MỞ ĐẦU Vitamin thành phần không nhiều lại quan trọng thực phẩm Nó cần thiết cho phát triển, trì thực hoạt động chức thể người Vitamin tổng hợp chủ yếu thể thực vật vi sinh vật, người động vật tự tổng hợp vitamin Tuy nhiên có vài vitamin đặc biệt :vitamin C tổng hợp hầu hết thể động vật, vitamin A, D phát thấy thể người ,động vật khơng có thực vật Nhu cầu vitamin thể người thiết phải cung cấp đầy đủ qua thức ăn có nguồn từ động vật, thực vật, vi sinh vật.khi thiếu vitamin người động vật mắc bệnh Có nhiều vitamin chia làm nhóm lớn: vitamin tan nước vitamin tan chất béo Do vitamin có cấu tạo hóa học khác nhau, nên loại vitamin có phản ứng hóa học đặc trưng khác Người ta sử dụng phản ứng hóa học đặc trưng để định tính định lượng vitamin VITAMIN Vitamin, hay sinh tố, phân tử hữu cần thiết lượng nhỏ cho hoạt động chuyển hố bình thường thể sinh vật Có nhiều loại vitamin chúng khác chất hoá học lẫn tác dụng sinh lý Các loại vitamin Vitamin A, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, D1, D2, D3, D4, D5, E, K Vitamin A, D, E, K hòa tan chất béo Vitamin B, C hòa tan nước Vitamin A Còn có tên retinol, axerophthol Vitamin A tồn tự nhiên gồm dạng: Retinol: dạng hoạt động vitamin A, đồng hố trực tiếp thể Tiền vitamin A: tiền chất vitamin A biết đến nhiều tên bêta-caroten Tiền chất chuyển hoá ruột thành vitamin A để thể sử dụng Vitamin A1, A2 gặp trạng thái tự nhiên thể động vật: Vitamin A có nhiều chức quan trọng thể người: Thị giác: mắt cấu tạo sắc tố có chứa vitamin A Nó hấp thụ luồng thần kinh vận chuyển nhờ dây thần kinh thị giác Vì có mặt vitamin A phần thiếu việc đảm bảo thị giác người Các mơ: Vitamin A kích thích q trình phát triển biểu mơ mơ sừng, ruột đường hơ hấp Nó ảnh hưởng đặc biệt đến da, kích thích liền sẹo phòng ngừa chứng bệnh da trứng cá Sự sinh trưởng: vai trò quan trọng phát triển tế bào người, nên vitamin A yếu tố thiếu phát triển cua phôi thai trẻ em Vitamin A có vai trò phát triển xương, thiếu vitamin A làm xương mềm mảnh bình thường, q trình vơi hố bị rối loạn Hệ thống miễn dịch: hoạt động đặc hiệu lên tế bào thể, vitamin A tham gia tích cực vào sức chống chịu bệnh tật người Chống lão hoá: Vitamin A kéo dài trình lão hố làm ngăn chặn phát triển gốc tự Chống ung thư: hoạt động kìm hãm với gốc tự dẫn đến ngăn chặn số bệnh ung thư Vitamin D Còn có tên antirachitic factor, calcitriol Đây nhóm hóa chất phương diện dinh dưỡng có chất quan trọng ecgocanxiferon (vitamin D2) colecanxiferon (vitamin D3) Trong thực vật ecgosterol, tác dụng ánh nắng cho ecgocanxiferon Trong động vật người có 7-dehydro-cholesterol, tác dụng cửa ánh nắng cho colecanxiferon Vai trò: Hình thành hệ xương: vitamin tham gia vào trình hấp thụ canxi photpho ruột non, tham gia vào củng cố, tu sửa xương Cốt hóa răng: tham gia vào việc tạo độ cho người Chức khác: vitamin D tham gia vào điều hoà chức số gen Ngoài ra, tham gia số chức tiết cảu insulin, hormon cận giáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản