BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THU GIANG 1201139 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA INVITRO CỦA CAO CÂY LÁ ĐẮNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THU GIANG 1201139 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA INVITRO CỦA CAO CÂY LÁ ĐẮNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phạm Thái Hà Văn Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc học cổ truyền HÀ NỘI - 2017 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………… .1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN……………… 1.1 Tổng quan đắng 1.1.1 Vị trí phân loại đặc điểm chi Vernonia 1.1.2 Loài Vernonia amygdalina Del 1.1.3 Tác dụng sinh học 1.2 Sự hình thành dạng oxy hoạt động hệ thống chất chống oxy hóa (CCOH) thể 1.2.1 Sự hình thành dạng oxy hoạt động 1.2.2 Hệ thống chất chống oxy hóa (CCOH) thể 1.2.3 Sự liên quan gốc tự với số trình bệnh lý .10 1.2.4 Các phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa 12 1.3 Tổng quan cao đặc .12 1.3.1 Định nghĩa 13 1.3.2 Phương pháp điều chế cao .13 1.3.3 Yêu cầu chất lượng với cao 13 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho nghiên cứu 15 2.1.3 Hóa chất, thuốc thử 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Điều chế cao chiết ethanol đắng 16 2.2.2 Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol đắng… 16 2.2.3 Khảo sát số tiêu chất lượng cao chiết ethanol đắng 16 2.2.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro cao chiết ethanol đắng… 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp điều chế cao .17 2.3.2 Phương pháp xác định độ ẩm 18 2.3.3 Phương pháp cảm quan 18 2.3.4 Phương pháp định tính .18 2.3.5 Phương pháp bán định lượng 22 2.3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro .24 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 27 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28 3.1 Điều chế cao chiết ethanol đắng 28 3.2 Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol đắng .29 3.2.1 Định tính 29 3.2.2 Bán định lượng 32 3.2.2.2 Thẩm định phương pháp HPTLC 34 3.3 Khảo sát số tiêu chất lượng cao chiết ethanol đắng 37 3.3.1 Tính chất: 37 3.3.2 Độ ẩm: 37 3.3.3 Định tính: 38 3.3.4 Bán định lượng luteolin HPTLC: 38 3.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro cao chiết ethanol đắng… 38 3.4.1 Tiến hành 38 3.4.2 Kết .40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………… 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CCOH: chất chống oxy hóa SOD: enzym superoxyd dismutase DOXHĐ: dạng oxy hoạt động LDL: lipoprotein tỷ trọng thấp DĐVN IV: dược điển Việt Nam IV HPTLC: high performance thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng hiệu cao) DPPH: 1,1 – diphenyl – – picrylhydrazyl TLC, SKLM: Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) MDA: Malonyl dialdehyd POL: peroxyd hóa lipid TMCB: thiếu máu cục TMTL: tưới máu trở lại RSD: độ lệch chuẩn tương đối TT: thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Hàm lượng chiết cao đắng ethanol 70% 28 Bảng 3.2 Định tính thành phần có cao 29 Bảng 3.3 Kết phân tích sắc ký đồ cao đắng sau phun 31 thuốc thử bước sóng 254 nm Bảng 3.4 Thể tích tiêm mẫu 32 Bảng 3.5 Hàm lượng luteolin có cao đắng 33 Bảng 3.6 Diện tích pic lần tiêm chuẩn 36 Bảng 3.7 Hàm lượng luteolin chuẩn diện tích pic đáp ứng 36 Bảng 3.8 Độ ẩm cao 38 Bảng 3.9 Độ hấp thụ % ức chế gốc tự cao tổng đắng quercetin 40 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Vernonioside Hình 1.2 Cấu trúc hóa học luteolin Hình 2.1 Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu cao 15 Limonat Hình 2.2 Cấu trúc hóa học DPPH 25 Hình 3.1 Kết định tính flavonoid bước sóng 254 nm 31 Hình 3.2 Sắc ký đồ định lượng HPTLC bước sóng 254 33 nm Hình 3.3 Hình dạng pic Rf mẫu thử mẫu chuẩn 35 Đồ thị 3.1 Đường chuẩn phân tích nồng độ luteolin theo diện 34 tích pic Đồ thị 3.2 Mối liên hệ hàm lượng