Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ươngNghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ươngNghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ươngNghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ươngNghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ươngNghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ươngNghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ươngNghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ươngNghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ươngNghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ươngNghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng Phospholipid tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Vũ Đức Quang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ XÉT NGHIỆM ĐÔNG MÁU VÀ XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƢƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Vũ Đức Quang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ XÉT NGHIỆM ĐÔNG MÁU VÀ XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƢƠNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: TS Trần Thị Kiều My Hƣớng dẫn 2: TS Nguyễn Thị Trung Hà Nội - 2019 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan nghiên cứu thân Các số liệu luận văn có thật, thu thập thực Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng cách trung thực, khoa học xác Kết luận văn chƣa đƣợc đăng tải tạp chí hay cơng trình khoa học Tác giả Vũ Đức Quang Lời cảm ơn Để hồn thành luận văn này, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám đốc, Phòng Đào tạo, Khoa Cơng nghệ sinh học, Học viện Khoa học Công nghệ Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu TS Trần Thị Kiều My TS Nguyễn Thị Trung, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn chia sẻ cho kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô quý giá suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn TS Bạch Quốc Khánh, Viện trưởng Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, PGS.TS Chu Hoàng Hà, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, người thầy động viên khuyến khích, bảo tận tình cho điều kiện tốt để học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn ThS Đào Thị Thiết, CN Nguyễn Thị Thanh Hương toàn thể bác sĩ nhân viên khoa Đông máu, Tế bào – Tổ chức học, phòng Kế hoạch Tổng hợp khoa lâm sàng tạo điều kiện cho tơi q trình học tập, giúp đỡ tơi trình lấy bệnh phẩm, định làm xét nghiệm Xin cảm ơn bệnh nhân hợp tác tạo điều kiện cho lấy mẫu bệnh phẩm để nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn người bạn, người bên suốt hai năm học tập Cuối cùng, vô biết ơn cha mẹ, vợ con, người thân gia đình ln quan tâm, động viên, khích lệ nguồn sức mạnh, chỗ dựa vững để tơi vượt qua khó khăn, khơng ngừng phấn đấu suốt q trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2019 Vũ Đức Quang Các chữ viết tắt Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt a CL Anti Cardiolipin Kháng Cardiolipin a GPI Anti β2 - glycoprotein I Kháng β2 - glycoprotein I APS Anti Phospholipid Syndrome APTT Activated partial thromboplastin time β2 - glycoprotein I Hội chứng kháng phospholipid Thời gian Thromboplastin hoạt hoá phần β2 - glycoprotein I Bệnh nhân Thời gian Stypven β2GPI BN dRVVT Dilute Russell’s Viper Venom Time Fib Fibrinogen INR International Normalized Ratio Fibrinogen Tỷ lệ chuẩn hố quốc tế Kháng đơng khơng phụ thuộc KDKPT LA Lupus AntiCoagulant Kháng đông lupus PL Phospholipid Phospholipid PT Prothrombin Time Thời gian Prothrombin rAPTT Tỷ lệ APTT bệnh/chứng SCT Ratio Activated partial Thromboplastin Time Silica cloting Time Thời gian đông máu Silica SLE System Lupus Erythematosus Lupus ban đỏ hệ thống TT Thrombin Time Thời gian Thrombin Danh mục bảng Bảng 2.1 Tiêu chuẩn giá trị xét nghiệm thực nghiên cứu 29 Bảng 3.1 Xếp loại bệnh tật nhóm bệnh nhân nghiên cứu 36 Bảng 3.2 So sánh giá trị trung bình số số xét nghiệm đông cầm máu theo giá trị xét nghiệm LA 41 Bảng 3.3 Đặc điểm số rAPTT theo giá trị xét nghiệm LA 42 Bảng 3.4 Đặc điểm số xét nghiệm INR theo giá trị xét nghiệm LA 43 Bảng 3.5 Đặc điểm số xét nghiệm rTT theo giá trị xét nghiệm LA 44 Bảng 3.6 Đặc điểm số xét nghiệm D-Dimer theo giá trị xét nghiệm LA 44 Bảng 3.7 Đặc điểm số lƣợng tiểu cầu theo giá trị xét nghiệm LA 45 Bảng 3.8 Đặc điểm xét nghiệm Fib theo giá trị xét nghiệm LA 46 Bảng 3.9 Đặc điểm xét nghiệm KĐKPT theo giá trị LA 46 Bảng 3.10 So sánh giá trị trung bình số số xét nghiệm đông máu theo giá trị xét nghiệm aCL 47 Bảng 3.11 Đặc điểm số rAPTT theo giá trị xét nghiệm aCL 49 Bảng 3.12 Đặc điểm số xét nghiệm INR theo giá trị xét nghiệm aCL 49 Bảng 3.13 Đặc điểm số xét nghiệm rTT theo giá trị xét nghiệm aCL 50 Bảng 3.14 Đặc điểm số D-Dimer theo giá trị xét nghiệm aCL 50 Bảng 3.15 Đặc điểm số lƣợng tiểu cầu theo giá trị xét nghiệm aCL 51 Bảng 3.16 Đặc điểm xét nghiệm Fib theo giá trị xét nghiệm aCL 52 Bảng 3.17 Đặc điểm xét nghiệm KĐKPT theo giá trị xét nghiệm aCL 52 Bảng 3.18 So sánh giá trị trung bình số số xét nghiệm đơng máu theo giá trị xét nghiệm aGPI 53 Bảng 3.19 Đặc điểm số rAPTT theo giá trị xét nghiệm aGPI 54 Bảng 3.20 Đặc điểm số xét nghiệm INR theo giá trị xét nghiệm aGPI 55 Bảng.3.21 Đặc điểm số xét nghiệm rTT theo giá trị xét nghiệm aGPI 55 Bảng 3.22 Đặc điểm số D-Dimer theo giá trị xét nghiệm aGPI 56 Bảng 3.23 Đặc điểm số lƣợng tiểu cầu theo giá trị xét nghiệm aGPI 57 Bảng 3.24 Đặc điểm xét nghiệm Fib theo giá trị xét nghiệm aGPI 57 Bảng 3.25 Đặc điểm xét nghiệm KĐKPT theo giá trị xét nghiệm aGPI 58 Bảng 3.26 So sánh giá trị trung bình số số xét nghiệm đơng cầm máu theo số lƣợng kháng thể aPL dƣơng tính 59 Bảng 3.27 Đặc điểm