da nữ giới Vitamin E Vitamin E chất chống oxy hoá tốt cản trở phản ứng xấu gốc tự tế bào thể Vai trò: Ngăn ngừa lão hoá: phản ứng chống oxy hoá cách ngăn chặn gốc tự mà vitamin E có vai trò quan trọng việc chống lão hoá Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamin C tạo thành nhân tố quan trọng làm chậm phát sinh số bệnh ung thư Ngăn ngừa bệnh tim mạch: vitamin E làm giảm cholestrol xấu làm tănng tuần hoàn máu nên làm giảm nguy mắc bênh tim mạch Hệ thống miễn dịch: kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình thường việc bảo vệ tế bào Vitamin B1 Còn có tên thiamin, aneurin Vitamin B1 đóng vai trò quan trọng việc tạo lượng cần thiết cho hoạt động chức người Vai trò: Đồng hố đường: vitamin B1 cần thiết cho việc tạo loại enzym (tham gia vào thành phần coenzyme) quan trọng tham gia vào q trình chuyển hố đường q trình phát triển thể Khi thiếu vitamin B1 axit pyruvic tích lũy thể gây độc cho hệ thống thần kinh Vì nhu cầu vitamin B1 thể tỉ lệ thuận với nhu cầu lượng Nhân tố ngon miệng: kích thích tạo thành loại enzyme tham gia vào q trình đồng hố thức ăn, kích thích cảm giác thèm ăn Sự cân thần kinh: Vitamin B1 tham gia điều hòa trình dẫn truyền xung tác thần kinh, kích thích hoạt động trí óc trí nhớ Vitamin B2 Còn có tên riboflavin Vitamin B2 giữ vai trò xác định phản ứng số enzyme cần thiết cho q trình hơ hấp (tham gia vào thành phần enzyme vận chuyển hiđrô) Vai trò: Cân dinh dưỡng: vitamin B2 tham gia vào chuyển hố thức ăn thành lượng thơng qua việc tham gia chuyển hoá glucid,lipid protein enzyme Nhân tố phát triển Tình trạng da Thị giác: vitamin B2 có ảnh hưởng tới khả cảm thụ ánh sáng mắt nhìn màu Kết hợp với vitamin A làm cho dây thần kinh thị giác hoạt động tốt đảm bảo thị giác người Vitamin C Còn có tên acid ascorbic Vitamin C chất chống oxy hố tốt, tham gia vào nhiều hoạt động sống quan trọng thể Vai trò: Kìm hãm lão hố tế bào: nhờ phản ứng chống oxy hoá mà vitamin C ngăn chặn ảnh hưởng xấu gốc tự do, có phản ứng tái sinh mà vitamin E - chất chống oxy hố - khơng có Kích thích bảo vệ mơ: chức đặc trưng riêng viamin C vai trò quan trọng trình hình thành collagen, protein quan trọng đốI với tạo thành bảo vệ mô da, sụn, mạch máu, xương Kích thích nhanh liền sẹo: vai trò việc bảo vệ mơ mà vitamin C đóng vai trò trình liền seo Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamin E tạo thành nhân tố quan trọng làm chậm trình phát bệnh số bênh ung thư Tăng cường khả chống nhiễm khuẩn: kích thích tổng hợp nên interferon chất ngăn chặn xâm nhập vi khuẩn virut tế bào Dọn thể: vitamin C làm giảm chất thải có hại thể thuốc trừ sâu, kim loại nặng, CO, SO2, chất độc thể tạo Chống lại chứng thiếu máu: vitamin C kích thích hấp thụ sắt ruột non Sắt nhân tố tạo màu cho máu làm tăng nhanh tạo thành hồng cầu, cho phép làm giảm nguy thiếu máu ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN A) ĐỊNH TÍNH VITAMIN I) Nhóm vitamin tan chất béo 1) Các phản ứng vitamin