ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -oOo - Thạc só NGUYỄN TIẾN DŨNG Tài liệu môn PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHỆM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM (Tài liệu sử dụng nội bộ) Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 http://www.ebook.edu.vn Chương I CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯC KIỂM SOÁT TRONG NƯỚC, THỰC PHẨM VÀ MỸ PHẨM Có nhiều vụ ngộ độc hay bệnh gây thực phẩm diễn ra, mặt dù có luật an toàn vệ sinh thực phẩm ban hành ngày chặt chẻ quan tâm cộng đồng Cho đến có cách hiểu phân biệt không thống khái niệm bệnh gây thực phẩm hay ngộ độc thực phẩm Song để phân biệt hai vần đề thông thường dựa vào khái niệm sau: - Ngộ độc thực phẩm biểu bệnh tiêu thụ thực phẩm có chứa số lượng lớn vi sinh vật, chúng nhân lên nhanh trình chế biến hay bảo quản Các vi sinh vật diện số lượng ban đầu thực phẩm hay nhiễm vào tiếp xúc qua trình chế biến - Các bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm tiêu thụ thức ăn chứa vi sinh vật hay sản phẩm chúng, không phụ thuộc vào số lượng nhiều hay không phụ thuộc vào chế biến hay bảo quản Ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm diễn nhiều người, có triệu chứng thời điểm sau tiêu thụ thực phẩm Tuy nhiên mức độ tác động đến người khác khả đáp ứng với độc tố ngưới khác phụ thuộc vào thể trạng khả trung hoà độc tố người Triệu chứng ngộ độc thực phẩm thường có biểu tiêu chảy, chóng mặt, nôn mữa, đau nhức người, sốt, đau đầu Các biểu triệu chứng phụ thuộc vào loài vi sinh vật gây nên Mức độ nguy hiểm triệu chứng bệnh gây nên độc tố chúng tiết vào thực phẩm hay tế bào chúng gây nên Để gây ngộ độc thực phẩm, vi sinh phải diện với số lượng tế bào lớn phụ thuộc liều lượng chủng loại nhiễm vào, thực phẩm phải có kiện lý hoá thích hợp cho vi sinh vật phát triển, nhiệt độ thời gian phải thích hợp cho trình tăng trưởng chúng từ chúng nhiễm vào tiêu thụ để vi sinh vật nhân lên đến đủ liều lượng hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại Các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm Salmonella Số lượng Salmonella đủ để gây ngộ độc chúng diện triệu tế bào gam thực phẩm Các triệu chứng Salmonella gây thường tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn Thời gian ủ bệnh triệu chứng biểu thường sau 12-36 kể từ tiêu thụ thực phẩm bò nhiễm Triệu chứng thường kéo dài từ 2-7 ngày Không phải tất người tiêu thụ thực phẩm bò nhiễm Salmonella điều có biểu bệnh, ngược lại số người triệu chứng lâm sàng tiêu thụ phải thực phẩm nhiễm vi sinh vật chúng tiết Các loại thực phẩm có nguy bò nhiễm Salmonella thòt gia cầm, sản phẩm thòt, trứng sản phẩm trứng, thủy sản Nguồn nhiễm vi sinh vật vào loại thực phẩm thường có nguồn gốc từ đường ruột người loài động vật, chúng nhiễm gián tiếp hay trực tiếp Salmonella gây nên bệnh sốt thương hàn thuộc serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C dòng thường không gây bệnh cho loài động vật Campylobacter Đây vi sinh vật gây nên bệnh viêm nhiễm đường ruột, phương pháp phân lập chứng minh vi sinh vật diện khắp nơi Campylobacters hệ vi http://www.ebook.edu.vn sinh vật nhiều loại động vật chim Nhưng dòng có khả gây ngộ độc thực phẩm phát triển nhiệt độ thấp 30oC, vi sinh vật ưa nhiệt bắt buột Sản phẩm sữa thòt gia cầm nguồn gây nên ngộ độc vi sinh vật Nước nguồn mang bệnh Campylobacters vi sinh vật nhạy với nhiệt độ, chúng bò tiêu diệt hoàn toàn phương pháp trùng Pasteur, chúng sống sót thực phẩm có môi trường acid Chúng phát triển thực phẩm bảo quản điều kiện hiếu khí mà phát triển loại thực phẩm hút chân không Khi xâm nhiễm Campylobacter, thời gian ủ bệnh thường từ 2-11 ngày Các triệu chứng