BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI KETKESONE SIBOUPHA KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae CỐ ĐỊNH TRONG HỆ GEL ALGINATCHITOSAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực hồn thành tổ Vi sinh - Bộ môn Công nghiệp Dược Trong thời gian thực khóa luận, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cơ, bạn bè gia đình Với tất kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới cô giáo ThS Kiều Thị Hồng PGSTS Đàm Thanh Xuân tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện từ ngày đầu đến em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đồng thời, em xin cảm ơn quan tâm, giúp đỡ thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công Nghiệp Dược suốt trình làm đề tài nghiên cứu thực môn Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập trường Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên giúp đỡ em nhiều trình học tập sống Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2018 Sinh viên KETKESONE SUBOUPHA MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Error! Bookmark not defined CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung alginat 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Cấu trúc, đặc điểm, tính chất 1.1.3 Cơ chế tạo gel 1.1.4 Ứng dụng 1.2 Giới thiệu chung chitosan 1.2.1 Nguồn gốc .5 1.2.2 Công thức, cấu trúc 1.2.3 Tính chất 1.2.4 Ứng dụng 1.3 Phương pháp cố định tế bào 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Phân loại 1.3.3 Ưu nhược điểm 1.3.4 Ứng dụng 1.4 1.4.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 10 Nguồn gốc 10 1.4.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo 11 1.4.3 Ứng dụng 11 1.5 Một số nghiên cứu phương pháp cố định tế bào giới 12 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 2.1 Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị .14 2.1.1 Chủng vi sinh vật .14 2.1.2 Nguyên vật liệu hoá chất 14 2.1.3 hiết ị dụng cụ 14 2.1.4 Một số môi trường sử dụng 15 2.1.5 Một số dung ịch ụng nghi n cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu .17 2.2.1 Bào chế hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae alginat alginat-chitosan .17 2.2.2 Khảo sát khả tạo ethanol tế bào nấm men Saccharomyes cerevisiae cố định gel alginat – chitosan 17 2.2.3 Khảo sát khả tái dụng hạt cố định hệ gel alginat alginat-chitosan 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu .17 2.3.1 Phương pháp giữ giống 17 2.3.2 Phương pháp nhân giống 18 2.3.3 Phương pháp l n men 18 2.3.4 Phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm 18 2.3.5 Phương pháp cố định tế bào hệ gel canxi alginat 19 2.3.6 Phương pháp cố định tế bào hệ gel canxi alginat – chitosan 19 2.3.7 Phương pháp định lượng đường 19 2.3.8 Phương pháp đông khô 20 2.3.9 Phương pháp xác định kích thước hạt cố định tế bào nấm men .21 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Bào chế hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae alginat alginat-chitosan 21 3.2 Khảo sát khả tạo ethanol tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định gel alginat – chitosan 24 3.3 Khảo sát khả tái sử dụng hạt cố định hệ gel alginat alginatchitosan 28 3.3.1 Khảo sát tượng bình hạt cố định tế bào Saccharomyces cerevisiae hệ gel alginat alginat-chitosan sau lên men tái sử dụng 24h 28 3.3.2 Khảo sát khả tạo Ethanol sau tái sử dụng 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên hình Trang Bảng 2.1: Nguyên liệu hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2: Thiết bị 14 Bảng 2.3: Dụng cụ 15 Bảng 2.4: Một số môi trường sử dụng 15 Bảng 3.1: Đặc tính hạt Alg Alg-Chi cố định tế bào nấm men S 22 cerevisiae Bảng 3.2: Đặc điểm bình lên men với tế bào nấm men tự 24 hạt cố