A (retinol) a) Phản ứng vitamin A với H2SO4 Nguyên tắc: tác dụng với H2SO4 đặc, vitamin A bị nước tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu hồng khơng bền, sau biến đổi nhanh thành màu đặc trưng lipocrom Nguyên liệu hóa chất: Dầu cá hòa tan clorofooc với tỷ lệ 1/5; H2SO4 đặc Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch vitamin A clorofooc hai giọt H2SO4 đặc Lắc đều, quan sát biến đổi màu ống nghiệm, giải thích kết b) Phản ứng vitamin A với SbCl3 Nguyên tắc: Vitamin A có tác dụng tương hỗ với SbCl3 bão hoà chlorofooc, bị nước tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu, sau có biến đổi màu ống nghiệm Hóa chất: SbCl3 bão hòa chlorofooc khơng ngậm nứơc; dầu cá Dụng cụ: ống nghiệm (1), lọ đựng hóa chất (2) Tiến hành: cho vào ống nghiệm giọt dầu cá 1ml SbCl3 bão hòa chlorofooc Quan sát xuất màu ống nghiệm, giải thích kết quả? c) Phản ứng vitamin A với FeSO4 Nguyên tắc: Trong môi trường axit, vitamin A tác dụng với FeSO tạo thành sản phẩm có màu không ổn định (đối với carotin tiền vitamin A tạo thành màu đặc trưng) Hóa chất nguyên liệu: FeSO4 bão hòa CH3COOH kết tinh, H2SO4(đ), dầu cá tươi Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô giọt dầu cá, 1ml FeSO bão hòa CH3COOH giọt H2SO4(đ) quan sát biến đổi màu ống nghiệm giải thích tượng 2) Phản ứng vitamin K với anilin Nguyên tắc: Metinon có cấu trúc tương tự vitamin K 1, tổng hợp nhân tạo, có hoạt tính sinh học cao Khi metinon tác dụng với anilin tạo thành hợp chất màu Phản ứng sau: O O CH3 H 2N CH3 Aniline NH HO CH3 O Metinon 2methyl 1,4 naphtoquinon O methyl phenyl amino 1,4 naphtoquinon (dạng oxy hoá) HO Metinon (dạng khử) Nguyên liệu hóa chất: vitamin K 0,2% cồn, anilin chưng cất lại Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml vitamin K 0,2% 10 giọt thuốc thử anilin Lắc đều, quan sát xuất màu ống nghiệm, giải thích kết 3) Các phản ứng vitamin E (Tocopherol) a) Phản ứng vitamin E với FeCl3 Nguyên tắc: Tocopherol tác dụng với FeCl3, bị oxy hóa thành tocopherylquinon xảy phản ứng sau: Hóa chất: FeCl3 5%, vitamin E 0,1% cồn Dụng cụ: ống nghiệm, lọ đưng hóa chất Tiến hành: cho vào ống nghiệm 10 giọt vitamin E 0,1% 10 giọt FeCl 5%, lắc Quan sát xuất màu ống nghiệm, giải thích kết quả? b) Phản ứng vitamin E với HNO3 Nguyên tắc: tác dụng HNO đặc, vitamin E bị oxi hóa thành hợp chất kinon Nguyên liệu hóa chất:vitamin E( 0.1 %) cồn 96 ,HNO3(đ) Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 10 giọt vitamin E (0.1 %) 1ml HNO 3(đ) lắc nhẹ, để đến phút quan sát giải thích tượng 4) Phản ứng vitamin D (canxipherol) a) Phản ứng vitamin D với anilin Nguyên tắc: môi trường axit ,vitamin D tác dụng với anilin,tạo thành hợp chất màu đặc trưng Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô giọt dầu cá, ml clorofooc giọt thuốc thử anilin,lắc ống nghiệm xuất nhũ tương có màu Đun ống nghiệm sôi 30 giây, dung dịch biến đổi thành màu đặc trưng b) Phản ứng vitamin D với SbCl3 Nguyên tắc: vitamin D