vi sinh vật gây nên đau nhức, tiêu chảy, sốt, đau đầu, khó chòu, chuột rút, lạnh cóng, mê sản Thỉnh thoảng có biểu bệnh giống cảm cúm Clostridium perfringens Quan niệm ngộ độc thực phẩm Clostridium perfringens gây có thay đổi năm gần Theo quan niệm trước cho dòng C.perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử không làm tan máu gây ngộ độ thực phẩm Nhưng năm gây dòng nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu tìm thấy vụ ngộ độc vi sinh vật gây nên Vì bào tử C perfringen kháng nhiệt nên chúng thường sống sót qua trình nấu chín Tuy nhiên phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc với nhiệt Nếu bào tử sống sót, gặp điều kiện thích hợp chúng nẩy mầm nhân lên Khi đun nấu thức ăn nhiệt độ thấp thời gian ngắn làm cho dòng kháng nhiệt tồn chúng gây tái nhiễm sau bảo quản Các nguồn thực phẩm gây ngộ độc với vi sinh vật thường thòt gia cầm, loại gia cầm lớn đông lạnh sâu, thòt hầm chứa C perfringens tìm thấy đất, phân người loại thực phẩm khác Các triệu chứng vi sinh vật gây thường đau thắt vùng bụng, tiêu chảy Thời gian ủ bệnh từ 12-24 Các triệu chứng lâm sàng gây nên độc tố chúng Clostridium botulinum Đây vi sinh vật phân bố khắp nới đất, nước gia súc loài thủy sản Vi sinh vật sinh độc tố gây bệnh ngộ độc thòt cho người (botulism) Bệnh biểu nghiêm trọng người Bệnh gây độc tố hình thành C.botulinum nhiễm thực phẩm Triệu chứng lâm sàng bệnh ói mửa, buồn nôn, sau có biểu rối loạn thành kinh choáng váng, rối loạn thò giác, rối loạn cổ miệng, đau vùng ngực, khó thở tê liệt, dẫn đến tử vong Các triệu chứng biểu sau 1236 sau tiêu thụ thục phẩm nhiễm độc tố Các triệu chứng thường kéo dài 2-6 ngày tuỳ theo tình trạng nhiễm độc sức khoẻ củng bệnh nhân Các loại thực phẩm thòt, rau không bảo quản qui đònh hay lây nhiễm từ đất, phân động vật hay chế biến không đủ nhiệt độ trước dùng, sản phẩm đóng hộp không qui cách có nguy nhiễm vi sinh vật rấy cao Điều kiện thích hợp cho việc hình thành độc tố vi sinh vật điệu kiện môi trường kỵ khí, pH trung tính, vi sinh vật khác cạnh tranh Độc tố botuline C botulinum tiết gồm số loại khác A, B, C1, C2, D, E, F, G độc tố protein có trọng lượng phân tử lớn khoảng triệu danton Nhưng dạng có tác động mạnh đến người A, B, E loại độc tố sinh học có cường độ mạnh Trong năm gầy đây, vụ ngộ độc botulism gây C.botulinum dòng E thường phát tiêu thụ cá sản phẩm thủy sản Dòng vi sinh vật thường xuyên phân lập từ mẫu bùn đáy cửa sông Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus VSV có khả sản sinh số loại độc tố đường ruột bền nhiệt, không bò phân huỷ đun 100oC khoảng 30 phút Khi vi sinh vật xâm nhiễm http://www.ebook.edu.vn vào thực phẩm, chúng tiết độc tố vào sản phẩm gây độc Khi người tiêu thụ loại thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4-6 ủ bệnh bộc phát triệu chứng lâm sàng tiêu chảy, nôn mữa, triệu chứng kéo dài từ 6-8 Các loại thực phẩm có chứa hàm lượng muối cao thường có nguy nhiễm vi sinh vật jambon, kem tổng hợp, nước soup… loại thực phẩm xử lý nhiệt độ cao 40oC Các loại thuỷ sản hay thực phẩm đóng hộp thường hay bò nhiễm loài vi sinh vật Các nguồn lây nhiễm vào thực phẩm chủ yêu từ khâu chế biến nhà bếp Trong tự nhiên vi sinh vật thường tình thấy da, mũi, tóc hay lông loài động vật máu nóng Vibrio spp Các loài Vibrio có nguồn gốc từ biển, chúng cần ion Na+ để phát triển Giống Vibrio có số loài có khả gây bệnh cho người V cholerae, V parahaemolyticus, V vulnificus, V hollisae, V furnsii, V mimicus, V fluvialis, V alginolyticus V cholerae tác nhân gây nên vụ dòch tả toàn giới Loài vi sinh vật chia thành hai kiểu huyết O1 non-O1, kiểu huyết O1 bao gồm ba kiểu huyết phụ sau: Ogawa; Inaba (hai kiểu gọi chung