định tế bào Bảng 3.3: Lượng đường nấm men S cerevisiae tự cố định 26 hạt Alg Alg-Chi tiêu thụ sau 24h nuôi cấy 100ml Bảng 3.4: Đặc điểm bình lên men hạt cố định tế bào 28 alginat hạt cố định tế bào alginat – chitosan sau tái sử dụng 24h Bảng 3.5: Lượng đường trung bình tiêu thụ 100ml sau tái sử dụng 24h 31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên bảng Trang Hình 1.1: Hình ảnh mơ tả cấu trúc alginat Hình 1.2: Mơ hình vi trứng, vị trí ion Ca calci alginat Hình 1.3: Cấu trúc đặc biệt Alginic theo đơn vị monome 4 Hình 1.4 : Cấu trúc hóa học chitosan 5 Hình 1.5: Các kỹ thuật cố định tế bào Hình 1.6: Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae 11 Hình 3.1: Hạt cố định tế bào 22 Hình 3.2: Hình ảnh mẫu hạt cố định chụp kính hiển vi điện tử 22 Hình 3.3: Bình lên men tế bào nấm men S cerevisiae tự 25 10 Hình 3.4: Bình lên men tế bào nấm men S cerevisiae cố định hạt alginat 25 11 Hình 3.5: Bình lên men tế bào nấm men S cerevisiae cố định hạt alginat-chitosan 25 12 Hình 3.6: So sánh khả tiêu thụ đường sau lên men 24h hạt cố dịnh tế bào nấm men S.cerevisiae 26 13 Hình 3.7: Bình lên men tế bào nấm men S cerevisiae cố định hạt alginat sau tái sử dụng 24h 29 14 Hình 3.8: Bình lên men tế bào nấm men S cerevisiae cố định hạt alginat-chitosan sau tái sử dụng 24h 29 15 Hình 3.9: So sánh khả tiêu thụ đường sau lên men tái sử dụng 24h hạt cố dịnh tế bào nấm men S.cerevisiae 32 2+ gel tạo gel ĐẶT VẤN ĐỀ Kỹ thuật cố định xúc tác sinh học nói chung kĩ thuật cố định tế bào nói riêng có nhiều ứng dụng quan trọng nhiều lĩnh vực khoa học đời sống Các loại hình kĩ thuật mang lại nhiều hiệu kinh tế thiết thực nhanh chóng vào thực tế Cố định tế bào hiểu giam giữ tế bào không gian phản ứng giữ tính chất xúc tác tái sử dụng nhiều lần liên tục để sản xuất sản phẩm theo mong muốn Nói cách khác cố định tế bào nhằm hạn chế vận động vật lí tế bào cách cố định chúng vật thể gọi chất mang nhiều phương pháp hấp thụ, liên kết ion, liên kết nguyên tử, bọc gel mà khơng ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học chúng Với kỹ thuật cố định tế bào gel alginat, cơng nghệ sinh học cơng nghiệp hố số sản phẩm cao sản xuất liên tục loại rượu việc cố định tế bào nấm men, sản xuất acid hữu cơ, chất kháng sinh hormon việc cố định tế bào vi khuẩn đồng thời nuôi cấy mô tế bào động thực vật, kháng nguyên Các ứng dụng kỹ thuật cố định tế bào phát triển mạnh mẽ cơng nghiệp hố nhiều nước phát triển với thành tựu rực rỡ Tuy nhiên nước Việt Nam ứng dụng cố định tế bào chưa phát triển phổ biến Xuất phát từ lí chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Khảo sát số đặc tính nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định hệ gel alginat-chitosan” nhằm thực mục tiêu sau: Bào chế hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae alginate alginate-chitosan Khảo sát khả tạo ethanol tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định hệ gel alginat alginat-chitosan Khảo sát khả tái sử dụng hạt cố định hệ gel alginat alginat-chitosan CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung alginat 1.1.1 Nguồn gốc Alginat loại polymer sinh học biển phong phú giới loại polymersinh học nhiều thứ hai giới sau cellulose Alginat phát Stanford năm 1881, acid hữu có tảo nâu, trọng lượng phân tử từ 32.000 – 200.000 [7] Nguồn alginat chủ yếu tìm thấy thành tế bào gian bào tảo nâu biển (thuộc họ Phaeophyceae), tảo bẹ Macrocystis pyrifera, Nodosum ascophyllum loại Lamminaria nhiều tảo nâu, dạng muối Alginat Alginat tồn dạng không tan acid alginic alginat canxi magie (kí hiệu: AlgCa, AlgMg) bền vững thành tế bào rong, tạo nên cấu trúc lưới gel bền thành tế bào rong nâu [2] 1.1.2 Cấu trúc, đặc điểm, tính chất Alginat tên gọi