số xét nghiệm rAPTT theo số lƣợng kháng thể aPL dƣơng tính 60 Bảng 3.28 Đặc điểm số xét nghiệm INR theo số lƣợng kháng thể aPL dƣơng tính 61 Bảng 3.29 Đặc điểm số xét nghiệm rTT theo số lƣợng kháng thể aPL dƣơng tính 61 Bảng 3.30 Đặc điểm số xét nghiệm D-Dimer theo số lƣợng kháng thể aPL dƣơng tính 62 Bảng 3.31 Đặc điểm số lƣợng tiểu cầu theo số lƣợng kháng thể aPL dƣơng tính 62 Bảng 3.32 Đặc điểm xét nghiệm Fib theo số lƣợng kháng thể aPL 63 dƣơng tính 63 Bảng 3.33 So sánh giá trị trung bình xét nghiệm rAPTT 64 Bảng 3.34 So sánh xét nghiệm KĐKPT trƣớc sau 12 tuần 65 Bảng 3.35 Diễn biến kháng thể LA sau 12 tuần 66 Bảng 3.36 Diễn biến kháng thể aCL sau 12 tuần 66 Bảng 3.37 Diễn biến kháng thể aGPI sau 12 tuần 66 Bảng 3.38 So sánh giá trị trung bình kháng thể aCL aGPI sau 12 tuần 67 Danh mục hình Hình 1.1: Sơ đồ chế đông máu huyết tƣơng 10 Hình 1.2: Quá trình tiêu sợi huyết 12 Hình 3.1: Biểu đồ đặc điểm tuổi nhóm bệnh nhân nghiên cứu 34 Hình 3.2: Biểu đồ tỷ lệ nam/nữ nhóm bệnh nhân nghiên cứu 35 Hình 3.3: Biểu đồ số lƣợng bệnh nhân dƣơng tính với loại kháng thể 37 Hình 3.4: Biểu đồ tỷ lệ xuất kháng thể theo nhóm bệnh 38 Hình 3.5: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo số lƣợng kháng thể đồng thời xuất 39 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SINH LÝ ĐÔNG CẦM MÁU 1.1.1 Những yếu tố tham gia hoạt hoá trình đơng-cầm máu 1.1.2 Các giai đoạn chế đông-cầm máu 1.1.2.1 Giai đoạn cầm máu ban đầu: 1.1.2.2 Giai đoạn đông máu huyết tương 1.1.2.3 Giai đoạn tiêu sợi huyết 12 1.2 ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID VÀ NGUYÊN LÝ XÉT NGHIỆM 13 1.2.1 Kháng thể Lupus AntiCoagulant (LA) 13 1.2.1.1 Đặc điểm kháng thể LA 13 1.2.1.2 Nguyên lý xét nghiệm LA 14 1.2.2 Kháng thể Anti Cardiolipin (aCL) 15 1.2.2.1 Đặc điểm kháng thể aCL 15 1.2.2.2 Nguyên lý xét nghiệm Anti Cardiolipin 16 1.2.3 Kháng thể Anti β2-Glycoprotein (aGPI) 16 1.2.3.1 Đặc điểm kháng thể Anti β2-Glycoprotein (aGPI) 16 1.2.3.2 Nguyên lý xét nghiệm anti β2-glycoprotein 16 1.3 HỘI CHỨNG ANTI PHOSPHOLIPID 17 1.3.1 Lịch sử phát 17 1.3.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán 17 1.3.3 Xếp loại hội chứng Antiphospholipid 18 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 19 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 22 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu 22 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 22 2.2.2 Chọn mẫu 22 2.2.3 Vật liệu nghiên cứu 23 2.2.3.1 Bệnh phẩm 23 2.2.3.2 Phương tiện, dụng cụ nghiên cứu 23 2.2.3.3 Hóa chất - sinh phẩm 23 2.3 CÁC TIÊU CHUẨN ÁP DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 29 2.3.1 Tiêu chuẩn giá trị xét nghiệm 29 2.3.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán APS 30 2.4 CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH XÉT NGHIỆM 31 2.5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 31 2.6 PHÂN TÍCH, XỬ LÝ SỐ LIỆU 32 2.7 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU 34 3.1.1 Đặc điểm tuổi 34 3.1.2 Đặc điểm giới 35 3.1.3 Xếp loại bệnh tật nhóm bệnh nhân nghiên cứu 36 3.2 ĐẶC ĐIỂM XÉT NGHIỆM ĐÔNG MÁU VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID 37 3.2.1 Đặc điểm xuất kháng thể kháng phospholipid (aPL) 37 3.2.1.1 Đặc điểm xuất loại kháng thể aPL nhóm bệnh nhân nghiên cứu 37 3.2.1.2 Sự phân bố kháng thể theo chẩn đoán bệnh 38 3.2.1.3 Đặc điểm số lượng kháng thể aPL đồng thời xuất 39 3.2.2 Đặc điểm số xét nghiệm đông máu liên quan tới xuất kháng thể kháng phospholipid 40 3.2.2.1 Đặc điểm số xét nghiệm đông máu theo giá trị xét nghiệm Lupus Anticoagulant (LA) 41 3.2.2.2 Đặc điểm số số đông cầm máu theo giá trị xét nghiệm aCL 47 3.2.2.3 Đặc điểm số số đông cầm máu theo giá trị xét nghiệm aGPI 53 3.2.2.4 Đặc điểm số xét nghiệm đông máu theo số lượng kháng thể kháng phospholipid dương tính 59 3.3 KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC KHÁNG THỂ SAU 12 TUẦN Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN 63 3.3.1 Diễn biến xét nghiệm rAPTT KĐKPT sau 12 tuần 64 3.3.2 Diễn biến kháng thể LA sau 12 tuần 65 3.3.3 Diễn biến kháng thể aCL aGPI sau 66 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 4.1 KẾT LUẬN 68 4.1.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu 68 4.1.2 Đặc điểm xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid (aPL) xét nghiệm đông máu khác 68 4.1.3 Diễn biến động học kháng thể aPL sau 12 tuần 69 4.2 KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤC LỤC MỞ ĐẦU Hội chứng Antiphospholipid (APS - Antiphospholipid Syndrome) bệnh lý tự miễn đƣợc mô tả huyết khối động tĩnh mạch tái diễn sảy thai nhiều lần với có mặt kháng thể kháng phospholipid [1] Xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid tiêu chuẩn bắt buộc chẩn đoán hội chứng Antiphospholipid Sự xuất kháng thể kháng phospholipid (bao gồm kháng đông lupus (LA), kháng thể kháng β2glycoprotein, kháng thể kháng cardiolipin) có vai trò chẩn đốn APS Mặt khác, kháng thể kháng phospholipid gặp số bệnh lý tự miễn, nhiễm trùng, ung thƣ (có thể gây APS thứ phát) [1] Các nghiên cứu kháng thể kháng phospholipid năm đầu kỷ 20 Trải qua gần 100 năm, nhà khoa học ngày tìm đƣợc nhiều loại kháng thể kháng phospholipid nhƣ chứng minh đƣợc vai trò loại kháng thể với xuất huyết khối sảy thai liên tiếp Năm 1997, lần công bố xếp loại hội chứng Antiphospholipid, sau tiêu chuẩn chẩn đoán, xếp loại điều trị APS ngày đƣợc hồn thiện Ba loại kháng thể có vai trò quan trọng đƣợc đề cập tới kháng đơng lupus (LA), kháng thể kháng β2 - glycoprotein (a GPI), kháng thể kháng cardiolipin (a CL) Các xét nghiệm xác định kháng thể nêu đƣợc đƣa vào tiêu chuẩn chẩn đốn bệnh đồng thời có ý nghĩa theo dõi động học