1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG – THỰC PHẨM Lớp 12DSH02 BÁO CÁO THỰC HÀNH HÓA SINH GVHD: Nguyễn Thị Hai Sinh viên: Trương Thị Thảo MSSV:1211100186 Ngô Lê Hồng Duyên MSSV: 1211100062 Cao Thị Nhâm MSSV:1211100142 Đoàn Ngọc Kiểng MSSV:1211100293 Võ Nguyễn Anh Thư MSSV:1211100192 Phan Thị Thúy Vy MSSV: 1211100283 BÀI 1: GIỚI THIỆU PHỊNG THÍ HÓA SINH, CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Lý thuyết Quy tắc làm việc phòng thí nghiệm hóa sinh I a An toàn làm việc với axit kiềm  An toàn làm việc với axit - Phải làm việc tủ hút đun nóng axit thực phản ứng với axit tự - Khi pha lỗng ln phải cho axit vào nước  An toàn làm việc với kiềm - Kiềm làm cháy da - Mang găng tay , trang làm việc với dung dịch kiềm - Thao tác tủ hút, mang mặc nạ chống độc để phòng ngừa bụi kiềm b Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm  Hóa chất thí nghiệm: - Các hóa chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, phòng thí nghiệm gọi hóa chất thí nghiệm  Nhãn hiệu hóa chất : - Hóa chất bảo quản chai lọ, thủy tinh nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hóa chất, cơng thức hóa hoc, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng phân tử, nơi sản xuất , điều kiện bảo quản  Cách sử dụng bảo quản hóa chất: - Khi làm việc với hóa chất , nhân viên phòng thí nghiệm sinh viên cần cẩn thận tráng gậy tai nạn đáng tiếc cho cho người khác - Bao đổ axit hay bazơ vào nước pha loãng - Không hút axit hay bazơ miệng mà phải dùng dụng cụ riệng như: ống bóp cao su II Cách pha chế dung dịch thí nghiệm hóa sinh:  Dung dịch : - Dung dịch hỗn hợp hai hay nhiều chất tác động tương hổ với mặt vật lí hóa học Trong dung dịch gồm có chất hòa tan dung môi  Các đơn vị nồng độ dung dịch: Nồng độ phần trăm, (% )  Nồng độ phần trăm – khối lượng, % (w/w): số gam chất tan có 100g dung dịch  Nồng độ trăm khối lượng thể tích (w/v): số g chất tan có 100ml dung dịch  Nồng độ phần trăm thể tích – thể tích , % (v/v): số ml dung chất có 100ml dung dịch  Nồng độ gam – lít, (g/L): số g chất tan có lít dung dịch  Nồng độ phân tử g hay nồng độ mol, (mol/L): số phân tử g ( hay số mol) chất tan lít dung dịch  Nồng độ đương lượng (N); số đương lượng gam (đlg) chất tan có lít dung dịch Số đương lương chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z) - Hệ số đương lượng (z) : phụ thuộc vào chất chất phản ứng mà chất tham gia  Nồng độ dung dịch bão hòa: nồng độ dung dịch tối đa chất hòa tan có mặt dung dịch  Đơn vị nồng độ dùng phép phân tích vi lượng : - Nồng độ mg/mL : số mg chất tan 1mL dung dịch - Miligam phần trăm , mg% : mg chất tan 100g dung dịch - Phần nghìn ,0/00 : số gam chất hòa tan 1000g dung dịch - Phần triệu , ppn : số mg chất hòa tan 1kg hay lịt dung dịch - Phần tỷ , ppb : sồ µg chất hòa tan có 1kg hay lít dung dịch  Cách pha dung dịch có nồng độ xác định a Pha dung dịch có nồng độ theo khối lượng ,% (w/w) - Chất tan chất rắn khan - Chất tan chất rắn ngậm nước ( CuS04.5H2O ) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn b Pha dung dịch lỗng từ dung dịch đậm đặc c Pha dung dịch bão hòa : Lấy chất tan cần pha vào becher , thêm nước cất khuấy cho tan Nếu sau khuấy , chất tan không tan hết lắng xuống phần dung dịch phía dung dịch bão hòa Nếu chất tan tan hết , thêm chất tan tiếp tục khuấy , chất tan khơng tan d Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích : Chất tan chất rắn khan - Cân lượng