chung cho muối acid alginic Acid alginic acid hữu có họ tảo nâu (thuộc họ Phaephyceae) Alginat polyme có monome hai acid manuronic (viết tắt M) acid guluronic (viết tắt G) gắn với liên kết – glycosid [18 Alginat có t lệ khối G cao (t số M G thấp) tạo gel cứng Ngược lại, alginat chủ yếu khối M gel hình thành mềm đàn hồi [35] H nh 1.1 H nh ảnh m ả cấu c a gina Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, r tiền ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Alginat có hai tính chất quan trọng độ nhớt dung dịch khả tạo gel 18] Độ nhớt dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh phân tử alginat Ngoài ra, độ nhớt dung dịch thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH có mặt ion kim loại 14 , 22] Dung dịch alginat có khả tạo gel phản ứng với ion kim loại hóa trị II, III, tạo gel giải thích qua mơ hình vi trứng [28] Bình thường dung dịch alginat tồn block M dải hẹp block G dải gấp khúc Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+, Sr2+, ) nồng độ thích hợp tạo gel xảy Các phân tử alginat xếp lại song song nhau, phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống ch đặt trứng 20] Các ion Ca2+ khớp vào khoảng trống tạo nên mạng lưới không gian chiều Với cấu trúc gel sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò chắn chống lại yếu tố bất lợi môi trường cho ph p giải phóng vi sinh vật bao theo hướng kiểm sốt 18] Hình 1.2: M h nh vi ứng, vị ion Ca2+ ong ge o ge can i alginat Hai gốc phân tử β-D-Mannuroic acid (M) α- L-Guluronic acid (G) liên kết với liên kết 1-4 glucozid phân bố mạch Alginat theo loại khối (Block): poly-G (G-G-G-G), poly-M (M-M-M-M) poly-GM (G-M-G-M) liên kết ngẫu nhiên chu i mạch [7] Bảng 3.3: Lượng đường nấm men Saccharomyces cerevisiae tự cố định hạt alginat alginat-chitosan tiêu thụ sau 24h nuôi cấy 100ml Lƣợng đƣờng iêu hụ STT X ế bào XAlginat ong 100m XAlginat+chitosan Nồng độ đƣờng ong mẫu khởi đầu 7.32 7.28 7.22 7.40 7.30 7.22 7.20 7.40 7.90 7.82 7.60 8.00 TB 7.50 7.44 7.34 7.60 X: lượng đường nấm men Saccharomyces cerevisiae tiêu thụ sau 24h nuôi cấy 100ml môi trường lên men Nồng độ đƣờng % 7.6 7.6 7.55 7.5 7.5 7.44 7.45 7.4 7.34 7.35 7.3 7.25 7.2 X tế bào tự X alginat X alginat + chitosan Nồng độ đường mẫu khởi đầu Hình 3.6: So sánh khả iêu hụ đƣờng sau lên men 24h h t cố dịnh tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 26 Nhận xét bàn luận Kết từ bảng 3.2 cho ta thấy bình có màu vàng nhạt tương đương với độ pH khoảng 3-4, có bọt CO2 có mùi ethanol mơi trường kị khí nấm men Saccharomyces cerevisiae chuyển hố glucose tiêu thụ đường tạo bọt CO2 mùi ethanol Trong bình chứa tế bào tự có mùi ethanol mạnh có nhiều sinh khối so với bình tế bào cố định Còn bình cố định tế bào nấm men hệ gel alginat alginat-chitosan có hạt bề mặt, có vài hạt chìm xuống đáy có sinh khối Từ kết bảng 3.3 hình 3.6 cho ta thấy bình lên men với tế bào tự tiêu thụ đường nhiều so với bình cố định tế bào nấm men hệ gel alginat alginat-chitosan Theo hình ảnh hình 3.3-3.6 mơ tả bảng 3.2 ta thấy bình tế bào tự có mùi ethanol mạnh, có nhiều bọt CO2 , có nhiều sinh khối tiêu thụ nhiều đường glucose so với bình cố định tế bào nấm men hệ alginat alginat-chitosan bình tế bào tự khơng bao bọc với hệ nên tế bào nấm men dễ dàng tiếp xúc với môi trường lên men tiêu thụ lượng đường gần hết so với mẫu khởi điểm Còn bình cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae hệ gel alginat tiêu thụ đường nhiều bình cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae hệ gel alginat-chitosan tế bào nấm men bao lớp alginat bình alginat-chitosan bao thêm lớp chitosan nên khả tiếp xúc với môi trường lên men dễ dàng tiêu thụ nhiều lượng đường Theo nghiên cứu Argueso cộng [15] cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae hạt canxi alginat hạt canxi alginat bao chitosan sử dụng glucose cho trình lên men Đối với cố định tế bào, natri alginat 3%, dung dịch canxi clorid 2% dung dịch chitosan 0,25% Các hạt ngâm dung dịch canxi clorid 2% Còn hạt canxi alginat bao chitosan ngâm 30 phút dung dịch chitosan 0,25% Để so sánh hiệu suất tế bào cố định, thí nghiệm song song sử dụng tế bào tự đánh giá khả sản xuất ethanol HPLC theo thời gian Từ kết thí nghiệm JAY cho thấy, nồng độ ethanol thời gian cuối sau 10h, tế bào tự có nồng độ ethanol cao tế bào cố định Nhưng tế bào cố định hat alginat có nồng độ ethanol cao tế bào cố định alginat bao chitosan 27 Như vậy, tế bào tự lên men mạnh nhanh so với hạt cố định tế bào nấm men tương đương với lượng tiêu thụ đường tế bào tự nhiều hạt cố định tế bào hệ gel alginat alginat-chitosan Khi sử dụng chitosan bao hạt cố định alginat ảnh hưởng đến kết lượng tiêu thụ đường so với tế bào cố định alginat không bao chitosan khả chịu lực chitosan chitosan hoạt động rào cản chất sản phẩm nên làm cho tăng trưởng tế bào môi trường lên men thấp so với hạt khơng bao chitosan.Vì khố luận tiến hành khảo sát khả tạo ethanol tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định gel alginat – chitosan so sánh khả tiêu thụ đường hạt cố định tế bào với tế bào tự nghiên cứu 3.3 Khảo sát khả dụng h t cố định hệ gel alginat alginat-chitosan 3.3.1 Khảo sát ượng bình hạt cố định tế bào Saccharomyces cerevisiae hệ gel alginat alginat-chitosan sau lên men tái sử dụng 24h Mục đ ch: Khảo sát khả tái sử dụng hạt cố định tế bào Saccharomyces cerevisiae hệ gel alginat alginat-chitosan sau lên men tái sử dụng 24h Tiến hành: Sau lên men lần định lượng Vớt hạt rửa nước cất lần tiếp tục tiến hành lên men lần Chuẩn bị bình chứa 100 ml môi trường lên men cho hạt cố định tế bào alginat hạt cố định tế bào alginat – chitosan vào để tủ ấm 30oC 24h điều kiện kị khí Quan sát tượng bình Kết quả: Trình bày bảng 3.4 hình 3.7-3.8 Bảng 3.4: Đặc điểm bình lên men h t cố định tế bào alginat h t cố định tế bào alginat – chitosan sau tái sử dụng 24h STT Đặc điểm Cố định tế bào alginat Màu sắc Vàng nhạt 28 Cố định tế bào alginatchitosan Vàng nhạt Độ Trong Trong Bọt CO2 Nhiều Ít bình alginat Mùi Có mùi ethanol Có mùi ethanol Trạng thái hạt, tế bào Hạt chìm, vài hạt Hạt chìm, nhiều hạt bình alginat, có hạt bị vỡ Hình 3.7: Bình lên men tế bào nấm Hình 3.8: Bình lên men tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cố men Saccharomyces cerevisiae cố định định h t alginat sau tái sử h t alginat-chitosan sau tái dụng 24h sử dụng 24h Nhận xét bàn luận: Từ bảng kết 3.2 hình 3.7-3.8 cho thấy, hạt cố định tế bào alginat alginat-chitosan sau lên men tái sử dụng 24h chím xuống đáy có hạt lên bình cố định tế bào alginat-chitosan lại có hạt lên bề mặt nhiều bình cố định tế bào alginat có hạt bị vỡ Còn bình cố định tế bào alginat lại sinh nhiều bọt khí CO2 bình cố định tế bào alginat-chitosan Tuy bình cố định tế bào alginat alginat-chitosan có sinh khối có mùi ethanol 29 Theo nghiên cứu nhóm tác giả Juliana C Duarte cộng [25] đánh giá ảnh hưởng hệ gel canxi- alginat cố định tế bào lên men ethanol cố định tế bào Saccharomyces cerevisiae hạt canxi alginat hạt canxi alginat bao chitosan sử dụng glucose trình lên men để sản xuất ethanol Sự cố định tế bào hạt alginat canxi hạt canxi alginat bao chitosan cho phép tám chu kỳ tái sử dụng liên tục 10h m i lần thực với nồng độ ethanol cuối ổn định Từ kết thí nghiệm cho thấy sau chu kỳ thứ tám, có vết vỡ đáng kể hạt làm cho chúng không phù hợp để tái sử dụng Theo nghiên cứu “Cố định tế bào nấm men ứng dụng lên men cồn rỉ đường” 6]: Các điều kiện cố định tế bào nấm men phù