đáp ứng điều trị APS [1] Trên giới có nhiều nghiên cứu APS sảy thai liên tiếp Theo thống kê, APS nguyên nhân khoảng 20% phụ nữ có sảy thai liên tiếp Một số nghiên cứu tình trạng sảy thai hay dấu hiệu lâm sàng APS đƣợc tiến hành Việt Nam Theo nghiên cứu Bệnh viện Phụ sản Trung ƣơng, có đến 47,9% sản phụ có tiền sử sảy thai liên tiếp có dƣơng tính ba loại kháng thể kháng phospholipid Tỷ lệ dƣơng tính với loại kháng thể khác [2] Tại viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng, xét nghiệm phát chất kháng đông lupus (LA), kháng thể kháng β2 Glycoprotein, kháng thể kháng Cardiolipin đƣợc thực thƣờng quy với bệnh nhân có nghi ngờ kháng thể kháng phospholipid lƣu hành Tại Việt Nam, nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm xét nghiệm đông máu kháng thể kháng phospholipid chƣa nhiều Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đặc điểm số xét nghiệm đông máu xét nghiệm kháng thể kháng phospholid với hai mục tiêu: Nghiên cứu đặc điểm số xét nghiệm đông máu xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid bệnh nhân khám điều trị Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương giai đoạn 2017-2018 Bước đầu khảo sát diễn biến động học xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid số bệnh nhân sau 12 tuần CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SINH LÝ ĐƠNG CẦM MÁU Đơng cầm máu thay đổi tình trạng vật lý máu để chuyển loại protein hòa tan thành dạng gel rắn sợi huyết nhằm mục đích lấp chỗ tổn thƣơng thành mạch hạn chế máu đồng thời tham gia trì tình trạng lỏng máu [3] Q trình đơng cầm máu bao gồm tác động qua lại mật thiết ba thành phần: Thành mạch, tế bào máu protein huyết tƣơng hoạt động dƣới hình thức phản ứng men Quá trình hoạt động theo yêu cầu bị điều hòa yếu tố thần kinh thể dịch [3] Trong thể có cân hai hệ thống: Làm đơng máu chống lại q trình đơng máu Một hệ thống mang tính bảo vệ thể tránh chảy máu, hệ thống đóng vai trò gìn giữ lƣu thơng lòng mạch để ln bảo đảm tuần hồn trì sống Mất cân hai hệ dẫn đến hậu làm tắc mạch chảy máu [3][4] 1.1.1 Những yếu tố tham gia hoạt hố q trình đông-cầm máu Nội mạc dƣới nội mạc huyết quản: Khi có tổn thƣơng thành mạch làm lớp dƣới nội mạc tiếp xúc với máu hoạt hoá tiểu cầu yếu tố tiếp xúc Tiểu cầu: Chức dƣỡng mạch, tạo nút tiểu cầu mà vấn đề cho chức phản ứng: Dính, giải phóng, ngƣng tập tiểu cầu, làm co mạch chỗ tổn thƣơng tham gia vào q trình đơng máu ảnh hƣởng đến trình tiêu sợi huyết [3] Dính tiểu cầu: Sau mạch máu bị tổn thƣơng, tiểu cầu dính vào tổ chức liên kết dƣới nội mạc Chức dựa vào phần yếu tố von-Willebrand huyết tƣơng Dính tiểu cầu phụ thuộc vào glycoprotein màng tiểu cầu Phản ứng giải phóng: Collagen thrombin tác động đến giải phóng chất từ hạt tiểu cầu có ADP, serotonin, fibrinogen, lysosoman, enzym yếu tố tiểu cầu (yếu tố chống heparin) collagen thrombin hoạt hố tiểu cầu tổng hợp prostaglandin dẫn đến hình thành chất không ổn định thromboxan A2 làm giảm AMP vòng tiểu cầu bắt đầu phản ứng giải phóng Phản ứng giải phóng bị ức chế chất có tác dụng làm tăng AMP vòng tiểu cầu, prostaglandin prostacyclin (PGI2) đƣợc tổng hợp dƣới nội mạc [3] Ngưng tập tiểu cầu: ADP thromboxan A2 đƣợc giải phóng tạo đám dính tiểu cầu chỗ thành mạch bị tổn thƣơng ADP làm cho tiểu cầu trƣơng lên màng tiểu cầu kề dính chặt vào nhau, nhƣ phản ứng giải phóng tiếp ADP thromboxan A2 dẫn đến ngƣng tập thứ phát kết dính tiểu cầu hình thành khối tiểu cầu đủ lớn để nút vùng nội mạc bị tổn thƣơng Các yếu tố đông máu huyết tƣơng: Các yếu tố đông máu glycoprotein, phƣơng diện chức chúng thuộc nhóm khác tuỳ theo chúng zymogen, đồng yếu tố chất nhƣ fibrinogen Tám yếu tố zymogen nghĩa protein có khả chuyển thành chất có hoạt tính enzym Yếu tố XIII zymogen transglutaminase Prekallikrein yếu tố XII, XI, IX, X, VII, II zymogen serin protease [3] - Yếu tố tổ chức: Sự tiếp xúc máu với tổ chức dập nát phát động q trình đơng máu, khởi phát lipoprotein gọi yếu tố tổ chức hay thromboplastin ngoại sinh Các phần lipid protein yếu tố tổ chức cần thiết cho đơng máu nhƣng tính đặc hiệu nằm phần protein Yếu tố tổ chức khơng có hoạt tính enzym nhƣng tác động nhƣ đồng yếu tố hoạt hoá yếu tố VII, X - Ion canxi: Ion canxi tạo thuận lợi cho protein phụ thuộc vitamin K kết hợp với phospholipid Những ion can thiệp vào phản ứng khơng có liên quan đến protein phụ thuộc vitamin K cần thiết cho thể hoạt tính enzym yếu tố XIIIa, cho ổn định yếu tố V phức hệ yếu tố vonWillebrand yếu tố VIII: C Bảng 1.1: Các yếu tố đông máu huyết tƣơng Tên gọi cũ Tên gọi Yếu tố I Fibrinogen Yếu tố II Prothrombin Yếu tố III Yếu tố tổ chức, Thromboplastin Yếu tố IV Ion Canxi (hiện không xếp vào yếu tố đông máu) Yếu tố V Proaccelerin, Plasma Accelerator Globulin Yếu tố VII Proconvertin Yếu tố VIII Yếu tố chống Hemophilia A Yếu tố IX Yếu tố chống Hemophilia B, Yếu tố Christmas Yếu tố X Yếu tố Stuart Yếu tố XI Yếu tố chống Hemophilia Thromboplastin Antecedent Yếu tố XII Yếu tố Hageman, yếu tố tiếp xúc Yếu tố XIII Yếu tố ổn định sợi huyết Prekallikrein Yếu tố Fletiểu cầuher High Molecular Weigh Kininogen (H.M.W.K) Yếu tố Fitzgerald C, Plasma 1.1.2 Các giai đoạn chế đông-cầm máu 1.1.2.1 Giai đoạn cầm máu ban đầu: Xảy thành mạch bị tổn thƣơng Khi thành mạch bị tổn thƣơng, lớp dƣới nội mạc bị bộc lộ tiểu cầu dính vào lớp dƣới nội mạc với có mặt yếu tố von-Willebrand yếu tố tiểu cầu GPIb + Tiểu cầu dính vào tổ chức dƣới nội mạc giải phóng sản phẩm ADP, serotonin, epinephrin dẫn xuất prostaglandin, đặc biệt thromboxan A2 Một số sản phẩm thúc đẩy trình ngƣng tập tiểu cầu + Các tiểu cầu dính vào nhau, kết hình thành nút tiểu cầu mà kết dính tiểu cầu vào lớp dƣới nội mạc Nút tiểu cầu nhanh chóng lớn