ảnh hưởng MRL Maximum residue limit Giới hạn tồn dư tối đa MRM Multi reaction monitoring Kiểm soát đa phản ứng MS Mass spectrometry Khối phổ PSA Primary secondary amines Các amin bậc 1, bậc Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe Nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, ổn định, an toàn Recovery Hiệu suất thu hồi RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn ME QuEChERS R iv ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, sữa sản phẩm từ sữa nhóm sản phẩm phổ biến đời sống , đặc biệt thiếu trẻ em Nó đóng vai trò việc cung cấp dinh dưỡng, đảm bảo cho cho thể phát triển trí tuệ thể chất Tuy nhiên, nhằm tăng lợi nhuận kinh tế, số nhà sản xuất sử dụng hormon để tăng sản lượng thịt sữa dẫn đến việc tồn dư sản phẩm sữa bò gây ảnh hưởng đến sức khỏe người Các hormon steroid (estradiol, melengestrol acetat, progesteron, testosteron, trenbolon) hormon phát thường xuyên sữa bò Estradiol progesteron hormon sinh dục nữ tự nhiên; testosteron hormon sinh dục nam tự nhiên; zeranol, trenbolon melengesterol acetat chất kích thích tăng trưởng tổng hợp Các loại hormon chứng minh gây tác dụng khơng mong muốn người Hiện nay, Việt Nam chưa có quy định giới hạn tồn dư hormon sữa sản phẩm từ sữa chưa có phương pháp thức nhằm xác định đồng thời hormon Do đó, việc xây dựng phương pháp xác định hormon steroid sữa sản phẩm từ sữa cần thiết Vì vậy, đề tài "Xác định đồng thời số hormon steroid sữa sản phẩm từ sữa LC-MS/MS" thực với mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định đồng thời hormon steroid (estron, 17-estradiol, progesteron, testosteron, trenbolon, melengestrol acetat, zeranol) sữa sản phẩm sữa kỹ thuật LC-MS/MS Ứng dụng phương pháp để xác định hormon steroid số đối tượng sữa sản phẩm sữa PROGESTERON MELENGESTROL ACETAT Phụ lục Kết quan trắc gốc khảo sát TRENBOLON 17β-ESTRADIOL PROGESTERON TESTOSTERON ESTRON MELENGESTROL ACETAT ZERANOL Phụ lục 10 Kết quan trắc gốc mẫu sữa sản phẩm sữa Phụ lục 11 Danh sách mã hóa mẫu phân tích STT Tên mẫu Mã hóa mẫu Địa điểm mua mẫu Sữa bột Frisolac gold M1 chợ Phùng Khoang- Cầu Giấy- Hà Nội Sữa bột Mother M2 chợ Phùng Khoang- Cầu Giấy- Hà Nội Sữa bột Glico số M3 Sữa bột IQ lac pro 1-10T M4 Sữa bột Mega care IQ M5 Sữa bột similac IQ M6 Sữa bột Grow A+ M7 Sữa bột XO 2-15t M8 Sữa bột Babicare M9 10 Sữa bột meiji M10 11 Sữa Dutch lady có đường M11 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 12 Sữa ADM Gold M12 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 13 Sữa milo M13 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội chợ Phùng Khoang- Cầu Giấy- Hà Nội chợ Phùng Khoang- Cầu Giấy- Hà Nội chợ Phùng Khoang- Cầu Giấy - Hà Nội chợ Phùng Khoang- Cầu Giấy - Hà Nội chợ Phùng Khoang- Cầu Giấy - Hà Nội chợ Phùng Khoang- Cầu Giấy - Hà Nội chợ Phùng Khoang- Cầu Giấy - Hà Nội chợ Phùng Khoang- Cầu Giấy - Hà Nội Tên mẫu STT 14 Sữa tươi vinamilk tiệt trùng có đường Mã hóa mẫu M14 Địa điểm mua mẫu Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 15 Dutch lady hương dâu M15 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 16 Sữa ovantine M16 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 17 Sữa tươi Ba tiệt trùng M17 18 Sữa tươi Ba trùng khơng đường M18 19 20 Sữa bò trùng Ất Thảo Sữa dê trùng Ất Thảo M19 M20 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội Cửa hàng sữa Ất Thảo – Trần BìnhCầu Giấy - Hà Nội Cửa hàng sữa Ất Thảo – Trần BìnhCầu Giấy - Hà Nội 21 Sữa chua peptit M21 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 22 Sữa chua vinamilk M22 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 23 Sữa chua Ba Vì M23 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 24 Sữa chua TH true milk M24 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 25 Sữa chua Blédilacte M25 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 26 Váng sữa monte M26 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 27 Váng sữa Nestly M27 28 Váng sữa Aprikose M28 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội Tên mẫu STT Mã hóa mẫu Địa điểm mua mẫu Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn 29 Váng sữa Nestly vị vani M29 30 Váng sữa Hoff M30 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 31 Bơ Mezan M31 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 32 Bơ TH M32 33 Bơ Autralia M33 34 Pho mai Anchor M34 35 Pho mai Cream cheere M35 36 Pho mai Toast M36 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 37 Pho mai Cheddar M37 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 38 Pho mai Emmental M38 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 39 Pho mai Belcube M39 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội 40 Pho mai Teama M40 Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Dỗn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội Cửa hàng tạp hóa Chợ Nhỏ - Doãn Kế Thiện - Cầu Giấy - Hà Nội ... 18; 22 giờ) - Khảo sát muối chi t: tiến hành khảo sát loại hỗn hợp muối chi t khác Muối chi t 1: g MgSO4 khan, g NaCl Muối chi t 2: g MgSO4 khan, 1,5 g CH3COONa Muối chi t 3: g MgSO4 khan, g NaCl,... xử lý Nguồn - Chi t: MeOH -Làm sạch: cột GCB, amino [29] - Chi t: MeOH - Làm sạch: cột HLB, amino-propyl, silica [32] - Chi t: TBME (tertbutylmethyl ether) - Làm sạch: cột C18 - Chi t: diethyl... Kỹ thuật làm mẫu thường sử dụng sau chi t hormon từ sữa nguyên liệu sữa kỹ thuật chi t pha rắn (SPE) Chi t pha rắn kỹ thuật phổ biến áp dụng để làm mẫu Dịch chi t mẫu đưa qua cột SPE hoạt hóa,