chất tan cần thiết , chuyển sang bình định mức , dùng nước cất hòa tan định mức đến thể tích - Chất tan chất rắn ngậm nước Khi pha dung dịch ta cần phải tính lượng kết tinh có sẵn giống phần a - Chất tan dạng lỏng : số chất tan dạng lỏng HCl, H2S04… Ngày đa số dung dịch thí nghiệm pha chế theo nồng độ khới lượng- thể tích (w/v) i - Pha dung dịch nồng độ phân tử gam: Chất tan chất rắn khan : Muốn pha dung dịch nồng độ 1M chất , ta tính khối lượng phân tử chất theo đơn vị gam Cân xác lượng chất tan , qua phễu cho vào bình định mức có dung tích lít Cho vào lượng nước cất nhỏ , lắc để hòa tan hồn toàn đưa nước cất tới mức Chuyển dunh dịch sang bình chứa, lác để trộn đồng Khi phải đun dung dịch để hòa tan, trình hòa tan có tỏa nhiệt phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ khơng khí) thêm nước tới vạch định mức - Chất tan chất rắn ngậm nước : tính lượng chất tan cần cân phải tính ln khối lượng phân tử nước - Chất tan dạng lỏng: chất tan dung dịch, ta phải tính tốn dựa vào nồng độ dung dịch  Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch a Dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn dung dịch chuẩn bị sẵn, đảm bảo xác dùng để định chuẩn dung dịch tự pha chế làm thí nghiệm  Cách pha dung dịch từ ống chuẩn: - Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng bình tia rửa chất tan có ampun vào bình định mức lit, vừa thêm nước cất vừa lắc đưa nước cất tới vạch mức - Đối với hợp chất bền vững, có thành phần khơng thay đổi NaCl, AgNO3, acid oxalic, pha dung dịch chuẩn trực tiếp cách cân xác chất cần pha, pha loãng định mức tới thể tích - Đối với chất NaOH, HCl, Na2S2O3, pha dung dịch chuẩn, chất thường không bền vững dễ thay đổi thành phần, sau pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ b Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Đối với chất dễ thay đổi thành phần dạng rắn, muốn pha dung dịch có nồng độ xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau hiệu chỉnh nồng độ dung dịch dựa vào phản ứng với dung dịch chuẩn thích hợp Đối với dung dịch dễ thay đổi trình bảo quản, lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét phản ứng trung hòa acid – base, ion gam H+ phản ứng với ion gam OH- Do đó: C1V1 =C2V2 Nếu gọi Cp nồng độ dung dịch định pha Ct nồng độ thực dung dịch ta có hệ số hiệu chỉnh K: K = Cp/Ct = Vp/Vt III Dung dịch đệm a Định nghĩa dung dịch đệm Dung dịch đệm dung dịch có pH không thay đổi nhiều lượng axit (H+ ) bazơ (OH-) Vậy, dung dịch đệm gồm cặp axit bazơ liên hợp ( axit yếu muối axit yếu bazơ yếu muối bazơ này) tỉ lệ chúng định pH dung dịch Trong thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng ví dụ ổn định pH máu hệ đệm cacbonat phosphat b Cách pha số dung dịch đệm thường dùng - Dung dịch đệm borat Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 3,6) Dung dịch đệm phosphate( pH = 5,7 – 8,0) Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (Ph = 5,0 – 8,0) Dung dịch đệm glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6) Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6) Dung dịch đệm axetat (pH = 3,6 – 5,6) Dung dịch đệm vạn 0.1 M CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Pha 1L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân X=(40x1000)/100=400(g) NaOH khô Câu 2: Nồng độ mol H2SO4 đđ là: CM = (10.d.C%)/M = (10x97x1.84)/98 = 18.2 (mol) Thể tích H2SO4 cần sử dụng là: VH2SO4 = (VH2SO4 2M CMH2SO4)/CMH2SO4 