lên mặt thể tích sau vài phút hoàn thành nút chỗ mạch máu bị tổn thƣơng Đây trình phức tạp với phản ứng co mạch, kết dính tiểu cầu, phản ứng giải phóng, ngƣng tập tiểu cầu làm hoạt hố q trình đơng máu Yếu tố tiểu cầu phospholipid bề mặt đƣợc bộc lộ nút tiểu cầu hình thành tham gia thúc đẩy q trình đơng máu Nút tiểu cầu ban đầu đảm bảo cầm máu tạm thời mạch máu nhỏ Để cầm máu mạch máu lớn bị tổn thƣơng cần phải có hình thành cục đơng qua bƣớc q trình đơng máu với tham gia yếu tố đông máu huyết tƣơng [3] 1.1.2.2 Giai đoạn đơng máu huyết tương Sự hoạt hố đơng máu phát động đƣờng nội sinh tiếp xúc máu với bề mặt mang điện tích âm (cấu trúc dƣới nội mạc huyết quản in vivo, thuỷ tinh kaolin in vitro), đƣờng ngoại sinh can thiệp yếu tố tổ chức Cả hai đƣờng dẫn đến hoạt hoá yếu tố X thành Xa, yếu tố tác động biến prothrombin thành thrombin - enzym xúc tác chuyển fibrinogen thành fibrin Yếu tố XIII có nhiệm vụ ổn định fibrin đƣợc tạo thành Các sợi fibrin tạo thành dạng lƣới chứa đám dính tiểu cầu chỗ tổn thƣơng, nút tiểu cầu ban đầu không bền vững thành vững cuối cục máu ổn định có đủ khả cầm máu Cả dòng thác phản ứng enzym với có mặt yếu tố đông máu xảy chỗ tổn thƣơng Trừ fibrinogen, yếu tố đông máu khác tiền enzym đồng yếu tố Tất enzym, trừ yếu tố XIII, serin protease tức chất có khả thuỷ phân dây peptid Đây hệ thống hoạt động mạnh: Chỉ cần phân tử gam yếu tố XI hoạt hoá, liên tục hoạt hố yếu tố IX, X prothrombin để đến hình thành x108 phân tử gam fibrin [4] Hình 1.1: Sơ đồ chế đơng máu huyết tương (Nguồn: Nguyễn Anh Trí, 2008, Chỉ định xét nghiệm đông máu hợp lý, Đông máu ứng dụng lâm sàng; NXB Y học, Tr.191) Quá trình đơng máu huyết tƣơng chia thành thời kỳ: a Hình thành thromboplastin hoạt hố - Theo đường nội sinh Năm protein gồm yếu tố XII, prekallikrein, yếu tố XI, kininogen trọng lƣợng phân tử cao (H.M.W.K) chất ức chế CI yếu tố định q trình hoạt hố ức chế giai đoạn tiếp xúc đông máu Thành mạch bị tổn thƣơng kích thích hoạt hố bốn yếu tố nhóm tiếp 10 xúc XII, XI, prekallikrein, H.M.W.K làm hoạt hoá yếu tố IX Sự hoạt hoá yếu tố X đƣợc thực với tham gia phức hợp bao gồm enzym (yếu tố IXa), đồng yếu tố (yếu tố VIII: C), ion Ca ++ phospholipid tiểu cầu, cuối hình thành thromboplastin (prothrombinase) Yếu tố IXa không giới hạn tác dụng enzym yếu tố X, mà có khả hoạt hố yếu tố VII tạo nên mối liên hệ đƣờng nội sinh ngoại sinh - Theo đường ngoại sinh: Yếu tố tổ chức (các lipoprotein từ tổ chức bị tổn thƣơng) hoạt hoá yếu tố VII Yếu tố trực tiếp hoạt hoá yếu tố X Tổ chức tổn thƣơng, chất hoạt hoá tổ chức hoạt hoá đơng máu đến hình thành fibrin thúc đẩy nhanh đƣờng nội sinh hoạt hoá đồng yếu tố VIII V b Hình thành thrombin Thromboplastin hoạt hoá (phức hợp prothrombinase) nội sinh ngoại sinh tác động chuyển prothrombin thành thrombin Thrombin đóng vai trò quan trọng phản ứng q trình đơng máu, ảnh hƣởng đến nhiều chất can thiệp vào nhiều khâu, chủ yếu chìa khố hình thành fibrin: + Thrombin chuyển fibrinogen thành fibrin, hoạt hoá yếu tố XIII làm ổn định sợi huyết tự làm tăng tốc độ hình thành thrombin + Thrombin hoạt hoá yếu tố VIII: C yếu tố VIII làm gia tốc hình thành yếu tố Xa hai đƣờng nội sinh ngoại sinh, đồng thời hoạt hoá yếu tố V làm tăng hoạt hoá prothrombin yếu tố Xa + Thrombin tác động lên tế bào nhƣ chất kích tập tiểu cầu mạnh cách cố định lên hoạt hoá tế bào Bị tác động, tế bào nội mạc tăng sản xuất prostacyclin có tác dụng ức chế chất hoạt hoá plasminogen Thrombin cố định lên nguyên bào xơ (fibroblast) kích thích tế bào tăng sinh 11 c Hình thành fibrin Thrombin tác động thuỷ phân fibrinogen thành fibrinopeptid A B (dạng fibrin monomer) Với thay đổi điện tích xuất lực hút tĩnh điện, fibrin monome trùng hợp thành fibrin polymer Yếu tố XIII đƣợc hoạt hoá thrombin có ion Ca++ làm ổn định Fibrin polymer Fibrin đƣợc ổn định có đặc tính cầm máu nghĩa có khả bịt vết thƣơng thành mạch làm ngƣng chảy máu Cục sợi huyết khối gel hoá đƣợc tạo thành lƣới fibrin đƣờng kính khoảng μm Mạng lƣới bao bọc hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu Một protein tiểu cầu actomyosin tác động làm cục máu co lại 1.1.2.3 Giai đoạn tiêu sợi huyết Mục đích trình tiêu sợi huyết làm tan fibrin trả lại thơng thống cho mạch máu Hoạt hoá nội sinh XIIa Kallikrein Hoạt hoá ngoại sinh Streptokinase Plasminogen tPA Urokinase Plasmin Fibrin Fibrinogen Mảnh X Mảnh Y + D Mảnh E + D Hình 1.2: Q trình tiêu sợi huyết (Nguồn: Nguyễn Anh Trí cộng sự, 2012, Cơ chế đông cầm máu, Huyết học - truyền máu bản, NXB Y học, tr 57-67) 12 Tiêu sợi huyết phản ứng bình thƣờng thành mạch bị tổn thƣơng Plasminogen globulin dạng tiền enzym máu dịch tổ chức, đƣợc chuyển thành dạng enzym tiêu protein plasmin, từ đƣợc phóng thích từ thành mạch (hoạt hố nội sinh) tổ chức (hoạt hoá ngoại sinh) Hoạt hoá trình tiêu sợi huyết phần lớn theo sau giải phóng chất hoạt hố plasminogen từ tổ chức (tPA) từ tế bào nội mạc [3] Plasmin có hoạt tính rộng thrombin: Có thể tiêu fibrinogen, fibrin, yếu tố V, VIII nhiều protein khác Chất hoạt hoá plasminogen tổ chức bị ức chế PAI 1, plasmin tuần hoàn bị ức chế 2 Antiplasmin 2 macroglobulin 1.2 ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID VÀ NGUYÊN LÝ XÉT NGHIỆM Phospholipid (PL): Là thành phần quan trọng tạo nên màng tế bào PL chủ yếu đƣợc tạo nên từ acid béo cần thiết tồn dƣới dạng phức hợp acid béo phần tử chứa phospho (nhƣ serine choline) Phospholipid tham gia vào số giai đoạn thác đông máu huyết tƣơng (sơ đồ 1), đặc biệt tham gia vào q trình đơng máu nội sinh Do đó, xuất kháng thể kháng Phospholipid ảnh hƣởng đến q trình đơng cầm máu thể [1] [3][5][6][7] Các kháng thể Anti-phospholipid (Antiphospholipid Antibodies - kháng thể