THỬ NGHIỆM HUYẾT THANH HỌC & HÓA MIỄN DỊCH ÁP DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN NHIỄM TRÙNG Phạm Thái Bình THỬ NGHIỆM HUYẾT THANH HỌC Mục đích thử nghiệm huyết học Tìm kháng thể đặc hiệu với loại kháng nguyên tác nhân nhiễm trùng có huyết bệnh nhân Chẩn đoán gián tiếp tác nhân nhiễm trùng Biện luận kết thử nghiệm huyết học ð Biện luận thử nghiệm huyết học phải dựa giá trò đònh lượng kết thử nghiệm ð Kết đònh lượng thường hiển thò hiệu giá kháng thể ð Hiệu giá kháng thể độ pha loãng cao huyết bệnh nhân mà thử nghiệm dương tính Biện luận kết huyết học dựa vào: − Giá trò huyết kép − Hiệu giá kháng thể đặc hiệu IgM − Hiệu giá kháng thể đặc hiệu so với giá trò cắt Biện luận kết dựa vào giá trò huyết kép (+): Hiệu giá lần Hiệu giá lần ≥4 Huyết lần 7-14 ngày ð Đối với kết đònh lượng hiển thò giá trò OD nhà sản xuất thường đưa công thức để xác đònh có gia tăng có ý nghóa đònh lượng huyết lần so với lần Huyết lần ð Hữu dụng cho lâm sàng: thấp ð Ý nghóa để chẩn đoán xác đònh: cao Biện luận kết dựa vào hiệu giá kháng thể đặc hiệu IgM Hiệu giá kháng thể (+): thử nghiệm (giá trò OD) ≥ Hiệu giá kháng thể trung bình người bình thường (giá trò OD) ð Huyết lấy lần xác đònh kháng thể đặc hiệu IgM ð Hữu dụng cho lâm sàng: cao ð Ý nghóa để chẩn đoán xác đònh: cao Biện luận kết dựa vào hiệu giá kháng thể so với giá trò cắt (+): Hiệu giá thử nghiệm ≥4 Hiệu giá cắt (+): ODhuyết ≥ k × ODgiá trò cắt ð Xác đònh hiệu giá (giá trò OD) huyết thử nghiệm so sanh với hiệu giá (giá trò OD) cắt quần thể ð Hiệu giá (giá trò OD) cắt quần thể xác đònh điều tra dòch tễ học ð Hữu dụng cho lâm sàng: cao ð Ý nghóa để chẩn đoán xác đònh: trung bình Một số thử nghiệm huyết học thông dụng ð Tụ trực tiếp (direct agglutination) ð Tụ hồng cầu thụ động (passive haemagglutination) ð Kết hợp bổ thể (complement fixation) ð ELISA phát kháng thể (antibody detection ELISA) Tụ trực tiếp (Direct agglutination) Nguyên tắc Kháng nguyên dạng hạt Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần tìm Tụ trực tiếp (Direct agglutination) Hiện tượng tiền vùng (prozone) Thừa kháng nguyên KHÔNG TỤ Kháng nguyên/kháng thể tương xứng TỤ Thừa kháng thể KHÔNG TỤ Tụ trực tiếp (Direct agglutination) Thử nghiệm Widal phát ngưng kết kháng thể kháng nguyên O H Salmonella Ứng dụng ð Widal (+): − Nhiễm trùng Salmonella − Đã chủng ngừa thương hàn trước − Có phản ứng chéo với nhiễm trùng Salmonella − Nhiễm trùng tác nhân khác sốt rét, sốt xuất huyết, Enterobacteriaceae ð Widal (-): − Không có nhiễm trùng Salmonella − Đang tình trạng mang mầm bệnh − Sự hạn chế kỹ thuật sai sót thực thử nghiệm − Ảnh hưởng điều trò kháng sinh Tụ hồng cầu thụ động (Passive Haemagglutination) Nguyên tắc Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần tìm Kháng nguyên hoà tan gắn lên bề mặt hồng cầu Tụ hồng cầu thụ động (Passive Haemagglutination) Ứng dụng Thử nghiệm