đđ = (2x500)/18.2 = 54.91(ml) Lượng nước cần bổ sung là: 500 – 54.91 = 445.09 (ml) Câu 3: Pha 250ml dung dịch CuSO4 1M, cân m = n.M = 0.25 x 250 = 62.5 (g) CuSO4.5H2O Câu 4:H2SO4 2M = H2SO4 4N C1.V1 = C2.V2  V2 = (1000 x 0.1)/4 = 25 (ml) Câu 5: - Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X= ( 10x500)/100 = 50 (g) - Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = (100x50)/40 = 125 (g) - Lượng nước cất thêm vào: 500 – 125 = 375 (g) Câu 6: - Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X = (2x500)/100 =10 (g) - Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là: Y = (100 * 10)/37 = 27.03 (g) => 27.03 /1.19 = 22.71 (ml) - Lượng nước cất thêm vào : 500 – 22.71 = 477.29 (ml) BÀI : ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS) LÝ THUYẾT  Nguyên tắc Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu hỗn hợp phản tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử phạm vi định THỰC HÀNH I Dụng cụ -Hóa chất: Dụng cụ - Máy đo màu - Cuvette d = cm, V = 4ml - Ống nghiệm có nắp dụng cụ thủy tinh khác - Bếp điện Hóa chất - Mẫu rau chứa đường (dứa) - -Thuốc thử DNS - -Dung dịch glucose chuẩn 1mg/ml (bảo quản lạnh) II Tiến hành Chiết xuất đường thực vật - Chuẩn bị mẫu thơm 20g - Giã nhỏ - Vắt lấy nước cho vào bình định mức - Thêm nước cất đủ 100ml - Pha loãng mẫu hệ số n (20,50,100,200 lần) Dựng đường chuẩn xác định hàm lượng đường Hóa chất ống1 ống2 ống3 ống ống5 ống6 ống7 Glucose 1mg/ml 0.2 0.4 0.6 0.8 Nước cất(ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Mẫu pha loãng(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 ? DNS (mol) 3 3 3 OD540nm 0.333 0.712 1.233 1.469 1.623 0.179 - Đo bước sóng 540nm - CHÚ Ý : tiến hành mẫu dựng đường chuẩn thí nghiệm đồng thời Đường chuẩn nồng độ đường khử (mg/ml) với mật độ quang OD540nm 1,8 1,6 OD540nm 1,4 1,2 y = 1,7206x + 0,0347 R² = 0,9756 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,2 0,4 0,6 C 0,8 1,2 10  Tính kết quả: Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính mg/ml đường khử dung dịch đường pha loãng Nhân với hệ số pha loãng n để lượng đường ml dung dịch gốc Chọn hệ số pha loãng n cho OD nằm giới hạn đường chuẩn Dựa vào phương trình đường tuyến tính nồng độ đường khử (mg/ml) với mật độ quang OD540 ta tính hàm lượng đường khử P mẫu phân tích X y = 1,7206x + 0,0347 ⟹ x = 𝑦−0,0347 1,7206 = 0,179−0,0347 1,7206 = 0.084 Tính hàm lượng đường nguyên liệu (mg/g) = X * n * V/m = 0.084 * 25 * 100/20 = 10.5 17 Công thức phân tử Coomasie Brilliant Blue G-250 THỰC HÀNH Dụng cụ - hóa chất Dụng cụ - Máy đo quang phổ - Ống nghiệm (14) - Pipette 5ml, 1ml (có thể thay pipetteman) - Đồng hồ bấm giây - Giấy thấm - Giá để ống nghiệm - Bình tia đựng cồn Hóa chất - Cồn 900 - Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin cân phân tích, pha ml nước cất, lắc cho tan Giữ -200C Khi dùng pha loãng 100 lần, dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml - Dung dịch thuốc thử Bradford: dd thuốc thử có thành phần 100ml sau: Coomassie Brilliant Blue: 0,005g 18 Methanol: 4,7g Phosphoric acid 85%: 8,5g Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue làm tan ethanol chai đựng màu tối có nắp Bổ sung phosphoric acid chỉnh tới 100ml nước cất Lắc đều, giữ 40C - Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp) Tiến hành - Thu dịch trích ly protein enzyme (5 g malt trích ly nước thu V = 100 ml) Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để