kháng phospholipid) thuật ngữ chung để nhóm tự kháng thể chống phospholipid phức hệ protein-phospholipid Mỗi loại kháng thể kháng thể kháng phospholipid có tên gọi tƣơng ứng với protein gắn phospholipid Dƣới ba loại kháng thể có vai trò quan trọng nhóm kháng thể kháng phospholipid [1] 1.2.1 Kháng thể Lupus AntiCoagulant (LA) 1.2.1.1 Đặc điểm kháng thể LA LA Imunoglobulin có khả ức chế phản ứng q trình đơng máu có phụ thuộc phospholipid nhƣ APTT, thời gian Kaolin (kaolin clotting time = KCT), thời gian Stypven (dRVVT) Tuy nhiên LA lại 13 khơng có khả ức chế hoạt tính yếu tố đơng máu đặc hiệu [1] Cho đến nay, nhiều vấn đề xung quanh LA chƣa đƣợc làm rõ Ngƣời ta cho rằng: Kháng thể LA hình nhƣ tồn dƣới dạng đa kháng thể, dạng kháng thể đơn lẻ Bởi vậy, bệnh nhân có LA, khơng có nghĩa bệnh nhân bị SLE (lupus ban đỏ hệ thống); bệnh nhân bị SLE có chất ức chế đơng máu nhƣng khơng LA mà chất ức chế đơng máu khác [6][8] LA có mối liên hệ với huyết khối; có triệu chứng huyết khối nhƣng thời gian đơng máu bệnh nhân kéo dài Có thể tìm thấy LA bệnh nhân bị bệnh lý tự miễn, bệnh lý tổ chức liên kết, nhƣ SLE: Thậm chí có tỷ lệ gặp LA dƣới 1% ngƣời bình thƣờng cộng đồng [8][9] 1.2.1.2 Nguyên lý xét nghiệm LA Có nhiều kỹ thuật xét nghiệm LA Tuy nhiên kỹ thuật dựa nguyên lý chung là: Tiến hành sàng lọc LA kỹ thuật đo thời gian đơng với phospholipid pha lỗng sau khẳng định có mặt LA kỹ thuật đo thời gian đông với phospholipid nồng độ cao [10][11][12][13] Các kháng thể LA đƣợc xác định khả kéo dài xét nghiệm phụ thuộc phospholipid nhƣ APTT, SCT, dRVVT [14] Xét nghiệm dRVVT screen dRVVT confirm thuốc thử đƣợc phát triển nhằm đơn giản hóa chuẩn hóa việc phát LA đánh giá lâm sàng Trong lọ dRVVT Screen chế phẩm đông khô chứa nọc rắn Russell, lƣợng nhỏ phospholipid, canxi, polybrene, đệm, chất ổn định, chất tạo màu chất bảo quản Trong lọ dRVVT Confirm chế phẩm đông khô chứa nọc rắn Russell, lƣợng lớn phospholipid, canxi, polybrene, đệm, chất ổn định, chất tạo màu chất bảo quản 14 Lƣợng phospholipid hoá chất xét nghiệm dRVVT screen thấp làm cho nhạy với LA Lƣợng phospholipid hoá chất dRVVT confirm nhiều làm cho thời gian đơng máu ngắn hơn, từ khẳng định bệnh nhân có LA [15][16][17][18] Nọc rắn Russell, với canxi trực tiếp kích hoạt yếu tố X (trong mẫu xét nghiệm) Do đó, Xét nghiệm dRVVT screen dRVVT confirm không bị ảnh hƣởng yếu tố bất thƣờng yếu tố tiếp xúc, yếu tố VII, VIII IX chất ức chế Heparin đƣợc trung hòa polybrene lên đến U/mL Chính vậy, xét nghiệm dRVVT screen dRVVT confirm đánh giá LA cụ thể hơn APTT [19][20][21][22][23] 1.2.2 Kháng thể Anti Cardiolipin (aCL) 1.2.2.1 Đặc điểm kháng thể aCL Cardiolipin loại phospholipid tích điện âm, chủ yếu khu trú nhiều màng bên ty lạp thể Kháng thể chống Cardiolipin (Anti Cardiolipin Antibody – aCL): Đã từ lâu ngƣời ta phát thấy aCL máu bệnh nhân bị nhiễm trùng, nhƣ bệnh giang mai (thậm chí aCL đƣợc sử dụng xét nghiệm lâm sàng bệnh giang mai) Tuy nhiên, aCL đƣợc tìm thấy máu bệnh nhân mắc bệnh lý tự miễn, nhƣ bệnh lupus ban đỏ hệ thống (SLE) [1] [23] Qua cho thấy có hai loại aCL: + aCL gặp bệnh giang mai, loại kháng thể phospholipid đơn độc (cụ thể Cardiolipin) + aCL khác, gặp bệnh tự miễn - loại kháng thể phức hợp phospholipid β2GPI (hoặc protein gắn phospholipid khác) Năm 1990, Matsuura E công bố thử nghiệm cho thấy: Hiệu giá kháng thể aCL bệnh SLE tăng lên bổ sung β2GPI, nhƣng bệnh giang mai hiệu giá aCL lại giảm thêm β2GPI 15 Các nghiên cứu khơng có tƣơng quan aCL bệnh nhiễm trùng với huyết khối; bệnh tự miễn có tƣơng quan aCL với huyết khối Bởi aCL đƣợc sử dụng nhƣ tiêu chuẩn chẩn đoán xét nghiệm lâm sàng hội chứng Antiphospholipid [1] [24] 1.2.2.2 Nguyên lý xét nghiệm Anti Cardiolipin Phát kháng thể kháng aCL-IgM/IgG kỹ thuật hóa miễn dịch phát quang sử dụng phân tử aCL-IgM/IgG ngƣời tinh chế, có gắn phân tử từ tính Các phân tử aCL-IgM/IgG gắn từ tính kết hợp với kháng thể kháng aCL có huyết tƣơng bệnh nhân Sau kháng kháng thể aCL gắn chất phát quang đƣợc bổ sung Phản ứng “aCL (có gắn từ tính) - kháng thể aCL - kháng kháng thể (có gắn chất phát quang)” xảy Phản ứng phát quang đƣợc hoạt hóa với H2O2 chất xúc tác Mức độ phát quang đƣợc đo thông qua hệ thống quang học tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể mẫu huyết tƣơng bệnh nhân [10] [23] 1.2.3 Kháng thể Anti β2-Glycoprotein (aGPI) 1.2.3.1 Đặc điểm kháng thể Anti β2-Glycoprotein (aGPI) β2-glycoprotein (β2GPI) loại lipoprotein đƣợc tổng hợp từ gan phóng thích vào máu Trọng lƣợng phân tử khoảng 50 KDa, chứa 326 acid amin nồng độ huyết tƣơng khoảng 200 mg/ml Nó dễ dàng gắn vào màng phospholipid tích điện âm Vai trò sinh lý màng β2GPI chƣa thực rõ ràng nhƣng β2GPI đƣợc coi protein đồng yếu tố chủ yếu kháng thể kháng phospholipid Kháng thể anti β2-glycoprotein (a-β2GPI) tự kháng thể chống lại β-glycoprotein 1, gắn vào phần điện tích âm phospholipid [1][25][26] 1.2.3.2 Nguyên lý xét nghiệm anti β2-glycoprotein Phát kháng thể kháng β2GPI (IgM/IgG) kỹ thuật hoá miễn dịch phát quang sử dụng phân tử β2GPI (IgM/IgG) ngƣời, đƣợc tinh chế, có gắn phân tử từ tính Các phân tử β2GPI gắn từ tính kết hợp với kháng thể kháng β2GPI có huyết tƣơng bệnh nhân Sau kháng 16 thể kháng β2GPI gắn chất phát quang đƣợc bổ sung vào hỗn hợp Phản ứng “β2GPI (có gắn từ tính) - kháng thể β2GPI - kháng kháng thể (có gắn chất phát quang)” xảy Phản ứng phát quang đƣợc hoạt hoá với H2O2 chất xúc tác Mức độ phát quang đƣợc đo thông qua hệ thống quang học tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể mẫu huyết tƣơng bệnh nhân [10][23] 1.3 HỘI CHỨNG ANTI PHOSPHOLIPID 1.3.1 Lịch sử phát Hội chứng anti phospholipid (Antiphospholipid Syndrome - APS) đƣợc phát nghiên cứu từ nhiều thập kỷ, đặc biệt giai đoạn 1980 -1990 Năm 1958, Conley Hartmann phát kháng đông Lupus – LA trình nghiên cứu hội chứng APS Moore Morh (1950) phát mối liên hệ xét nghiệm dƣơng tính giả bệnh Giang mai bệnh tự miễn [1][6] Ban đầu, bệnh nhân bị Lupus ban đỏ hệ thống đƣợc cho bị chảy máu kéo dài, nhƣng vào năm 1964, Walter Bowie cộng nhận thấy điều ngƣợc lại bệnh nhân huyết khối Trong nghiên cứu kéo dài Johansson cộng cho thấy diện song hành chảy máu huyết khối bệnh nhân bị Lupus ban đỏ hệ thống – SLE Năm 1975, Nilsson cộng phát mối liên quan bệnh nhân sảy thai nhiều lần với kháng đông lupus Bắt đầu từ năm 1980, APS nhận đƣợc nhiều quan tâm bác sĩ, nhà khoa học nhiều chuyên khoa khác Trong năm từ 1980 đến 1983, có nhiều báo cáo nhóm bệnh nhân bị huyết khối, huyết khối tĩnh mạch động mạch sảy thai liên tục [1][6] 1.3.