TPHA (Treponema pallidum Haemagglutination) chẩn đoán giang mai Kết hợp bổ thể (Complement Fixation) Nguyên tắc Huyết (có kháng thể đặc hiệu muốn tìm) Phức hợp KN-KT tiêu thụ hết bổ thể Kháng nguyên HCC-αHCC (đặc hiệu với kháng thể muốn tìm) Hồng cầu nguyên vẹn Bổ thể Huyết (không có kháng thể đặc hiệu muốn tìm) Kháng nguyên (đặc hiệu với kháng thể muốn tìm) Bổ thể Hồng cầu bò ly giải Bổ thể không bò tiêu thụ (do bổ thể công) HCC-αHCC Kết hợp bổ thể (Complement Fixation) Ứng dụng Thử nghiệm CFT (Complement Fixation test) chẩn ñoaùn: − Brucella − Campylobacter − Chlamydia − Leptospira − Legionella pneumophila − Mycoplasma pneumoniae − Influenza A virus − Rotavirus − … ELISA phát kháng thể (Antibody detection ELISA) ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) Mẫu thử chứa KT muốn tìm Cộng hợp kháng thể gắn men đặc hiệu loài KT muốn tìm Nguyên tắc Cơ chất sinh màu (TMB, OPD…) Xuất màu, nhờ phát đònh lượng KN dựa vào trò số OD Giếng ELISA gắn KN đặc hiệu KT muốn tìm KT gắn vào KN bò tóm bắt giếng Cộng hợp gắn vào KT nhờ đánh dấu men phức hợp KN-KT ELISA phát kháng thể (Antibody detection ELISA) Ứng dụng ELISA phát kháng thể chẩn đoán: − S typhi − Chlamydia − Leptospira − … THỬ NGHIỆM HÓA MIỄN DỊCH Mục đích thử nghiệm hóa miễn dòch Phát kháng nguyên vi sinh vật, nhờ xác đònh tương đối trực tiếp tác nhân nhiễm trùng Biện luận kết hóa miễn dòch ð Kết hóa miễn dòch cần giá trò đònh tính ð Xác đònh có (dương tính) (âm tính) kháng nguyên vi sinh vật gây bệnh, không cần giá trò đònh lượng Một số thử nghiệm hoá miễn dòch (ELISA…) kết biểu giá trò OD, giá trò OD giúp người làm xét nghiệm so với OD để xác đònh kết (+) (-) Khi trả lời cho lâm sàng không cần đưa kết giá trò OD làm rối trí lâm sàng lâm sàng hiểu nhầm trò số OD lớn nhiễm trùng nặng 10 Một số thử nghiệm hoá miễn dòch thông dụng ð Tụ latex (latex agglutination) ð Tủa thạch (ouchterlony) ð Điện di miễn dòch đối lưu (counter current immuno-electrophoresis) ð Ngăn tụ hồng cầu (Haemagglutination Inhibitor) ð Miễn dòch huỳnh quang trực tiếp (direct immuno-fluorescent) ð Miễn dòch huỳnh quang gián tiếp (indirect immuno-fluorescent) ð ELISA tóm bắt kháng nguyên (antigen capture ELISA) ð Sắc ký miễn dòch phát kháng nguyên (antigen detection Immunochromatography) ð Sắc ký miễn dòch phát kháng thể (antibody detection Immunochromatography) Tụ latex (latex agglutination) Nguyên tắc Hạt latex (polystyrene 0.81µm) gắn kháng thể đặc hiệu kháng nguyên Kháng nguyên hoà tan có mẫu thử Hạt latex tụ lại 11 Tụ latex (latex agglutination) Ứng dụng Phát kháng nguyên hòa tan vi khuẩn Tủa thạch (ouchterlony) Kháng nguyên Kháng thể Ủ nhiệt độ phòng, hộp ẩm Phát kháng nguyên hòa tan vi khuẩn 12 Điện di miễn dòch đối lưu (Counter current immuno-electrophoresis) - + Kháng nguyên Trên thạch điện di agarose, khoan giếng, giếng cho kháng nguyên (gần cực âm), giếng kháng thể (gần