kiểu cổ điển – Classic) kiểu Eltor (kiểu Eltor gọi kiểu O139) Hai kiễu huyết Inaba Ogawa ngày tìm thấy nước thuộc khu vực châu Trong vụ dòch tả khắp thể giới gây kiểu Eltor Khi có trận dòch V cholerae gây thường lan truyền nhanh vào nước, gây nhiễm vào thực phẩm, điều kiện vệ sinh kém, vi khuẩn lan truyền qua người dòch bệnh thêm nghiêm trọng Vi sinh vật sản sinh độc tố cholaratoxin, loại độc tố đường ruột có cường độ mạnh, cần 5μg gây nhiễm qua đường miệng gây tiêu chảy cho người trưởng thành Một số độc tố khác vi sinh tiết hemolysine có độc tính tương tự tetrodotoxin (độc tố cá nóc) hay độc tố tương tự shiga-toxin Các loại thực phẩm lan truyền V cholerae nước uống, nước trái cây, rau quả, sữa sản phẩm sữa, chí bia có khả nhiễm vi sinh vật Các loại sản phẩm thuỷ sản tươi sống, không qua gia nhiệt, gia nhiệt nhẹ hay nhiễm chéo sau gia nhiệt khuyến có nguy mang V.cholerae nghiêm trọng V parahaemolyticus loài vi sinh vật tồn phát triển môi trường có hàm lượng muối cao, chúng thường xuyên phân lập từ sản phẩm thủy sản, vùng nước ấm ven bờ biển Chúng sản sinh độc tố hemolysine bền nhiệt, chất chòu trách nhiệm cho đặc tính kháng nguyên Kanagawa Nhưng năm gần dòng V.parahaemolyticus có phản ứng Kanagawa âm tính gây bệnh Triệu chứng biểu bệnh xuất khoảng 2-96 sau tiêu thụ thực phẩm bò nhiễm, thời gian phụ thuộc vào liều lượng xâm nhiễm thể trạng bệnh nhân, loại thực phẩm tiêu thụ hàm lượng acid dày Các biểu bệnh lý vi sinh vật xâm nhiễm đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm đường ruột tiêu chảy nhẹ Các loài Vibrio khác xâm nhiễm vào thực phẩm gây nên bệnh đượng ruột có biểu bệnh lý tương tự hai loài Dó nhiên tuỳ loài liều lượng mà có biều bệnh nặng nhẹ khác Chỉ riêng loài V vulnificus không gây triệu chứng bệnh đường ruột mà chúng gây nhiễm trùng máu cho người Escherichia coli E coli vi sinh vật hiếu khí phổ biến đường tiêu hoá người loài động vật máu nóng Hầu hết dòng E coli tồn cách tự nhiên không gây hại đường tiêu hoá, ngược lại chúng đóng vai trò quan trọng việc ổn đònh sinh lý đường tiêu hoá Tuy nhiên có dòng sau gây bệnh cho người số loài động vaät: Enterobathogenic E coli (EPEC) Enterotocigenic E coli (ETEC) http://www.ebook.edu.vn Enteroinvasive E coli (EIEC) Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)/ verocytocin E.coli (VTEC) hay Ecoli O157: H7 Rõ ràng E.coli phân lập dễ dàng khắp nơi môi trường bò ô nhiễm phân hay chất thải Vi sinh vật phát triển tồn lâu môi trường Trong năm gần nhà nhiên cứu chứng minh E coli phân lập từ vùng nước ấm, không bò ô nhiễm hữu Với phân bố rộng rãi vậy, E.coli dễ dàng phân lập từ mẫu thực phẩm nhiễm vào từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước Các dòng E coli gây bệnh chúng xâm nhiễm vào người qua đường thực phẩm gây nên bệnh rối loạn đường tiêu hoá, biểu lâm sàng biến động từ nhẹ đến nặng, đe doạ mạng sống người phụ thuộc vào liều lượng, dòng gây nhiễm khả đáp ứng người Shigella Giống Shigella thành viên họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacae, chúng gồm có loài sau: S dysenteriae, S sonnei, S plexneri, S boydii Đây giống vi sinh vật có tế bào chủ đặc hiệu, chúng thích nghi phát triển tế bào chủ người loài linh trưởng Sự diện chúng môi trường nhiễm phân người loài mang vi sinh vật Shigella tồn tháng môi trường nước Các vụ ngộ độc thực phẩm Shigella gây chủ yếu tập trung nước phát triển, chế biến thực phẩm điều kiện vệ sinh Bệnh truyền trực tiếp từ người qua người Shigella chủ yếu gây nên bệnh lò trực trùng Thời gian ủ bệnh sau tiêu thụ thực phẩm bò nhiễm 1-7 ngày Các biểu triệu chứng bệnh nhẹ, biểu không rõ, thoáng qua tiêu chảy nhẹ, có biểu nghiêm trọng tiêu máu, có mảnh niêm mạc