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán Chẩn đoán xác định hội chứng anti-phospholipid đòi hỏi tiêu chuẩn lâm sàng tiêu chuẩn xét nghiệm [32][33][34][35][36] a Tiêu chuẩn lâm sàng - Bằng chứng huyết khối: Huyết khối tĩnh mạch huyết khối 17 động mạch huyết khối mao mạch, đƣợc khẳng định chẩn đoán hình ảnh mơ bệnh học - Biến chứng thai sản: + Một nhiều lần thai chết lƣu sau 10 tuần khơng giải thích đƣợc mà hình thái phơi thai bình thƣờng; + Một nhiều lần đẻ non trƣớc 34 tuần; + Ba ba lần sảy thai tự phát trƣớc 10 tuần mà khơng có bất thƣờng hormon thai phụ hay sai lệch nhiễm sắc thể bố, mẹ b Tiêu chuẩn xét nghiệm - LA test dƣơng tính; - Kháng thể kháng cardiolipin dƣơng tính; - Kháng thể kháng β2-glycoprotein I dƣơng tính; - Kháng thể kháng phosphatidylcholin dƣơng tính; - Kháng thể kháng phosphatidylethanolamine dƣơng tính; - Kháng thể kháng phosphotidylserin dƣơng tính Các xét nghiệm đƣợc coi có ý nghĩa dƣơng tính lần, cách 12 tuần [27][28][29][30][31] 1.3.3 Xếp loại hội chứng Antiphospholipid Xếp loại hội chứng anti-phospholipid nhƣ sau [1][33]: - Hội chứng anti-phospholipid tiên phát: Hội chứng anti-phospholipid khơng tìm đƣợc ngun nhân hay bệnh lý phối hợp - Hội chứng anti-phospholipid thứ phát: Hội chứng anti-phospholipid sau kèm theo: + Lupus ban đỏ hệ thống + Các bệnh tự miễn tổ chức liên kết khác + Các bệnh cảm ứng thuốc: Procainamid, hydralazin, quinidin, pherothiazin, penicillin… - APS toàn phát (thê thảm) (CAPS- Catastrophic APS): Diễn biến cấp tính, tồn phát tổn thƣơng nhiều quan, thiếu máu cục bộ, bít tắc mạch máu nhỏ lan tỏa Chẩn đoán dựa tiêu chuẩn: 18 + Tắc mạch từ tổ chức, quan trở lên; + Các biểu xảy đồng thời không tuần; + Xét nghiệm có kháng thể kháng phospholipid 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI Các loại kháng thể hội chứng phospholipid đƣợc nghiên cứu từ năm đầu thập kỷ 20, nhƣng phải đến đầu năm 1980, nghiên cứu hội chứng antiphospholipid liên quan đến sảy thai liên tiếp phụ nữ đƣợc nhà y học quan tâm Năm 1983, Meeling Boey đồng nghiệp báo cáo BMJ loạt bệnh nhân SLE bị huyết khối, sảy thai tái phát và/hoặc giảm tiểu cầu Cũng năm này, Graham Hughes cộng có nghiên cứu bƣớc đầu kháng thể kháng Cardiolipin bệnh nhân SLE thấy có mối liên quan đến tình trạng huyết khối sảy thai liên tiếp phụ nữ Từ đó, thuật ngữ hội chứng antiphospholipid bắt đầu đƣợc nhắc đến Sau loạt nghiên cứu APS đời, tiêu chuẩn xếp loại APS dần đƣợc hoàn thiện sửa đổi bổ sung liên tục Tỷ lệ xuất loại kháng thể đƣợc nhiều nghiên cứu thống kê lại Qua đó, lƣu hành kháng thể kháng phospholipid cộng đồng dƣới 1% Sự lƣu hành tự kháng thể tăng lên theo tuổi kháng thể kháng phospholipid ngoại lệ, kháng thể kháng phospholipid đƣợc báo cáo 10 – 20 % ngƣời già khỏe mạnh [6][37][38][39][40] Trong bệnh tự miễn, đặc biệt SLE tỉ lệ APS nhƣ lƣu hành kháng thể kháng phospholipid cao Theo nghiên cứu Euro – Lupus cho thấy 24% kháng thể kháng cardiolipin (aCL) type IgG, 13% aCL IgM 15% có kháng thể kháng đơng lupus (LA) số 1000 bệnh nhân SLE Trong nghiên cứu gần tần suất APS tăng lên từ 10 đến 23% sau 15 - 18 năm nhóm tập lớn bệnh nhân SLE [6] Trong nhóm bệnh nhân tắc tĩnh mạch không chọn lọc, tần suất aCL thay đổi từ 3-17% 3-14% với LA Kháng thể kháng phospholipid gặp 19 khoảng 18% bệnh nhân trẻ dƣới 40 tuổi đột quỵ, trái lại, nghiên cứu APASS 9,7% bệnh nhân lần đầu đột quỵ có aCL dƣơng tính Ở bệnh nhân nhồi máu tim, tỉ lệ lƣu hành kháng thể kháng phospholipid thay đổi từ 5-15% Nhiều nghiên cứu mơ tả cắt ngang đƣợc báo cáo có mối liên quan kháng thể aCL LA với tình trạng sảy thai liên tiếp (khoảng 10-20%) [6] Nghiên cứu Pengo cộng năm 2005 kháng thể hội chứng APS nhận thấy nguy mắc huyết khối bệnh nhân có nhiều kháng thể dƣơng tính cao so với bệnh nhân dƣơng tính với kháng thể Những bệnh nhân có ba kháng thể dƣơng tính có nguy mắc huyết khối cao gấp lần so với bệnh nhân có kháng thể dƣơng tính Kết đƣợc tóm tắt Bảng 2.1 Bảng 1.2 Nguy mắc huyết khối BN theo liệu kháng thể aPL Các loại kháng thể Huyết khối (n=340) (%) Tỷ lệ chênh lệch Khơng có Huyết khối (n=278) (%) LAC+/aCL+/aGPI+ 34 (10) (1) Đơn biến 14,9 LAC+/aCL-/aGPI- (0) (2) NA LAC-/aCL+/aGPI+ 18 (5) 13 (5) 1,2 LAC-/aCL+/aGPI- (2) 13 (5) 0,5 LAC-/aCL-/aGPI+ (1) (1) 0,9 95%CI 3,5 – 62,7 0,6 – 2,5 0,2 – 1,2 0,2 – 3,5 Đa biến 33,3 NA 2,2 0,8 1,3 95%CI 7,0 157 1,0 – 5,2 0,3 – 2,1 0,3 – 5,7 (Nguồn: Pengo et al (2005), Antibody profiles for the diagnosis of antiphospholipid syndrome Thromb Haemost; 93(6):1147–52) 20 Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu APS bắt đầu đƣợc nhà sản khoa tim mạch quan tâm từ năm 2009 [41][42] Nghiên cứu Lê Thị Phƣơng Lan, Nguyễn Thị Minh Nguyệt Bệnh viện Phụ sản Trung ƣơng giai đoạn 2009-2011 cho thấy 13,7% bệnh nhân có thai phát triển sảy thai liên tiếp có kháng thể kháng phospholipid [42] Năm 2015, nghiên