luteolin diện tích pic 36 Đồ thị 3.3 Khả chống oxy hóa cao chiết đắng 41 Đồ thị 3.4 Khả chống oxy hóa chất đối chứng quercetin 41 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Phạm Thái Hà Văn – người trực tiếp hướng dẫn, bảo truyền đạt kinh nghiệm quý báu động viên, hỗ trợ mặt từ bước hồn thiện khóa luận Tơi xin trân trọng cảm ơn PGS-TS Nguyễn Mạnh Tuyển hỗ trợ, bảo, hướng dẫn tơi q trình thực đề tài ThS Nghiêm Đức Trọng – Bộ môn Thực vật giúp giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn tồn thể Thầy giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dƣợc học cổ truyền – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội hỗ trợ kịp thời, tạo điều kiện cho q trình học tập, nghiên cứu mơn Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu tồn thể Thầy giáo Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập trường Cuối tơi xin cảm ơn gia đình bạn tơi ln động viên, khích lệ nhắc nhở, sát cánh bên tôi, động lực lớn giúp tơi vượt qua khó khăn Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận có nhiều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Trần Thu Giang ĐẶT VẤN ĐỀ Cây đắng có nguồn gốc từ châu Phi, di thực vào Việt Nam thời gian dài nhân dân ta sử dụng loại rau xanh ăn ngày thảo dược để phòng điều trị bệnh như: tiểu đường, lipid máu, bệnh chuyển hoá liên quan đến gan Trong bối cảnh đắng ngày sử dụng rộng rãi, xuất nhiều nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hoá học Các nghiên cứu khẳng định đắng di thực vào Việt Nam lồi Vernonia amygdalina Del nhiều khẳng định tác dụng sinh học đắng thơng qua việc phát hợp chất hố học liên quan Tuy nhiên chưa có nghiên cứu thức tiến xa việc đưa đắng tiếp cận gần với người sử dụng Việc chế biến sử dụng đắng thủ công Người dân chủ yếu dùng tươi phơi khô hãm uống chè nấu thành canh để ăn Xuất phát từ thực tế trên, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa invitro cao đắng” với mục đích đưa bào chế cao giúp cho việc sử dụng loại dược liệu thuận tiện, dễ dàng bước đầu nghiên cứu tác dụng đắng Để hoàn thành mục đích chúng tơi tiến hành để tài với mục tiêu sau: Nghiên cứu thành phần hóa học cao đắng Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro cao đắng Để thực mục tiêu đề tài cần thực nội dung sau: Khảo sát số tiêu chuẩn cao cảm quan, độ ẩm, định tính thành phần hóa học, định tính bán định lượng luteolin Đánh giá tác dụng chống oxy hóa invitro cao đắng Nhận xét: - % ức chế gốc oxy hóa tự cao chiết đắng phụ thuộc vào nồng độ theo đường thẳng y = 3,2369x – 0,5183 với R2 = 0,9952, tức R = 0,998, có mối tương quan chặt chẽ % ức chế gốc tự nồng độ cao chiết đắng - % ức chế gốc oxy hóa tự quercetin phụ thuộc vào nồng độ theo đường thẳng y = 115,23x + 40,413 với R2 = 0,8583 tức R = 0,93, có mối tương quan chặt chẽ % ức chế gốc tự nồng độ quercetin - Kết chống oxy hóa cao chiết ethanol đắng trình bày bảng 3.8, cột cho thấy % ức chế gốc tự cao đắng tỷ lệ thuận với nồng độ cao, tức nồng độ cao lớn khả chống oxy hóa cao lớn - Tại nồng độ 20 mg/ml, cao đắng có tác dụng chống oxy hóa trung bình (63,30%) - Hiệu loại bỏ gốc tự cao đắng xác định thông qua giá trị IC50 trình bày bảng 3.8, cột cho thấy khả chống oxy hóa cao đắng (IC50 = 15,607 mg/ml) thấp so với quercetin (IC50 = 0,083 mg/ml) dùng để khảo sát thí nghiệm 188 lần 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu, đề tài hoàn thành mục tiêu đề thu kết sau: Điều chế cao chiết ethanol đắng kiểm tra số tiêu cao đặc: - Về điều chế cao: hàm lượng cao đặc trung bình 21,69% - Về khảo sát số tiêu chất lượng cao:  Cảm quan: thể chất mềm dẻo, đặc quánh, mịn, đồng Màu nâu đen bóng, thơm, mùi thơm đặc trưng, vị đắng, lúc sau thấy  Độ ẩm: Độ ẩm mẫu cao điều chế 15,19%; 13,82%; 16,18% Nghiên cứu thành phần hóa học cao chiết ethanol đắng: - Định tính:  Cao đặc chiết ethanol đắng có nhóm chất: flavonoid, saponin, tanin đường khử  Định tính sắc ký