hợp cho trình lên men cồn từ rỉ đường phương pháp lên men liên tục khảo sát, bao gồm nồng độ Na-alginat, nồng độ CaCl2, tốc độ dòng chảy tạo hạt, mật độ tế bào dung dịch gel Ngoài đánh giá việc tái sử dụng tế bào nấm men cố định lên men cồn môi trường rỉ đường qua lần lên men Kết cho thấy điều kiện cố định tế bào thích hợp nồng độ chất mang Na-alginat %, nồng độ dung dịch tạo gel CaCl2 %, mật độ giống thích hợp dịch chất mang 109 tế bào ml gel, tốc độ dòng chảy tạo hạt tế bào cố định cho hệ thống tạo hạt 24 kim (đường kính hạt 0,5 cm) 200 ml phút Ngoài kết đánh giá lên men cho thấy sau lần lên men hạt tế bào cố định tái sử dụng có hoạt lực tốt, nồng độ cồn tạo giảm nhẹ (từ 11 %v v xuống 10,5 % v v) so với lần đầu sử dụng Như vậy, cố định tế bào hệ gel alginat alginat-chitosan lên men tái sử dụng bị hạn chế số lần tái sử dụng Vậy thực hành theo phương pháp cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae hệ gel alginat (ở mục 2.3.5), phương pháp cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae hệ gel alginat-chitosan (mục 2.3.6) phương pháp lên men (mục 2.3.3) phù hợp tái sử dụng, mang lại nhiều lợi ích, giảm bớt chi phí tiệt kiệm thời gian Vì khoá luận tiến hành khảo sát khả tái sử dụng hạt cố định tế bào Saccharomyces cerevisiae hệ gel alginat alginat-chitosan sau lên men tái sử dụng 24h nghiên cứu 30 3.3.2 Khảo sát khả năn ạo Ethanol sau tái sử dụng Mục đích: Khảo sát khả sinh ethanol tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định so sánh khả năn i u hụ đường hạt cố định tế bào gel alginat với hạt cố định tế bào gel alginat-chitosan au l n men ụn au 24h Tiến hành: Sau 24h lên men tái sử dụng hạt cố định tế bào gel alginat alginat-chitosan Tiến hành định lượng nồng độ glucose mẫu m i mẫu tiến hành ba lần để lấy kết trung bình Mẫu lên men tái sử dụng 24h bình: Bình chứa hạt cố định alginat Bình chứa hạt cố định alginat-chitosan Tính tốn lượng Glucose tiêu thụ bình theo cơng thức (mục 2.3.7) Kết quả: Bảng 3.5: Lƣợng đƣờng ung b nh iêu hụ ong 100m au dụng 24h Lượng đường tiêu thụ 100ml STT XAlginat XAlginat+chitosan Nồng độ đường mẫu khởi đầu 7.90 7.80 8.0 7.92 7.85 8.0 7.90 7.81 8.0 TB 7.91 7.82 8.0 31 Nồng độ đường % 7.95 7.91 7.9 7.82 7.85 7.8 7.75 7.7 X alginat X Alginat+chitosan Nồng độ đường mẫu khởi đầu Hình 3.9: So sánh khả iêu hụ đƣờng sau lên men tái sử dụng 24h h t cố dịnh tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Nhận xét bàn luận: Theo kết bảng 3.5 cho thấy: sau lên men tái sử dụng 24h khả tiêu thụ đường bình tăng lên Tuy bình hạt cố định tế bào alginat tiêu thụ đường nhiều bình hạt cố định tế bào alginat-chitosan tương đương với kết bảng 3.4 cho ta thấy bình hạt cố định tế bào alginat sinh nhiều bọt CO2 bình hạt cố định tế bào alginat-chitosan có nghĩa bình alginat tạo ethanol nhiều bình alginat-chitosan Vậy tỏ tái sử dụng lại khả tiêu thụ đường hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae hệ gel alginat alginat-chitosan không thay đổi mặt kết khác Theo nghiên cứu nhóm tác giả Juliana C Duarte cộng [25]: Các tế bào Saccharomyces cerevisiae cố định hạt alginat canxi hạt alginat canxi bao chitosan nghiên cứu trình lên men glucose sucrose để sản xuất ethanol Việc lên men theo lô tiến hành máy lắc đánh giá cách theo dõi nồng độ chất sản phẩm HPLC Sự cố định tế bào hạt alginat hạt alginat bao chitosan cho phép tái sử dụng hạt tám chu trình lên 32 men 10 m i lần Nồng độ cuối ethanol sử dụng tế bào tự 40g L-1 sản lượng sử dụng đường glucose sucrose nguồn carbon 78% 74,3% Đối với tế bào cố định hạt alginat canxi, nồng độ ethanol cuối từ glucose 32,9 ± 1,7 g L-1 với suất 64,5 ± 3,4%, nồng độ ethanol cuối từ sucrose 33,5 ± 4,6 g L-1 với sản lượng 64,5 ± 8,6% Đối