ruột, nước, sốt cao bò co rút thành bụng Các triệu chứng kéo dài 12-14 ngày hay lâu Đối với người lớn, trường hợp tử vong Shigella diễn ra, bệnh biểu nghiêm trọng trẻ em người già Hàng năm có khoảng nửa triệu người tử vong vi sinh vật gây khắp giới Sự lây nhiễm vi khuẩn Shigella chủ yếu đường miệng Nước môi trường truyền bệnh quan trọng, đặc biệt nơi vệ sinh Tuy nhiên loại thực phẩm nguyên nhân gây nên bệnh Shigella Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm qua nguyên liệu hay trình chế biến Đơi nhiễm bệnh vệ sinh cá nhân Listeria monocytogenes Trong năm gần L monocytogenes lên một tác nhân gây bệnh nguy hiểm Đối tượng gây bệnh vi sinh vật trẻ em, phụ nữ mang thai hay người già Đối với vi sinh vật gây bệnh gộ độc thức phẩm khác, chúng bộc phát bệnh người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh triệu chứng lâm sàng biểu Ngược lại L monocytogenes diện với số lượng nhỏ thực phẩm, đưa vào thể, chúng tồn chơ hội Khi có điều kiện thuận lợi, chúng nhân lên xâm nhiễm vào mô sâu gây bệnh Các bệnh vi sinh vật gây nên đường tiêu hoá tiêu chảy, sốt nhẹ Sau chúng xâm nhiễm vào đại thực bào gây nên bệnh nhiễm trùng máu, tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim mắt, xâm nhập vào bào thai gây nên sẩy thai, đẻ non hay nhiễm trùng thai nhi L monocytogenes thuộc loại vi sinh vật ưa lạnh, chúng phát triển nhiệt độ từ 2o 44 C Chúng thường phân lập từ loại thực phẩm phomat sữa, thòt cá rau chí phân lập từ nước mặt Trong tất công đoạn chế biến thực phẩm, sữa hay rau có khả xâm nhiễm vi sinh vật vật Đặt biệt công đoạn bảo quản sản phẩm nhiệt độ thấp, vi sinh vật có hội phát triển thành số lượng lớn Các sản http://www.ebook.edu.vn phẩm trùng Pasteur bảo quản nhiệt độ thấp tủ lạnh có nguy nhiễm vi sinh vật cao Các virus gây bệnh thực phẩm Các đợt dòch bệnh gây từ thực phẩm tác nhân virus vấn đề bí ẩn Nhưng số tác giả tin virus thực phẫm tác nhân gây nên bệnh hiễm nghèo Những tiến nhiên cứu virus thưc phẩm hạn chế Cho dến đặc điểm sinh lý virus đường ruột biết hạn chế Cho đến phương pháp nuôi cấy để phát virus thực phẩm chưa thể thực Nhưng với tiến kỹ thuật sinh học phân tử kỹ thuật lai phân tử, kỹ thuật PCR phát virus có hại cho người thực phẩm Sự lan truyền virus cho người qua đường thực phẩm biết từ năm 1950 Các virus gây bệnh đường ruột cho người chủ yếu có nguồn gốc từ sản phẩm thuỷ sản Cho đến biết có khoảng 100 loại virus đường ruột Nhưng vài loài số có khả gây bệnh cho người Theo Kilgen Cole (1991) loài vieus sau gây nguy hiểm cho người Hepatitis type A (HAV) Virus Norwalk Calicivirus Astrovirus Virus NonA vaø Non B Virus tồn thể không hoạt động bên tế bào, chúng tự nhân lên nước hay sản phẩm thực phẩm cho dù điều kiện hoá lý Chúng xâm nhiễm vào thực phẩm hoàn toàn trình chế biến, từ nước bò ô nhiễm Các loài nhuyễn thể ăn lọc có khả tích luỹ nhiều virus nước Hàng ngày nguyễn thể lọc 1500 lít nước, theo số lượng lớn virus vào thễ vật tích luỹ Vì mật độ virus thể nhuyễn thể cao nhiều so với môi trường nước chúng sinh sống Liều lượng gây bệnh virus thấp nhiều so với vi khuẩn người tiêu thụ thực phẩm bò nhiễm Liều lượng gây nhiễm tối thiểu số loài vurus đường ruột tương đương với số lượng diện thực phẩm mà phòng thí nghiện phát phương phát nuôi cấy Cơ thể người loài động vật nguồn chứa virus đường ruột Virus tìm thấy với số lượng lớn phân người bò nhiễm tồn nhiều ngày đến nhiều tuần Sự nhiễm phân vào thực phẩm đường gián tiếp hay trực tiếp đường xâm nhiễm virus vào thực phẩm Sự sống sót virus môi trường hay thực phẩm phụ thuộc vào yếu tố nhiệt độ, nồng độ muối, cường độ xạ mặt trời hay diện thành phần hữu khác Virus đường ruột có khả tồn nhiều tháng nước biển nhiệt độ