mẫu phân tích (mẫu X) - Lập loạt ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X - Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0, lắc để yên Ở thời điểm phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc để yên, tiếp tục hết 19 Ống nghiệm X Nước cất (ml) 0.9 0.9 0.7 0.6 0.5 - Albumin chuẩn (0,1mg/ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 - TT Bradford 5 5 5 Nồng độ Albumin (µg /ml) 10 20 30 40 50 4.14 OD595nm 0.076 0.210 0.376 0.439 0.485 0.045 - Tính thời gian ống 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 595 nm Ta có giá trị OD0, thời điểm 21 phút đo ống (OD1), tương tự cách phút đo cho hết ống Ghi lại giá trị OD Tính kết quả: - Vẽ đường tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595nm ĐƯỜNG CHUẨN BSC PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 0,6 0,5 OD 595nm 0,4 0,3 y = 10,514x + 0,0015 R² = 0,9675 0,2 0,1 0 10 20 30 40 50 C (µg /ml) 60 - Dựa vào phương trình đường tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 ta tính hàm lượng protein P mẫu phân tích X 20 𝑦 = 10,514𝑥 + 0.0015  𝑥 = 𝑦 − 0,0015 0,045 − 0,0015 = = 4,14 10−3 10,514 10,514 𝑃 = 𝑥 𝑛 = 4,14 10−3 25 = 0,1035 Để tính tóan hàm lượng protein 1g mẫu cân: Protein (µg/g) = 𝑃 ∗ 𝑉 𝑚 = 0,1035 ∗ 100 10 = 1.035 CÂU HỎI ÔN TẬP: Giải thích ý nghĩa bước thí nghiệm - Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để mẫu phân tích  Phải giảm bớt nồng độ protein mẫu, để đo nồng độ quang không bị vượt giới hạn cho phép - Lập loạt ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X  Phải pha nồng độ khác để lập đường chuẩn Để xác định protein mẫu - Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0, lắc để yên Ở thời điểm phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc để yên, tiếp tục hết  Phương pháp dựa thay đổi bước sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue tạo phức hợp với protein - Tính thời gian ống 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 595 nm Ta có giá trị OD0, thời điểm 21 phút đo ống (OD1), tương tự cách phút đo cho hết ống Ghi lại giá trị OD  Trong 20 phút thuốc nhuộm kết hợp với protein thuốc nhuộm hấp thu cực đại bước sóng 595 nm 21 Thảo luận yếu tố dẫn đến sai số  Do sai thao tác tiến hành thí nghiệm  Mẫu protein chuẩn bị khơng chuẩn  Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm khơng chuẩn  Do vận chuyển mẫu không cách  Lấy mẫu không theo thể tích u cầu  Ghi khơng xác số  Thao tác đo khơng xác  Máy đo OD không chuẩn Áp dụng phương pháp bradford cho trường hợp  Phương pháp dựa thay đổi bước sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue tạo phức hợp với protein.Hình thành hợp chất màu có khả hấp thu ánh sáng bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein dung dịch  Tiết kiệm thời gian dễ thực  Cường độ màu tỉ lệ nồng độ protein dung dịch nồng độ cao màu xanh đậm khơng phụ thuộc nồng độ acid amin dung dịch  Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát phát tới vài protein 5-200 µg/ ml Nhạy phường pháp Lowry gấp lần  Ít bị ảnh hưởng chất thường gặp tế bào gặp chẳng hạn muối Trường hợp mẫu thể rắn cần phải xử lý mẫu nào? Cân m = 5-10g mẫu rắn nghiền nhỏ, cho vào bình nón dung tích 250ml, bổ sung 50ml nước cất 10ml dung dich đệm phosphat pH = 4,9 Giữ hỗn hợp nhiệt độ 30oC thời gian có khuấy đảo định kỳ Lọc, rửa thu hồi dung dịch cho V = 100ml Bảo quản dung dịch gốc – 4oC thời gian