tác dụng với SbCl3 clorofooc tạo thành hợp chất màu đặc trưng Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô ml dầu cá tan clorofooc Lắc quan sát màu ống nghiệm, giải thích kết c)phản ứng với brome Khi cho dung dịch Br2/CHCl3 vào dung dịch vitamin chất lỏng có màu xanh Tiến hành: Cho vào ống nghiệm giọt dầu cá sau thêm giọt dung dịch Br 2/CHCl3 chờ môtl lúc dung dịch xuất màu xanh II) Nhóm vitamin tan nước 1) Phản ứng phát huỳnh quang vitamin B1 a) phản ứng tạo thành thiocrom Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, tác dụng ferrixianuakali, tiamin bị oxi hóa thành tiocrom Dưới ánh sáng tia tử ngoại, tiocrom phát huỳnh quang có màu đặc trưng.phản ứng sau: Nguyên liệu hóa chất: Vitamin B 1%, NaOH 10%, K3[Fe(CN)6] 1%, rượu izobutilic Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 20 giọt vitamin B1 1%, 10 giọt NaOH 10% giọt K3[Fe(CN)6] 1% Lắc dung dịch xuất màu Thêm vào ống nghiệm 20 giọt rượu izobutilic, lắc đều, sau để yên, dung dịch ống tạo thành lớp ngăn cách Để ống nghiệm ánh sáng mặt trời ánh đèn tia tử ngoại, quan sát tạo thành huỳnh quang, giải thích kết b) phản ứng AgNO3 Nguyên tắc: Thiamin phản ứng với nitrat Ag kết tủa màu xám Tiến hành:Dùng 2ml dung dịch vitamin B1 ,axit hóa axit nitric lỗng 0.1% them vào ml dung dịch AgNO30.5%, màng kết tủa xuất c) Phản ứng với thuốc thử diazo (hỗn hợp axit sulfannilic natri nitric) Nguyên tắc: vitamin B1 phản ứng với thuốc thử diazo cho màu vàng da cam đỏ Nguyên tắc: Cho vào ống nghiệm 0.5 ml dung dịch axit sulfannilic vào 0.5 ml dung dich natri nitric, thêm vào vài giọt dung dịch vitamin B 10 giọt carbonat Na 10%.Lắc ống nghiệm ta thấy màu đỏ da cam 2) Phản ứng vitamin B6 (Pyridoxin) với FeCl3: Nguyên tắc: Pyridoxin tác dụng với FeCl3 tạo thành phức chất có màu đặc trưng.phản ứng sau: Hóa chất: pyridoxin 1%; FeCl3 5%; Dụng cụ: ống nghiệm (1); lọ đựng hóa chất (2) Tiến hành: cho vào ống nghiệm 1ml pyridoxin 1% giọt FeCl3, lắc Quan sát xuất màu ống nghiệm, giải thích kết quả? 3) Các phản ứng vitamin C a) Phản ứng vitamin C với ferrixianuakali (K3[Fe(CN)6]) Nguyên tắc: Vitamin C có nhóm enol linh động dễ dàng tham gia vào phản ứng oxy hoá khử với số chất như: ferrixianuakali; 2,6 – diclorophenol indolphenol, iot.phản ứng xảy sau: 10 Hóa chất: K3[Fe(CN)6] 5%; FeCl3 5%; axit ascorbic 1% Dụng cụ: ống nghiệm , lọ đựng hóa chất Tiến hành: cho vào ống nghiệm 1ml axit ascorbic 1%, 1ml K 3[Fe(CN)6] 5% giọt FeCl3 5%, lắc nhẹ Quan sát xuất màu ống nghiệm, giải thích kết quả? b) Phản ứng vitamin C với 2,6-diclorophenol indophenol (2,6D) 2,6D môi trường kiềm có màu xanh, mơi trường axit có màu hồng, tác dụng với vitamin C, phản ứng oxi hóa –khử diễn sau: Hóa chất:axit ascorrbic 1%, 2,6D 0.01%; HCl 2% Tiến hành: cho vào ống nghiệm 20 giọt 2,6D 0.01% giọt HCl 2%dung dịch xuất màu.sau cho 10 giọt B) ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN I)Xác định Vitamin A thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Chuẩn