cứu Cung Thị Thu Thuỷ cộng cho thấy có đến 47,9% bệnh nhân có tiền sử sảy thai liên tiếp dƣơng tính với ba loại kháng thể (LA, aCL, aGPI); 23,4% bệnh nhân dƣơng tính với kháng thể kháng phospholipid lần 2; 24,5% bệnh nhân âm tính với kháng thể sau 12 tuần [2] Ngoài ra, nghiên cứu APS Việt Nam tiếp tục đƣợc tiến hành đối tƣợng bệnh nhân SLE bệnh nhân có chẩn đốn xác định APS 21 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 501 bệnh nhân đƣợc định xét nghiệm tìm kháng thể kháng phospholipid Viện Huyết học - Truyền máu Trung ƣơng từ 1/2017 12/2018 ( 24 tháng) 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu: - Bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ APS có kết xét nghiệm rAPTT kéo dài, đƣợc định xét nghiệm sàng lọc APS lần đầu Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng - Mẫu xét nghiệm đảm bảo tiêu chuẩn phòng xét nghiệm, mẫu đƣợc ly tâm hai lần với tốc độ 2500 vòng/phút 10 phút để loại trừ yếu tố tiểu cầu đƣợc xét nghiệm vòng đồng hồ kể từ sau lấy máu 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ: - Bệnh nhân có rối loạn đông máu bẩm sinh nhƣ: Hemophilia A, Hemophilia B, Hemophilia C… - Bệnh nhân sử dụng thuốc chống đông, thuốc kháng vitamin K, heparin standard, hidroxil chloroquine 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu hồi cứu, tiến cứu, mô tả cắt ngang, có theo dõi dọc 2.2.2 Chọn mẫu: Theo phƣơng pháp chọn mẫu thuận tiện thỏa mãn tiêu chuẩn chọn mẫu n =Z2 (1-α/2) pq d2 n cỡ mẫu cần đạt Z hệ số tin cậy, mức xác suất 95%, Z=1,96 22 p tỷ lệ ngƣời có kháng thể kháng phospholipid ngƣời đƣợc định kiểm tra, chọn p=0.5 để có cỡ mẫu lớn q tỷ lệ khơng có kháng thể kháng phospholipid, q=1-p= 0.5 d độ xác mong muốn, d= 0,05 Thay số vào cơng thức, tính n = 384 2.2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.2.3.1 Bệnh phẩm Máu ngoại vi: - ml máu tĩnh mạch chứa ống chống đông Natri citrate 3,2% với tỷ lệ máu/chống đông 9/1 Mẫu đƣợc ly tâm hai lần với tốc độ 2500 vòng/phút 10 phút để loại trừ yếu tố tiểu cầu - ml máu tĩnh mạch chứa ống chống đông EDTA K2 để làm xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi 2.2.3.2 Phương tiện, dụng cụ nghiên cứu - Ống chống đông Natri Citrate 3,2%, EDTA K2 - Ống nghiệm loại, pipetmann, đầu côn, giá xét nghiệm - Hệ thống máy đông máu ACL Top - Máy ly tâm hãng Kubota - Bình ủ 370C - Hệ thống máy đếm tế bào tự động DxH 600 - Hệ thống máy miễn dịch tự động Liaison 2.2.3.3 Hóa chất - sinh phẩm Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm APTT: APTT- SP HemosIL bao gồm: APTT Reagent: lọ x ml dung dịch đệm, thuốc thử phospholipid tổng hợp, chất kích hoạt silica, chất ổn định chất bảo quản; Calcium Choride: lọ x ml dung dịch canxi clorua (0,025M) 23 Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm Fibrinogen: Fibrinogen-C XL HemosIL bao gồm: Bovine thrombin: 10 lọ x ml thrombin chiết xuất từ bò đơng khơ (35 UNIH/ ml ) với albumin, canxi clorua, đệm chất ổn định Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm PT: RecombiPlastin 2G HemosIL bao gồm: RecombiPlasTin 2G (RTF): x 20 ml lọ đông khô yếu tố mô tái tổ hợp ngƣời (RTF), phospholipid tổng hợp với chất bảo quản, chất ổn định dung dịch đệm; RecombiPlasTin 2G pha loãng (RTF pha loãng): x 20 ml lọ dung dịch calcium chloride, polybrene chất bảo quản Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm TT: Thrombin Time HemosIL bao gồm: Buffer: lọ x ml hóa chất đặc calcium chloride (0,5 Mol/L), đệm chất bảo quản; Bovine thrombin: lọ x hóa chất dạng khơ thrombin bò (15 UNIH/lọ) có thành phần bao gồm albumin bò đệm Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm D-Dimer: D-Dimer HS 500 HemosIL bao gồm: Latex Reagent: lọ x ml hỗn dịch hạt latex phủ mảnh F(ab’)2 kháng thể đơn dòng chuột (MA 8D3) đặc hiệu với kháng nguyên D-Dimer, albumin huyết bò, đệm, chất ổn định chất bảo quản; Reaction Buffer: lọ x ml đệm Hepes chứa albumin huyết bò, đệm, chất ổn định chất bảo quản Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm Lupus AntiCoagulant: - LA Screen: Chế phẩm đông khô chứa nọc rắn Russell, lƣợng nhỏ phospholipid, canxi, polybrene, đệm, chất ổn định, chất tạo màu chất bảo quản - LA Confirm: Chế phẩm đông khô chứa nọc rắn Russell, lƣợng dƣ phospholipid, canxi, polybrene, đệm, chất ổn định, chất tạo màu chất bảo quản 24 Hoá chất - sinh phẩm để làm xét nghiệm Anti-Cardiolipin: - Một hộp anti-Cardiolipin IgG bao gồm: Một lọ hạt từ phủ Cardiolipin bò β2-Glycoprotein tinh khiết ngƣời, lọ dung dịch đệm, lọ kháng kháng thể IgG gắn chất huỳnh quang, lọ chất pha loãng - Một hộp anti-Cardiolipin IgM bao gồm: Một lọ hạt từ phủ Cardiolipin bò β2-Glycoprotein tinh khiết ngƣời, lọ dung dịch đệm, lọ chất kháng kháng thể IgM gắn với chất huỳnh quang, lọ chất pha loãng Hoá chất - sinh phẩm để làm xét nghiệm Anti β2-Glycoprotein I: - Một hộp Anti β2-Glycoprotein I IgG bao gồm: Một lọ hạt từ phủ β2Glycoprotein tinh khiết ngƣời, lọ dung dịch đệm, lọ kháng kháng thể IgG gắn chất huỳnh quang, lọ chất pha loãng - Một hộp Anti β2-Glycoprotein I IgM bao gồm: Một lọ hạt từ phủ β2Glycoprotein tinh khiết ngƣời, lọ dung dịch đệm, lọ kháng kháng thể IgM gắn chất huỳnh quang, lọ chất pha lỗng Hố chất - sinh phẩm để làm xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi: Bộ hóa chất gồm 05 hộp: Coulter DxH Diluent, Coulter DxH Retic Pack, Coulter DxH Diff Pack, Coulter DxH Cleaner, Coulter DxH Cell Lyse 2.2.3.4 Các phương pháp, kỹ thuật thực xét nghiệm Các xét nghiệm đông máu đƣợc thực theo quy trình chuẩn khoa Đông cầm máu, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng đƣợc đánh giá bác sỹ chuyên khoa - Xét nghiệm APTT thực máy ACL Top: Xét nghiệm APTT hệ thống máy xét