ngày 22 BÀI 5: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME LÝ THUYẾT: I Enzyme đơn vị đo hoạt tính enzyme a Định nghĩa Enzyme chất xúc tác sinh học có chất protein có tính đặc hiệu cao Mỗi enzyme có khả xúc tác cho phản ứng định Hoạt động hay hoạt tính enzyme mạnh lượng chất chuyển hóa lượng sản phẩm tạo thành đơn vị thời gian lớn Vì đánh giá hoạt tính xúc tác enzyme cách xác định tốc độ chuyển hóa chất tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng  Về nguyên tắc hai nhóm phương pháp sau: Đo lượng chất bị hay lượng sản phẩm tạo thành thời gian định ứng với nồng độ enzyme xác định Đo thời gian cần thiết để thu lượng biến thiên định chất hay sản phẩm tương ứng với nồng độ enzyme xác định Để thực mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác sử dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt, phương pháp sắc ký phương pháp hóa học Mục đích xác định hoạt tính enzyme xác định số đơn vị hoạt tính Một đơn vị họat tính enzyme định nghĩa theo nhiều phương pháp b Đơn vị hoạt tính enzyme: Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) Do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: Một đơn vị chuẩn enzyme (1 U) lượng enzyme xúc tác chuyển hóa  𝜇mol chất sau phút điều kiện tiêu chuẩn 23  U = 𝜇mol sản phẩm = 𝜇mol chất (10-6 mol)/phút Katal: Năm 1979, Hội đồng Danh pháp IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị hoạt tính enzyme Một Katal lượng enzyme xúc tác chuyển hóa mol chất sau giây điều kiện tiêu chuẩn Kat = mol chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 𝜇mol/ phút = x 107 U U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanokatal) Đơn vị Katal khuyến cáo nằm hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI) Đơn vị tự đặt: đơn vị hoạt tính dựa vào thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng, ví dụ thay đổi độ đục, độ nhớt đơn vị thời gian Trường hợp chất sản phẩm hỗn hợp phức tạp áp dụng đơn vị hoạt tính II Hoạt tính riêng enzyme Hoạt tính riêng chế phẩm enzyme đăc trưng cho độ tinh chế phẩm enzyme Hoạt tính riêng biểu thị số đơn vị enzyme/mg protein ( U/mg protein) (Kat/kg protein), hàm lượng protein xác dịnh phương pháp Lowry Bradford III Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Chú ý: - Cần trách yếu tố biến tính protein enzyme - Các thơng số nhiệt độ , pH, nồng độ ion thành phần dung dịch đệm ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme Thử hoạt tính enzyme phải tiến hành điều kiện thích hợp điều kiện sinh lý, đk tồn trữ thực phẩm đk mà hoạt lực đạt tối ưu - Với enzyme cần có chất hoạt hóa chất ổn định phải cho chất vào enzyme trước cho chất vào hỗn hợp phản ứng - Nồng độ chất giới hạn thích hợp, đủ thừa để bão hòa enzyme, khơng q cao để kìm hãm enzyme, chất chuyển hóa 20%-30% 24 - Thởi gian xác định hoạt tính thường 5-30 phút - Khi xác định hoạt tính phải làm mẫu đối chứng( enzyme bị bất hoạt trước tiếp xúc với chất) song song với thí nghiệm Enzyme amylase phương pháp xác định hoạt tính IV a Khái enzyme amylase b Các phương pháp đo hoạt tính enzyme amylase - Nguyên tắc chung dựa sở thủy phân tinh bột enzyme dd enzyme nghiên cứu thành dextrin có phân tử lượng khác Đo cường độ màu tạo thành tinh bột sản phẩm thủy phân với iod máy so màu tính hoạt tính enzyme - Đơn vị amylase (theo Smith Roe) lượn enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 10 mg tinh bột sau thời gian phản ứng 30 phút