lớp mỏng: sắc ký đồ mẫu thử bước sóng 254 nm có vết, có vết luteolin tương ứng với vết chấm mẫu dung dịch chất đối chiếu Rf = 0,37 - Hàm lượng luteolin cao xác định phương pháp HPTLC 0,018% Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro cao chiết ethanol đắng: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa thơng qua mơ hình dọn gốc tự DPPH in vitro cho thấy cao chiết ethanol đắng có tác dụng chống oxy hóa, 43 nồng độ 20 mg/ml có giá trị % ức chế gốc tự 63,30%; giá trị IC50 cao đặc 15,607 mg/ml KIẾN NGHỊ Sau hồn thành đề tài, tơi có kiến nghị sau: - Nghiên cứu hồn chỉnh quy trình bào chế cao đắng - Định lượng HPLC luteolin - Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan in vivo cao đắng 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đàm Trung Bảo, Hồng Tích Tuyền, Phạm Nguyễn Vinh (1999), Chất chống oxy hóa, NXB Y học Hà Nội Bộ môn Dược Liệu (T9/2006), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, NXB Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam – lần xuất thứ 4, NXB Y học, Hà Nội Lê Thị Mi Chi, Kiều Loan, Lê Thị Đại Phương (2016), Khảo sát sơ thành phần hóa học, đặc điểm vi phẫu hình thái đắng, Tạp chí KHCN ĐHĐN, Số 11 (108) , tr.78-81 Trần Thị Thùy Dương, Nguyễn trọng Đức, Hồ Như Quỳnh, Đặng Kiều Nhung, Tưởng Lê Mỹ Tú Bùi Thị Bửu Huê (2014), Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính sinh học tinh dầu ngải sậy (Zingiber montanum), Tạp chi Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tr.131-138 GS Nguyễn Văn Đàn, DS Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học Lai Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thư (2009), Stress oxy hóa chất kháng oxy hóa tự nhiên, Tạp chí Khoa học phát triển, tr 667-677 ThS Đỗ Trường Hạ (2010), Kháng oxy hóa kháng nấm số dẫn chất Chalcon, Khoa học Ứng dụng, tr.11-13 Đặng Văn Hòa, Vĩnh Định (2011), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Giáo dục Việt Nam 10 Lê Thành Phước, Nguyễn Quang Thường (1999), Phức chất gốc tự Y - Dược, Đại học Dược Hà Nội 11 TS Đỗ Quyên, Chiết xuất phân lập hợp chất thiên nhiên, NXB Giáo dục Việt Nam, tr.18-36 12 Nguyễn Quang Thường, Các phương pháp xác định số xu hướng nghiên cứu thuốc gắn với q trình peroxy hóa, Tạp chí Dược học tháng 3/1995, tr.23-26 13 Đái Thị Xuân Trang, Lâm Hồng Bảo Ngọc, Võ Thị Tú Anh (2015), Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kháng oxy hóa cao Methanol Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas MERR.), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tr.1-6 14 Viện dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học kỹ thuật, tr.289-290 15 Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương (2012), Khóa đào tạo thẩm định quy trình phân tích SKLM HPLC thuốc đơng dược TÀI LIỆU TIẾNG ANH 16 Babatunde Ogundale, Godson G Akunna, Oluwaseum O Fatoba, Omolara J Ayeni, Adebiyi A Adegoke, Sunday A Adelakun (2012), Aqueous extract of Vernonia amygdalina protects against alcoholinduced hepatotoxicity in Wistar rats, World J Young Researcher, pp7077 17 EU Eyong, MA Agiang, IJ Atangwho, IA Iwara, MO Odey, PE Ebong (2011), Phytochemicals and micronutrients composition of root and stem bark extracts of Vernonia amygdalina Del., Journal of Medicine and Medical Science, Vol 2(6) , pp.900-903 18 Harold Robinson (1999), Generic and Subtribal Classification of American Vernoniae, Smithsonian Contributions to Botany 89 Retrieved 17 September 2014 19 Karthikeyan, S., M Sanjappa and S Moorthy (2009) Asteraceae In: Flowering plants of India, Dicotyledons (Acanthaceae – Avicenniaceae), vol.1, Botanical Survey of India, Kolkata, pp184-299 20 Lavanya R., Maheshwari S.U., Harish G., Raj J.B., Kamali S., Hemamalani D., Varma J.B, Reddy C.U (2010), In-vitro Antioxidant Activity of Methanolic Extract in Leaves of Anisomeles malabarica Linn, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences 2010 