nghiệm đông máu ACL TOP 700 dựa nguyên tắc đo phát điểm đông Kỹ thuật đánh giá dựa vào thay đổi mật độ quang điểm cuối trình đơng máu + Phƣơng pháp: Bổ sung lƣợng vừa đủ APTT reagent (thành phần có phospholipid tổng hợp chất kích hoạt silica) vào mẫu huyết tƣơng nghèo tiểu cầu, ủ 37ºC khoảng thời gian định Sau calci 25 đƣợc thêm vào để kích hoạt đƣờng đơng máu nội sinh Thời gian tính từ lúc cho calci vào tới lúc hình thành điểm đông - Xét nghiệm Fibrinogen thực máy ACL Top: Xét nghiệm Fibrinogen hệ thống máy xét nghiệm đông máu ACL TOP 700 dựa nguyên tắc đo phát điểm đông Kỹ thuật đánh giá dựa vào thay đổi mật độ quang điểm cuối q trình đơng máu + Phƣơng pháp: Thrombin có tác dụng chuyển fibrinogen thành fibrin, tạo cục đông Dựa vào đó, ngƣời ta pha lỗng huyết tƣơng bệnh nhân sử dụng lƣợng thừa thrombin để chuyển tồn fibrinogen thành fibrin, đo thời gian đơng Thời gian đông phụ thuộc vào hàm lƣợng fibrinogen huyết tƣơng, qua tính đƣợc nồng độ fibrinogen - Xét nghiệm PT thực máy ACL Top: Xét nghiệm PT-RP hệ thống máy xét nghiệm đông máu ACL TOP 700 dựa nguyên tắc đo phát điểm đông Kỹ thuật đánh giá dựa vào thay đổi mật độ quang điểm cuối q trình đơng máu + Phƣơng pháp: Thời gian Prothrombin (PT) đƣợc thực cách cho vào huyết tƣơng bệnh nhân đƣợc chống đông natri citrate lƣợng thuốc thử Thromboplastin 2G chứa yếu tố mô tái tổ hợp ngƣời (RTF), phospholipid tổng hợp calcium nhằm kích hoạt đƣờng đông máu ngoại sinh Thời gian từ lúc cho thuốc thử chứa calcium vào tới lúc hình thành cục đơng gọi thời gian Prothrombin - Xét nghiệm TT thực máy ACL Top: Thrombin có tác dụng chuyển fibrinogen thành fibrin, tạo cục máu đông Sử dụng thrombin nồng độ thích hợp để đo thời gian hình thành fibrin cho phép đánh giá khả tốc độ chuyển fibrinogen thành fibrin + Phƣơng pháp: Thời gian Thrombin (TT) đƣợc thực cách cho vào huyết tƣơng bệnh nhân đƣợc chống đông natri citrate lƣợng thuốc thử Thrombin chứa albumin từ bò, Calcium chloride dung dịch đệm nhằm kích hoạt q trình đơng máu Thời gian tính từ lúc cho thuốc thử vào tới lúc hình thành cục đơng thời gian Thrombin 26 - Xét nghiệm D-Dimer thực máy ACL Top: Xét nghiệm D-Dimer đƣợc thực dựa phƣơng pháp miễn dịch đo độ đục hệ thống máy đông máu tự động + Phƣơng pháp: Khi ủ huyết tƣơng bệnh nhân với hỗn dịch gồm hạt Latex gắn kháng thể đặc hiệu với kháng kháng nguyên D-Dimer, D-Dimer huyết tƣơng bệnh nhân đƣợc gắn kháng thể đặc hiệu hạt latex dẫn tới tƣợng ngƣng kết, mức độ ngƣng kết tỷ lệ với nồng độ D-Dimer huyết tƣơng bệnh nhân đƣợc đo dựa vào thay đổi mật độ quang - Xét nghiệm kháng đông nội sinh thực máy ACL Top: Xét nghiệm mixing test chất thực xét nghiệm giống với xét nghiệm APTT Thực xét nghiệm mixing test pha trộn huyết tƣơng bệnh nhân với huyết tƣơng ngƣời bình thƣờng với tỉ lệ 1:1 chạy xét nghiệm APTT trƣớc sau ủ nhiệt độ 37°C tiếng để phát kháng đông lƣu hành bệnh nhân có bất thƣờng đơng máu dựa vào khả bù yếu tố đông máu - Xét nghiệm Lupus AntiCoagulant máy ACL Top: Đối với lơ hố chất dRVVT screen dRVVT confirm có giá trị chứng đƣợc tính giây theo khuyến cáo CLSI Máu đƣợc chống đông natricitrat 3,2%, ly tâm tách lấy huyết tƣơng nghèo tiểu cầu, ủ nhiệt độ 37°C vòng 90 đến 150 giây, sau trộn với hố chất dRVVT screen dRVVT confirm theo tỷ lệ 1:1 Nọc rắn hố chất kích hoạt yếu tố X calci bắt đầu q trình đơng máu Máy xét nghiệm dùng phƣơng thức phát ánh sáng tán xạ để đo thời gian đông máu huyết tƣơng kết hợp với giá trị chứng theo cơng thức dƣới để tính kết cuối Cơng thức tính nhƣ sau: dRVVT Screen Ratio = dRVVT Confirm Ratio = 27 Kết cuối đƣợc tính tốn dựa tỉ lệ kết dRVVT screen dRVVT confirm: Normalized dRVVT Ratio = Dƣơng tính tỷ lệ LA screen/LA confirm ( Normalized dRVVT Ratio) ≥ 1,4 - Xét nghiệm Anti Cardiolipin máy Acustar: Các xét nghiệm định lƣợng Anti Cardiolipin hệ thống HemosIL AcuStar kháng thể kháng phospholipid xét nghiệm miễn dịch hoàn toàn tự động, dựa cơng nghệ hóa sinh Các hạt từ tính đƣợc phủ kháng nguyên cardiolipin ß2- Glycoprotein Các hạt từ tính đƣợc phủ kháng nguyên bắt kháng thể IgG IgM, có mẫu Một loại kháng thể thứ hai có hố chất đƣợc đánh dấu isoluminol huỳnh quang sau liên kết với kháng thể bị bắt; dẫn đến phát xạ ánh sáng tƣơng ứng với nồng độ kháng thể - Xét nghiệm Anti β2 - glycoprotein máy Acustar: Các xét nghiệm định lƣợng Anti β2-glycoprotein hệ thống HemosIL AcuStar kháng thể kháng phospholipid xét nghiệm miễn dịch hồn tồn tự động, dựa cơng nghệ hóa sinh Các hạt từ tính đƣợc phủ ß2GPI Các hạt từ tính đƣợc phủ kháng nguyên bắt kháng thể IgG IgM, có mẫu Một loại kháng thể thứ hai có hố chất đƣợc đánh dấu isoluminol huỳnh quang sau liên kết với kháng thể bị bắt; dẫn đến phát xạ ánh sáng tƣơng ứng với nồng độ kháng thể - Xét nghiệm đếm số lượng tiểu cầu: Xét nghiệm đƣợc thực máy DXH 600 khoa Tế bào – Tổ chức học, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng Máu tồn phần đƣợc pha lỗng sau đƣa vào hệ thống đếm tế bào tự động Số lƣợng tiểu cầu đƣợc đếm theo nguyên lý trở kháng Với số lƣợng máu đƣợc pha loãng biết trƣớc, từ tính số lƣợng tiểu cầu đơn vị thể tích máu tồn phần 28 2.3 CÁC TIÊU CHUẨN ÁP DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 2.3.1 Tiêu chuẩn giá trị xét nghiệm Các tiêu chuẩn giá trị xét nghiệm đƣợc tổng hợp Bảng 2.1 [10] Bảng 2.1 Tiêu chuẩn giá trị xét nghiệm thực nghiên cứu STT Tên xét Giá trị nghiệm Kết luận Bình thƣờng 2,0 -4,0 g/l Fibrinogen PT% < 2,0 g/l Giảm > 4,0 g/l Tăng 70-140 % Bình thƣờng < 70% Thấp > 140% Cao Bình thƣờng 0,85-1,25 INR >1,25 Kéo dài 0,85 – 1,25 Bình thƣờng rTT >1,25 Kéo dài ≤ 500 ng/ml Bình thƣờng > 500 ng/ml D-dimer tăng 0,8-1,2 Bình thƣờng D-dimer rAPTT > 1,2 LA test Kéo dài Tỷ lệ LA screen/LA confirm