với tế bào cố định hạt alginat bao chitosan, nồng độ ethanol từ glucose 30,7 ± 1,4 g L-1 với suất 61,1 ± 2,8%, nồng độ ethanol cuối từ sucrose 31,8 ± 6,9 g L-1 với sản lượng 62,1 ± 12,8% Sau chu kỳ thứ tám, có vết vỡ đáng kể hạt làm cho chúng không phù hợp để tái sử dụng Vậy ta thấy kết theo nghiên cứu tác giả Juliana C Duarte cộng với kết nghiên cứu bảng 3.5 khơng có khác biệt mấy, nồng độ ethanol tế bào cố định hạt alginat cao nồng độ ethanol tế bào cố định hạt alginat bao chitosan Theo nghiên cứu Bai cộng [17], Lin Tanaka [32], Najafpour cộng [36], Puligundla công 39], sử dụng phương pháp cố định tế bào để sản xuất ethanol kết cho thấy sản lượng cao tế bào tự Theo nghiên cứu Zhou [43] chứng rằng, phương pháp cố định tế bào hạt alginat khơng khơng tốn mà dễ thực cung cấp điều kiện nhẹ, có tiềm cao cho ứng dụng cơng nghệ sinh học hạt canxi alginat nguồn cung cấp thông dụng cho cố định tế bào Hạt canxi alginat mang lợi ích khả tương thích sinh học tốt, chi phí thấp, dễ sử dụng dễ chuẩn bị Tuy nhiên, có số nhược điểm liên quan đến việc sử dụng chúng thối hóa gel sức mạnh học thấp Như vậy, việc lên men tái sử dụng hạt cố định tế bào gel alginat alginat-chitosan 24h, khả tiêu thụ lượng đường tế bào cố định nhiều trước tái sử dụng, nên hạt sau tái sử dụng sản xuất ethanol tốt Vì khố luận tiến hành khảo sát khả sinh ethanol tế bào nấm men S.cerevisiae cố định sau tái sử dụng 24h nghiên cứu 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài giải số mục tiêu sau: Bào chế hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae alginat alginat-chitosan Hạt cố định alginat hạt cố định alginat-chitosan tạo hạt hình cầu có kích thước cỡ 3-4 mm Bổ sung chitosan hầu khơng làm hạt thay đổi hình dạng, độ đồng tác động đến kích thước hạt tăng nhẹ Khảo sát khả tạo Ethanol tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định gel alginat – chitosan Tế bào tự lên men mạnh nhanh so với hạt cố định tế bào nấm men lượng tiêu thụ đường tế bào tự nhiều hạt cố định tế bào hệ gel alginat alginat-chitosan Khảo sát khả tái sử dụng hạt cố định hệ gel alginat alginatchitosan + Sau 24h lên men tái sử dụng hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae, lượng tiêu thụ đường tế bào cố định nhiều trước tài sử dụng, nên hạt sau tái sử dụng sản xuất ethanol tốt + Tế bào cố định hệ gel alginat alginat-chitosan lên men tái sử dụng có khả sản xuất ethanol bị hạn chế số lần tái sử dụng KIẾN NGHỊ Vì thời gian có hạn nên chưa nghiên cứu hết vấn đề xung quanh trình cố định tế bào bên cạnh kết thu được, để hồn thiện nâng cao tính ứng dụng thực tế, đề tài xin đưa số đề xuất sau: + Khảo sát ảnh hưởng chitosan đến cấu trúc hạt cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae + Khảo sát ảnh hưởng nồng độ alginat chitosan lên trình cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bách khoa toàn thư mở Wikipedia: https://vi.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae Bộ Y Tế (2008), thuật o chế v inh ược h c ạng thuốc, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 218-222 Bộ môn Công nghiệp dược (2017), Thực tập k thuật sản xuất ược phẩm, Đại học Dược Hà Nội, tr 57-58 Nguyễn Lân Dũng công (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, tr.11, 87 Lưu Thị Hương (2014), “Nghiên cứu cố định tế bào Bacillus subtillis natto alginat”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Hương, Đặng Hồng Ánh công (2012), “Nghiên cúu cố định tế bào nấm men ứng dụng lên men cồn từ rỉ đường” Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, số 1, Đại Cồ Việt, Quận HBT, Hà Nội Viện Công nghiệp Thực phẩm, số 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Khoa cơng nghệ thực phẩm (2012), “Tìm hiểu cấu trúc, tính