Vol.1 No.4, pp.737-744 21 Molyneux P (2004), The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidantactivity, Songklanakarin J Sci Technol, 26 (2) , pp.211-219 22 Nabukenya I, Rubaire-Akiiki C, Mugizi D, Kateregga J, Olila D (2014), Sub-acute toxicity of aqueous extracts of Tephrosia vogelii, Vernonia amygdalina and Senna occidentalis in rats, Natural Products Chemistry & Research, Vol 2, Iss 5, pp.1-5 23 Nduagu C, Ekefan EJ, Nwankiti AO (2008), Effect of some crude plant extracts on growth of Colletotrichum capsici (Synd) Bulter & Bisby, causal agent of pepper anthracnose, Journal of Applied Biosciences (2008), Vol 6(2) , pp.184-190 24 Nerdy (2015), In silico study of sesquiterpene lactone compounds from South Africa Leaves (Vernonia amygdalina Del.) as antimalarial and anticancer, International Journal of PharmTech Research, Vol.7, No.1, pp.47-53 25 P.C Ekeocha, T.R Fasola, A.H Ekeocha (2012), The effect of Vernonia amygdalina on alloxan induced diabetic albino rats, African Journal of Food Science and Technology, Vol 3(3) , pp.73-77 26 Regina W M., Kelvin A M., Patrick A N (2014), Prospective bioactive compounds from Vernonia amygdalina, Lippia javanica, Dysphania ambrosioides and Tithonia diversifolia in controlling legume insect pests, Agricultural Sciences, pp.1129-1139 27 Sani Ali Audu, Alemika Emmanuel Taiwo, Abdulraheem Rafat Ojuolape (2012), A study review of documented phytochemistry of Vernonia amygdalina (family Asteraceae) as the basis for pharmacologic activity of plant extract, Journal of Natural Sciences Research, Vol.2, No.7, pp.18 28 Usunobun Usunomena (2012), Review manuscript: a review of some African medicinal plants, International Journal of Pharma and Bio Sciences Int J Pharm Bio Sci 2012 Oct; 3(4): (B), pp.1-11 29 Wan Yong Ho, SweeKeong Yeap, Woon San Liang, Boon Kee Beh, NurulElyani Mohamad, Noorjahan Banu Alitheen (2015), In vitro antioxidant and in vivo hepatoprotective effect on ethanol-mediated liver damage of spray dried Vernonia amygdalina water extract, Pak J Pharm Sci , Vol.28, No.1, pp.15-22 30 Xuan Luo, Yan Jiang, Frank R Fronczek, Cuiwu Lin, Ernest B Izevbigie, Ken S Lee (2011), Isolation and structure determination of a sesquiterpene lactone (vernodalinol) from Vernonia amygdalina extracts, Pharm Biol, 49(5), pp.464-470 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Ảnh sắc ký bán định lƣợng HPTLC Chạy HPTLC lần Chạy HPTLC lần Chạy HPTLC lần Chạy HPTLC lần Vết 1: Luteolin chuẩn mg/ml Vết 2: Luteolin chuẩn 1,5 mg/ml Vết 3: Luteolin chuẩn mg/ml Vết 4: Luteolin chuẩn 2,5 mg/ml Vết 5: Luteolin chuẩn mg/ml Vết 6: mẫu thử Phụ lục 2: Kết sắc ký mẫu bán định lƣợng Luteolin Hình PL 2.1: Pic sắc ký mẫu chuẩn hàm lượng µg Hình PL 2.2: Pic sắc ký mẫu chuẩn hàm lượng 1,5 µg Hình PL 2.3: Pic sắc ký mẫu chuẩn hàm lượng µg Hình PL 2.4: Pic sắc ký mẫu chuẩn hàm lượng 2,5 µg Hình PL 2.5: Pic sắc ký mẫu chuẩn hàm lượng µg Hình PL 2.6: Pic sắc ký mẫu thử Phụ lục 3: Độ hấp thụ quang dung dịch cao đắng Nồng độ (mg/ml) A 20 10 2,5 1,25 0,188 0,373 0,466 0,525 0,565 Phụ lục 4: Độ hấp thụ quang dung dịch Quercetin Nồng độ (mg/ml) A 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0,015 0,061 0,218 0,297 0,25 Phụ lục 5: Giấy chứng nhận mã số tiêu Phụ lục 6: Chứng nhận tiêu giám nhận tên khoa học đắng ... dàng bước đầu nghiên cứu tác dụng đắng Để hồn thành mục đích tiến hành để tài với mục tiêu sau: Nghiên cứu thành phần hóa học cao đắng Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro cao đắng Để thực...BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THU GIANG 1201139 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA INVITRO CỦA CAO CÂY LÁ ĐẮNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người... chè nấu thành canh để ăn Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa invitro cao đắng với mục đích đưa bào chế cao giúp cho việc sử dụng loại