cực dương) Kháng thể - + Trong thời gian điện di (22.5V/cm chiều dài, hay 78mA/cm chiều rộng), kháng nguyên di chuyển cực (+), kháng thể di chuyển cực (-) Sự kết hợp kháng nguyên kháng thể hình thành vạch kết tủa thấy hai giếng thạch Phát kháng nguyên hòa tan vi khuẩn Ngăn tụ hồng cầu (Haemagglutination Inhibitor) Mẫu thử có kháng nguyên muốn tìm KT đặc hiệu KN muốn tìm Mẫu thử kháng nguyên KT đặc hiệu muốn tìm KN muốn tìm Phức hợp KN-KT HC gắn KN KT tự HC gắn KN Hồng cầu không tụ Hồng cầu tụ lại 13 Ngăn tụ hồng cầu (Haemagglutination Inhibitor) Miễn dòch huỳnh quang trực tiếp (Direct immuno-fluorescent) Kháng nguyên dạng hạt (vi khuẩn, virus…) muốn tìm hay muốn đònh type Kháng thể đặc hiệu đánh dấu huỳnh quang Kháng thể bám vào kháng nguyên, làm kháng nguyên bò đánh dấu huỳnh quang Thấy kháng nguyên phát HQ xem qua kính hiển vi HQ 14 Miễn dòch huỳnh quang gián tiếp (Indirect immuno-fluorescent) Kháng nguyên dạng hạt (vi khuẩn, virus, …) biết đặc hiệu KT muốn tìm Mẫu thử có KT đặc hiệu muốn tìm Kháng thể bám vào kháng nguyên Cộng hợp : Kháng thể gắn HQ đặc hiệu loà i ng thể muốn tìm Cộng hợp gắn o kháng thể đặ c hiệ u làm phứ c hợp KN-KT bò đánh dầu HQ Quệt cổ tử cung nhuộm kháng thể huỳnh quang đặc hiệu C trachomatis Thấy kháng nguyên phát HQ xem qua kính hiển vi HQ ELISA tóm bắt kháng nguyên (Antigen capture ELISA) Mẫu thử chứa KN muốn tìm Cộng hợp kháng thể gắn men đặc hiệu KN muốn tìm Cơ chất sinh màu (TMB, OPD…) Xuất màu, phát đònh lượng KN dựa vào trò số OD Giếng ELISA gắn KT đặ c hiệ u KN muốn tìm KN bò KT đặc hiệu tóm bắt giếng Cộng hợp gắn vào KN nhờ vậ y đá nh dấu men phức hợp KN-KT 15 Sắc ký miễn dòch phát kháng nguyên (Antigen detection Immuno-chromatography) Kháng thể đặc hiệu kháng thể chuột Kháng thể đơn dòng gắn hạt vàng thể keo đặc hiệu kháng nguyên Carbohydrate C S pyogenes Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên Carbohydrate C S pyogenes Sắc ký miễn dòch phát kháng nguyên (Antigen detection Immuno-chromatography) 16 Sắc ký miễn dòch phát kháng thể (Antibody detection Immuno-chromatography) Kháng thể đặc hiệu HBSAg Kháng nguyên HBSAg gắn hạt vàng thể keo Kháng thể đặc hiệu loài kháng thể HBsAb (anti-human IgG) Sắc ký miễn dòch phát kháng thể (Antibody detection Immuno-chromatography) 17 ... − … THỬ NGHIỆM HÓA MIỄN DỊCH Mục đích thử nghiệm hóa miễn dòch Phát kháng nguyên vi sinh vật, nhờ xác đònh tương đối trực tiếp tác nhân nhiễm trùng Biện luận kết hóa miễn dòch ð Kết hóa miễn. ..Mục đích thử nghiệm huyết học Tìm kháng thể đặc hiệu với loại kháng nguyên tác nhân nhiễm trùng có huyết bệnh nhân Chẩn đoán gián tiếp tác nhân nhiễm trùng Biện luận kết thử nghiệm huyết học ð Biện... Biện luận thử nghiệm huyết học phải dựa giá trò đònh lượng kết thử nghiệm ð Kết đònh lượng thường hiển thò hiệu giá kháng thể ð Hiệu giá kháng thể độ pha loãng cao huyết bệnh nhân mà thử nghiệm