chất, chức ứng dụng Alginate”, Đại học công nghiệp thực phẩm Tp.HCM Bùi Thị Kim Lanh (2017), “Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang calcialginat bao chitosan”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Phạm Thị Hồng Nga (2007), “Tổng quan tài liệu phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang”, đồ án môn công nghệ thực phẩm, Đại học quốc gia Tp.HCM 10 Ngơ Đăng Nghĩa (1999), “Tối ưu hố quy trình cơng nghệ sản xuất alginat natri từ rong mơ Việt Nam ứng dụng sản xuất rượu vang” Luận văn thạc sĩ, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội 11 Nguyễn Văn Toàn (2017), “Khảo sát ảnh hưởng chitosan đến số tính chất vi nang probiotic alginat-chitosan”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội 12 Lê Ngọc Tú (2002), Hoá sinh công nghiệp, NXB Giáo dục tr.15 Tiếng Anh 13 Abadias M, Benabarre A, et al (2001), "Effect of freeze drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake", International Journal of Food Microbiology, 65(3), pp 173-182 14 Amir Hussain, Martin Kangwa, Nivedita Yumnam and Marcelo Fernandez-Lahore, “Operational parameters and their in uence on particle-side mass transfer resistance in a packed bed bioreactor”, Hussain et al AMB Expr (2015) 5:51 DOI 10.1186/s13568015-0138-z 15 Argueso JL, Carazzolle MF, Mieczkowski PA, Duarte FM, Netto OVC, Missawa SK, Galzerani F, Costa GGL, Vidal RO, Noronha MF et al (2009) “Genome structure of a Saccharomyces cerevisiae strain widely used in bioethanol production” Genome Res 19:2258–2270 16 Arnaud J.P, Lacroix C et all (1992), "Effect of agitation rate on cell release rate and metabolism during continuous fermentation with entrapped growing Lactobacillus casei subsp casei", Biotechnology Techniques, 6(3), pp 265- 270 17 Bai FW, Anderson WA, Moo-Young M (2008), “Ethanol fermentation technologies from ugar an tarch fee tock ” Biotechnol Adv 3, pp 89–105 18 Feldmann, Horst (2010) “Yea t” Molecular an Cell Biology Wiley-Blackwell 19 Filomena Nazzaro, Florinda Fratianni, Raffaele Coppola, Alfonso Sada, Pierangelo Orlando (2009), “Fermentative ability ò alginat-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and sủvival under simulated gastrointestinal conditions”, Journal of Functional Food, 391-323 20 Ghulam Murtaza et al (2011), "Alginate microparticles for biodelivery: A review", African journal of pharmacy and pharmacology 5(25), pp 2726- 2737 21 Gomes Ana MP, Malcata F Xavier (1999), "Bifidobacterium spp and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics", Trends in Food Science & Technology, 10(4), pp 139157 22 Grant Gregor T et all (1973), "Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: the egg-box mode", FEBS letters, 32(1), pp 195-198 23 Jankowski T., M Zielinska et all (1997), "Encapsulation of lactic acid bacteria with alginate/starch capsules", Biotechnology Techniques, 11(1), pp 31-34 24 Jame L Schreve, Jinnie M Garett (2003), Yeast Agp2p and Agp3p function as amino acid permeases in poor nutrient cinditions, Department of Biology, Hamilton College, Clinton, NY 13323, USA Received 18 November, p.2-43 25 Juliana C Duarte 1,2 , J Augusto R Rodrigues 1* , Paulo J S Moran , Gustavo P Valenỗa and Josộ R Nunhez, Duarte et al “Effect of immobilized cells in calcium alginate beads in alcoholic fermentation”, AMB Express (2013), 3:31 http://www.amb-express.com/content/3/1/31 26 Keith H Steinlraus (2004), Industrialization of indigenous fermented foods, p.227230 27 Koo Sun-Mo, Cho Young-Hee, et al (2001), "Improvement of the stability of Lactobacillus casei YIT 9018 by microencapsulation using alginate and chitosan", Journal of Microbiology and Biotechnology, 11(3), pp 376-383 28 