bị dụng cụ: - Hệ thống máy HPLC, Shimadzu - Cột Purospher Star RP-18e( 150x4.6mm,5um) - Cân phân tích có độ xác 0.1mg - chưng cất có ống sinhhàn hồi lưu - bình định mức 10ml - pipet loại : 0.1ml, 0.5ml,1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 11 - ống Hatch - Dụng cụ thủy tinh loại: Becher, erlen Chuẩn bị hóa chất: Hóa chất phải loại tinh khiết sử dụng để phân tích , gồm: nước cất loại dùng cho HPLC - Dietyl ete tinh khiết khơng có Peroxit - Etanol - Dung dịch Kalihydroxyde( KOH) 2M cồn : hòa tan 11.2g KOH 100ml cồn 96o - Dung dịch Kalihydroxyde ( KOH) 2% nước : Hòa tan 2g KOH 100ml nước cất - Acetonnitrile, HPLC - Na2SO4 khan Cách tiến hành: Xây dựng đường chuẩn: Nếu dùng chuẩn vitamin A phân tích thiết bị HPLC Nếu Dùng vitamin A dạng este, thí dụ vitamin A acetat, vitamin A palmitat, phải tiến hành xà phòng hóa để giải phóng vitamin A thể tự tiến hành phân tích HPLC Xây dựng đường chuẩn dùng Vitamin A palmitat Q trình xà phòng hóa: Cân 18.32 mg vitamin A palmitat tương ứng với 10mg vitamin A ( phân tử lượng Vitamin A 286, phân tử lượng vitamin A Palmitat 524) cho vào bình cầu có cổ nhám, thêm 20-40ml dung dịch KOH 2M etanol 0.5natri ascorbat lắp ống sinh hàn hồi lưu Đặt nồi cách thủy, xà phòng hóa nhiệt độ 70oC 30 phút Chuyển dung dịch nóng vào bình lóng, rửa bình cầu nhiều lần H2O cất tập trung nước rửa vào bình lóng Chú ý: lượng nước khơng lầnlượng KOH 2M để tránh hình thành nhủ tương gây Vitamin A chiết Vitamin A từ dung dịch xà phòng hóa chiết lần dietyl ete khơng có peroxit lần, lần 40ml Tập trung lớp ete chiết vào bình lóng Rửa lớp ete nhiều lần với nước cất (mỗi lần 50ml) khơng vết kiềm (thử với phenolphtalein) Loại nước dịch chiết etebằng cách lọc qua lớp Na2SO4 khan, rửa lớp Na2SO4 ba lần, lần với 10ml ete Gộp tất lốp ete vào bình lê Cơ quay đến cạn Cặn lại hòa tan acetonitrile, chuyển sang bình định mức 10ml Định mức đến vạch acetonitrile Dung dịch dùng để làm dung dịch vitamin A chuẩn gốc (1000mg/l) Dung dịch chuẩn 100ug/ml: hút xác 1ml dung dịch vitamin A chuẩn gốc 1000ug/ml vào bình định mức 10ml Định mức tới vạch ACN 12 Chuẩn bị mẫu thử : Cân khoảng 10g mẫu thử nghiền nhỏ ( cần) cho vào bình cầu thuỷ tinh có cổ nhám tiến hành xà phòng hoá ghi phần Sau rửa dịch chiết ete 15ml KOH 2% nhiều lần với nước cất ( lần 50ml) khơng vết kiềm ( thử với phenoltalein) Loại nước dung dịch chiết ete cách lọc qua lớp NaSO khan , rửa lớp Na2SO4 ba lần, lần với 10ml ete Gộp tất lớp ete vào bình lê Cơ quay đến cạn Hồ tan phần lại xác 1ml dung dịch pha động ( vortex 15giây siêu âm phút) Lọc dịch đục qua màng lọc 13mm, 0.45um thu dịch lọc tiến hành phân tích HPLC Chuẩn bị mẫu kiểm tra hiệu suất thu hồi: Cho thêm 0.5ml dung dịch chuẩn 10ng/ml vào 10g mẫu trắng đồng mẫu chách siêu âm khoảng phút tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị mẫu thử Tiến hành phân tích HPLC: Điều kiện phân tích : - pha động - tốc độ dòng - detector UV, λ= 325nm tiêm dung dịch mẫu thử nghiệm