điều kiện thí nghiệm THỰC HÀNH: Dụng cụ - hóa chất: a Dụng cụ - Máy lắc - Máy đo quang phổ, cuvette dày 1cm - Bể điều khiển - Bình định mức - Ống nghiệm - Pipette 5ml, 1ml - Đồng hồ bấm giây - Giấy thấm - Giá để ống nghiệm - Bình tia đựng cồn b Hóa chất: 25  Dung dịch đệm - Dung dịch đệm - Dung dịch đệm acetate pH= 4,7 (xác định hoạt tính enzyme nấm mốc): trộn thể tích CH 3COOH 1N với thể tích CH 3COONa 1N Kiểm tra pH - Dung dịch đệm phosphate pH= 4,9 (xác định hoạt tính enzyme malt): trộn 10 ml dung dịch Na 2HPO 1/15 M với 990 ml dung dịch KH 2PO 1/15 M nhận l dung dịch đệm phosphate pH = 4,94 Kiểm tra pH - Dung dịch đệm glycine – NaOH 0,1 M pH = 10 (dùng đ ể xác định hoạt tính 𝛼 −amylase kiềm - Dung dịch HCl 0,1N - Dung dịch iod: hòa tan 30 mg KI mg I2 v ới lượng nhỏ nước cất Lắc nhẹ hỗn hợp để hòa tan hồn tồn, sau chuyển dung dịch sang b ình định mức 1000 ml, bổ sung nước cất đến vạch mức Bảo quản dung dịch b ình màu nâu để chỗ tối - Dung dịch tinh bột 1%: h òa tan g tinh b ột (theo chất khô tuyệt đối) với 50 ml nước cất bình định mức 100 ml, lắc Đặt v bếp cách thủy sôi, lắc li ên tục tinh bột tan ho àn tồn Sau làm ngu ội bổ sung 10 ml đệm acetate pH = 4,7 (hoặc 10 ml dung dịch đệm phosphate pH = 4,9) bổ sung n ước cất đến vạch mức, lắc Dung dịch đ ược chuẩn bị ngày sử dụng - Dung dịch enzyme gốc  Trích ly enzyme: Enzyme trích ly từ chế phẩm hay tế bào, mơ động thực vật dd đệm có pH thích hợp - Trích ly enzyme từ vi khuẩn: Cân m= 0,1g chế phẩm  dùng đũa thủy tinh chà nhẹ chế phẩm cốc dt 50ml  cho vào bình định mức 100ml + H2O cất  lọc trích ly enzyme bảo quản 2-4°𝐶 / ngày - Trích ly enzyme nấm mốc: Cân m=5g chế phẩm  dùng đũa thủy tinh chà nhẹ chế phẩm cốc dt 50ml  cho vào bình định mức 100ml + H2O cất +dd đệm 26 Acetate pH=4,7  giữ nhiệt độ 30°𝐶  lọc, rửa, trích ly lấy enzyme V= 100ml  bảo quản 2-4°𝐶 / ngày - Trích ly enzyme từ malt: Cân m=5-10g chế phẩm  xay nhỏ  cho vào bình định mức 100ml + H2O cất +dd đệm phosphase pH=4,9  lọc, rửa, trích ly lấy enzyme V= 100ml  bảo quản 2-4°𝐶 / ngày  Pha loãng enzyme: Hệ số pha loãng : n= 50,100,200 Xác định hoạt tính thí nghiệm: Hóa chất Thí nghiệm Đối chứng Mẫu trắng Dd Tinh bột 1% ml ml Nước cất 0 2ml Đệm 1ml 1ml 1ml Dd NaCl 3% 0,5ml 0,5ml 0,5ml ủ 40 °𝐶 , 10 phút để đạt điều kiện enzyme hoạt động tốt Dd enzyme 1ml 0 ủ 40 °𝐶 , 30 phút để xảy phản ứng HCl 1N 1ml 1ml 1ml Dd enzyme 1ml 1ml Chuyển sang bình định mức 100ml Nước cất Đến vạch Đến vạch Đến vạch Iod 0,5ml 0,5ml 0,5ml 27 Tính kết quả: 0𝐷0 : 𝑙à 𝑚ậ𝑡 độ đ𝑜 𝑞𝑢𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔 0𝐷: 𝑙à 𝑚ậ𝑡 độ đ𝑜 𝑞𝑢𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎí 𝑛𝑔ℎ𝑖ệ𝑚 𝑆ố 𝑚𝑔 𝑡𝑖𝑛ℎ 𝑏ộ𝑡 𝑏ị 𝑡ℎủ𝑦 𝑝ℎâ𝑛 𝑆 = 𝐻𝑜ạ𝑡 𝑡í𝑛ℎ ( 0𝐷0 −0𝐷 × 20 0𝐷0 = 1,072−0,106 × 20 1,072 = 18,022 đơ𝑛 𝑣ị ℎ𝑜ạ𝑡 𝑡í𝑛ℎ 𝑆 × 𝑛 × 𝑉 18,022 × 50 × 100 = = 901,1 )= 𝑔 10 × 𝑚 10 × 10 Họat tính riêng (đơn vị họat tính/mg protein) = họat tính tồn phần/mg protein (Bradford) Trong : n = hệ số pha lỗng V= thể tích dịch trích ly, ml m= khối lượng enzyme đem trích ly, g 28 CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Phân biệt dạng enzyme amylase nguồn thu chúng Có dạng chính:  --amylase (Endo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.1) có nước bọt, hạt hòa thảo nảy mầm, tụy tạng, nấm mốc, vi khuẩn  --amylase (Exo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.2) có nhiều thực vật (hạt củ)  -Glucoamylase Câu 2: Bản chất hoạt tính enzyme gì? Nêu phương pháp đo hoạt tính enzyme  Bản chất: hoạt tính enzyme mạnh lượng chất chuyển hóa lượng sản phẩm tạo thành đơn vị thời gian lớn  Hai nhóm phương pháp sau: - Đo lượng chất bị hay lượng sản phẩm tạo thành thời gian định ứng với nồng độ enzyme xác định - Đo thời gian cần thiết để thu lượng biến thiên định chất hay sản phẩm tương ứng với nồng độ enzyme xác định Câu 3: Cơ chất sản phẩm enzyme -amylase gì? Dựa pp người ta chọn pp xác định hoạt tính thí nghiệm?  