Kourkoutas, Y., Bekatorou, A., Banat, I.M., Marchnt, Koutionas, A.A., “Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol berverages production: a view”, Food Microbiology, Vol.21, 2004, 377-397 29 Kourkoutas, Y Kanellaki, M Koutinas, A.A., Apple Pieces as immobilization support of various microorganisms, LWT, Vol 39, 2006, 980-986 30 Krasaekoopt W., Bhandari B., Deeth H (2004), "The influence of coating materials on some properties of alginate beads and survivability of microencapsulated probiotic bacteria", Int Dairy J, 14, pp 737-743 31 Latha Sabikhi, R Dabu, D.K Thompkinson Suman Kapila (2008), “Resistance of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus LA1 to Processing Treatments and Simulated Gut Conditions”, Food Bioprocess Technol (2013) 3, pp 586-593 32 Lin Y, Tanaka S (2006), Ethanol fermentation from biomass resources: Current state and prospects Appl Microbiol Biot 3, pp 627–642 33 Murtaza Ghulam, Waseem Amir, et al (2011), "Alginate microparticles for biodelivery: A review", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(25), pp 2726-2737 34 Murata Y, Toniwa S et all (1999), "Preparation of alginate gel beads containing chitosan salt and their function.", International Journal of Pharmaceutics, 176(2), pp 265–268 35 N.P.D (NASATI), https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161122174652.htm, 22/11/2016 36 Najafpour G, Younesi H, Ismail KSK.(2004), Ethanol fermentation in an immobilized cell reactor using Saccharomyces cerevisiae Bioresource Technol 3, pp 251–260 37 Olav Smidsrød, R.M Glover et all (1973), "The relative extension of alginates having different chemical composition", Carbohydrate Research, 27(1), pp 107-118 38 Pramod Kumar Singh, Parneet Kaur Deol and Indu Pal Kaur (2011), “Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginat beads for effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer”, Food Funct, 2012, 3, 83-90 39 Puligundla P, Poludasu RM, Rai JK, Obulan VSR (2011), Repeated batch ethanolic fermentation of very high gravity medium by immobilized Saccharomyces cerevisiae Ann Microbiol 3, pp 863–869 40 Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Marian E Quinn (2009), The Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press (Handbook) 41 Sinha V R., Singla A K et all (2004), "Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs", Int J Pharm, 274(1-2), pp 1-33 42 www.ias.ac.in/currsci/ju110/articles17.htm 43 Zhou Z, Li G, Li Y (2010), Immobilization of Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase on hybrid alginate-chitosan beads Int J Biol Macromol,pp.21–26 PHỤ LỤC Bảng ác định nồng độ đƣờng heo phƣơng pháp Schoo - Regenbogen Tiêu thụ Na2S2O3 0,1N (ml) Glucose (mg) Tiêu thụ Na2S2O3 0,1N (ml) 3,2 13 Tiêu thụ Na2S2O3 0,1N (ml) 42,4 3,1 6,3 3,4 14 45,8 3,1 9,4 3,5 15 49,3 3,2 12,6 3,5 16 52,8 3,3 15,9 3,5 17 56,3 3,3 19,2 3,5 18 59,8 3,2 22,4 3,5 19 63,3 3,2 25,6 3,6 20 66,9 3,3 28,9 3,8 21 70,7 3,4 10 32,3 3,8 22 74,5 3,4 11 35,7 4,0 23 78,5 3,4 12 39,0 4,1 24 82,6 3,4 4,0 25 86,6 ... Khảo sát số đặc tính nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định hệ gel alginat- chitosan nhằm thực mục tiêu sau: Bào chế hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae alginate alginate -chitosan. .. hạt cố định hệ gel alginat alginat -chitosan  Khảo sát tượng hạt cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae hệ gel alginat alginat -chitosan sau lên men tái sử dụng 24h  Khảo sát khả lên men. .. alginate -chitosan Khảo sát khả tạo ethanol tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định hệ gel alginat alginat -chitosan Khảo sát khả tái sử dụng hạt cố định hệ gel alginat alginat -chitosan CHƢƠNG