theo thứ tự sau: - Các dịch chuẩn Dựng đừơng chuẩn nồng độ chuẩn vitamin A diện tích chuẩn Vitamin A Tính tốn hệ số tương quan hồi quy tuyến tính - Dung dịch mẫu trắng - Dung dịch mẫu kiểm sốt tính hàm lượng vitamin A dịch chiết mẫu thông qua đường chuẩn xây dựng bước Tính độ thu hồi mẫu kiểm sốt (R) - Các dung dịch mẫu thử nghiệm tính hàm lượng vitamin A dịch chiết ( Co ) thông qua đường chuẩn xây dựng bước Tinh kết quả: Hàm lượng vitamin A có mẫu tính theo cơng thức sau: C = Co/m Trong đó: - C hàm lượng Vitamin A có mẫu Tính theo mg/Kg - Co hàm lượng Vatamin A dịch chiết.( Co) thông qua đường chuẩn, mg/L - m : Khối lượng (g 13 II.Định lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ 1)Phương pháp sử dụng 2,6 - diclophenol - inodophenol – DPIP a)Nguyên tắc: Vitamin C (axit ascorbic) hòa tan nước, dễ bị phân hủy tác dụng chất oxi hóa bền mơi trường axit Vì người ta thường chiết axit ascorbic mẫu phân tích dung dịch axit axit axetic 5%, axit metaphôtphoric 2% Phương pháp dựa nguyên tắc axit ascorbic có khả oxi hóa khử thuận nghịch chất thị 2,6 - diclophenol - inodophenol – DPIP Dựa vào lượng chất thị tiêu tốn tính lượng axit ascorbic có mẫu phân tích Phản ứng xẩy sau: Chất thị có khả chuyển màu PH mơi trường thay đổi từ kiềm sang axit, có màu tím khoảng PH từ đến có màu hồng PH < b)Hóa chất : Dung dịch HCl 1% CH3COOH 5% Dung dịch axit metaphosphoric (HPO3) 2% hay axit axetic 1% Dung dịch amoni oxalate (C2H8N2O4) bão hòa Tinh thể KI Dung dịch H2SO4 2% axit ascorbic (Vitamin C) tinh khiết ( bảo quản kín lọ màu tối) Dung dịch hồ tinh bột 1% Dung dịch thuốc thị DPIP 0.001N: cân 0.15g DPIP cho vào bình định mức dung tích 500 ml, them 350ml nước cất, cho tiếp dung dịch đệm phôtphat PH = 6,9 đến 7,0 đến vạch mức nước, thuốc thử bị phá hủy nhanh nên pha với dung dịch đệm Thuốc thử DPIP bảo quản bình có màu nơi tối ( khơng q ngày) Dung dịch đệm phosphate PH = 6.9 đến 7,0: trộn thể tích KH 2PO4 (9,075 gam KH2PO4 lit nước cất) thể tích Na 2HPO4 (11,867 gam Na2HPO4 2H2O lit nước cất) với trước đem dùng c)Tiến hành: Cân 10 đến 50 g rau tươi đến 10 g sản phẩm đóng hộp, tùy theo hàm lượng Vitamin C có lọ nguyên liệu Cho mẫu vào cối sứ Cho thêm 4,5 ml HCl 1% (hoặc CH 3COOH 5%) vào cối (ngập kín mẫu) Khi lấy mẫu tránh dung dụng cụ sắt đồng Nghiền mẫu không 10 phút 14 ... máu ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN A) ĐỊNH TÍNH VITAMIN I) Nhóm vitamin tan chất béo 1) Các phản ứng vitamin A (retinol) a) Phản ứng vitamin A với H2SO4 Nguyên tắc: tác dụng với H2SO4 đặc, vitamin. .. mẫu Tính theo mg/Kg - Co hàm lượng Vatamin A dịch chiết.( Co) thông qua đường chuẩn, mg/L - m : Khối lượng (g 13 II .Định lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ 1 )Phương pháp sử dụng 2,6 - diclophenol... nghiệm tính hàm lượng vitamin A dịch chiết ( Co ) thông qua đường chuẩn xây dựng bước Tinh kết quả: Hàm lượng vitamin A có mẫu tính theo cơng thức sau: C = Co/m Trong đó: - C hàm lượng Vitamin A