Cơ chất enzyme -amylase tinh bột Enzyme phân giải liên kết 1,4glycoside chuỗi polysaccharide (hoạt tính endoamylase) tạo thành maltose, dextrin phân tử thấp  Nguyên tắc chung dựa sở thủy phân tinh bột enzyme dung dịch enzyme nghiên cứu thành dextrin có phân tử lượng khác Đo cường độ màu tạo thành tinh bột sản phẩm thủy phân với iode máy so màu tính hoạt tính enzyme Câu 4: Có thể sử dụng pp đo đường khử DNS acid để đo hoạt tính enzyme amylase khơng? Tại sao? 29 Vì DNS tạo màu với đường khử đo hoạt tính enzyme -amylase tinh bột tạo màu với lugol Câu 5: Cho biết định nghĩa đơn vị hoạt tính theo Smith Roe Đơn vị có giống đơn vị quốc tế khơng? Ta chuyển đơn vị Smith Roe thành đơn vị quốc tế không giữ nguyên pp xác định  Đơn vị amylase (theo Smith Roe) lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 10 mg tinh bột sau thời gian phản ứng 30 phút điều kiện thí nghiệm  Đơn vị không giống đơn vị quốc tế BÀI :TÁCH CÁC SẮC TỐ QUANG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GIẤY HOẶC BẢN MỎNG I LÝ THUYẾT NGUYÊN TẮC Hổn hợp phân tử sắc tố phân tách thành đơn chất phương pháp sắc ký , sắc ký giấy sắc ký mỏng đơn giản Các phương pháp dựa vào khả tương tác khác phân tử sắc tố với phân tử pha tĩnh khả lôi kéo dung môi DỤNG CỤ -HÓA CHẤT - Dụng cụ - Phễu lọc - Giấy lọc - Bản mỏng nhôm phủ silica gel G254 - Bình tam giác 250ml - Ống nghiệm có nắp hay bình chứa dung mơi sắc ký 30 - Mao quản chấm mẫu hay micropipette đầu típ 100 - ngun liệu hóa chất - Lá rau cải bó xơi hay loại rau xanh khác - Ethanol 96 % - Acetone - Ether dầu hỏa - Cồn 95% II TIẾN HÀNH - Nghiền 10g 10ml ethanol 95% đun sôi phút - Lọc - Cắt giấy lọc thành dải có đầu nhọn kẻ vạch tiếp mẩu vạch dừng - Thấm mẫu lên vạch micropipette - Nhúng giấy lọc dung môi - Để dung môi chạy lên vạch dừng - Đánh dấu vệt sắc tố bút chì - Đo khoảng cách từ vạch sắc tố đến vạch thấm mẫu 31 TÍNH KẾT QUẢ Rf=7,5/8 TRẢ LỜI CÂU HỎI Câu1 :Độ phân cực dạng sắc tố quang hợp hình 6.1 làcholorophyll A cholorophyll b có độ phân cực lớn b-carotene , b-carotene có độ phân cực thấp , zeaxanthin có độ phân cực lớn b-carotenen nhõ cholorophyll A cholorophyll B Câu2 :Phải dùng ethan 95% để trích ly sắc tố mà khơng dùng nước sắc tố tan dung môi hữu , không tan trongnước Câu3 :Giá trị Rf sắc tố 7,5/8 Tên sắc tố có giá trị Rf = 7,5/8 zeaxanthin ... việc với hóa chất thí nghiệm  Hóa chất thí nghiệm: - Các hóa chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, phòng thí nghiệm gọi hóa chất thí nghiệm  Nhãn hiệu hóa chất : - Hóa chất... tắc: a) Vơ hóa mẫu - Trước tiên mẫu vơ hóa H2SO4 đặc nhiệt độ cao có chất xúc tác Các phản ứng q trình vơ hóa xảy sau: 2H2SO4  2H20 + 2SO2 + O2 13 - Oxi tạo thành phản ứng lại oxi hóa nguyên... nghĩa bước thí nghiệm a) Vơ hóa mẫu - Oxi tạo thành phản ứng lại oxi hóa nguyên tố khác Các phân tử chứa nito tác dụng H2SO4 tạo thành NH3.NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan dung dịch