Nghiên cứu sự lưu hành virus gây bệnh tai xanh (PRRS) ở lợn bằng bộ kít POCKIT, xác định một số vi khuẩn có khả năng gây viêm phổi kế phát, đề xuất biện pháp phòng chống tại tỉnh tuyên quang

116 10 0
  • Loading ...
1/116 trang
Tải xuống

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 04/05/2019, 22:54

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VŨ MINH THẢO NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VIRUS GÂY BỆNH TAI XANH (PRRS) LỢN BẰNG BỘ KÍT POCKIT, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VI KHUẨN KHẢ NĂNG GÂY VIÊM PHỔI KẾ PHÁT, ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG TẠI TỈNH TUYÊN QUANG LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VŨ MINH THẢO NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VIRUS GÂY BỆNH TAI XANH (PRRS) LỢN BẰNG BỘ KÍT POCKIT, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VI KHUẨNKHẢ NĂNG GÂY VIÊM PHỔI KẾ PHÁT, ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG TẠI TỈNH TUYÊN QUANG Ngành: Thú y Mã số: 8.64.01.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan THÁI NGUYÊN - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: - Đề tài luận văn thực kinh phí thuộc chương trình giám sát dịch bệnh Chi cục Chăn nuôi Thú y tỉnh Tuyên Quang đề tài cấp tỉnh: “Nghiên cứu lưu hành virus gây bệnh Tai xanh lợn, ứng dụng kỹ thuật GPS GIS xây dựng đồ dịch tễ, đề xuất biện pháp phòng chống bệnh Tai xanh cho lợn tỉnh Tuyên Quang” TS Nguyễn Văn Quang làm chủ nhiệm - Các kết nghiên cứu luận văn trung thực, khách quan chưa sử dụng để bảo vệ học vị - Mọi giúp đỡ trình nghiên cứu, triển khai thí nghiệm viết luận văn cảm ơn Tất thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày tháng TÁC GIẢ Vũ Minh Thảo năm 2018 ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian nghiên cứu, để hồn thành luận văn mình, tơi nhận bảo tận tình thầy giáo hướng dẫn, giúp đỡ Trường Đại học Nông Lâm, khoa Chăn nuôi Thú y, Chi cục Chăn nuôi Thú y tỉnh Tuyên Quang quan hữu quan thuộc Cục Thú y Tôi nhận cộng tác nhiệt tình bạn bè, giúp đỡ, động viên người thân gia đình Nhân dịp tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan Thầy giáo TS Nguyễn Văn Quang tận tình trực tiếp hướng dẫn tơi thực thành cơng đề tài hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm, khoa Chăn nuôi Thú y thầy tạo điều kiện thuận lợi cho phép thực đề tài tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn Bộ môn Vi trùng, Virus - Viện Thú y Quốc gia, Trung Tâm Chẩn Đoán Thú y Trung Ương Chi cục Chăn nuôi Thú y tỉnh Tuyên Quang, anh chị sở thực tập hợp tác, giúp đỡ tơi bố trí thí nghiệm, phân tích tiêu thu thập số liệu để hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè đồng nghiệp giúp đỡ, động viên tơi suốt thời gian học tập hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ! Thái nguyên, ngày tháng năm 2018 Học viên Vũ Minh Thảo MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa đề tài Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh Tai xanh - Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) lợn 1.1.1 Một số đặc điểm virus PRRS 1.1.2 Dịch tễ học hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 1.1.3 Triệu chứng 1.1.4 Bệnh tích 11 1.1.5 Chẩn đoán 12 1.2 Vai trò số vi khuẩn hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn.15 1.2.1 Vi khuẩn A pleuropneumoniae bệnh viêm phổi - màng phổi lợn 15 1.2.2 Vi khuẩn P multocida bệnh viêm phổi lợn P multocida gây 17 1.3 Những nghiên cứu PRRS bệnh viêm phổi lợn 23 1.3.1 Những nghiên cứu giới 23 1.3.2 Những nghiên cứu trongnước 25 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.2 Thời gian nghiên cứu: 28 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 28 2.2 Vật liệu nghiên cứu 29 2.2.1 Các loại mẫu thu thập 29 2.2.2 Động vật thí nghiệm 29 2.2.3 Vắc xin phòng bệnh Tai xanh- AMERVAC®PRRS 29 2.2.4 Bộ kit POCKIT chẩn đoán nhanh bệnh Tai xanh 30 2.2.5 Các loại hố chất, mơi trường ngun vật liệu khác 30 2.2.6 Máy móc thiết bị 31 2.3 Nội dung nghiên cứu 31 2.3.1 Nghiên cứu lưu hành virus gây bệnh Tai xanh lợn huyện, thành phố tỉnh Tuyên Quang 31 2.3.2 Phân lập nghiên cứu số đặc điểm loại vi khuẩn A.pleuropneumoniae, P multocida S suis 31 2.3.3 Nghiên cứu đề xuất biện pháp phòng chống hiệu bệnh Tai xanh lợn địa bàn tỉnh Tuyên Quang 32 2.4 Phương pháp nghiên cứu 32 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 32 2.4.2 Phương pháp xác định lưu hành virus prrs 33 2.4.3 Phương pháp nuôi cấy phân lập, xác định đặc tính sinh hóa vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis 33 2.4.4 Phương pháp xác định mức độ bảo hộ vắc xin amervacprrs 33 2.4.5 Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với số kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập 33 2.4.6 Xây dựng phác đồ điều trị bệnh viêm phổi cho lợn 34 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 34 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Nghiên cứu lưu hành virus gây bệnh Tai xanh huyện, thành tỉnh Tuyên Quang 35 3.1.1 Sự lưu hành virus gây bệnh Tai xanh huyện, thành tỉnh Tuyên Quang 35 3.1.2 Tỷ lệ lưu hành virus gây bệnh Tai xanh theo lứa tuổi lợn 37 3.1.3 Tỷ lệ lưu hành virus gây bệnh Tai xanh theo mùa năm 39 3.1.4 Tỷ lệ lưu hành virus gây bệnh Tai xanh theo phương thức chăn nuôi 41 3.1.6 So sánh kết xác định lưu hành virus prrs phương pháp sử dụng kít POCKIT phương pháp ipma 42 3.2 Nghiên cứu số loại vi khuẩn thường gây viêm phổi kế phát bệnh Tai xanh lợn 43 3.2.1 Phân lập loại vi khuẩn thường gây viêm phổi kế phát bệnh Tai xanh (vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis) lợn Tuyên Quang43 3.2.2.Kết giám định số đặc tính sinh vật, hóa học chủng vi khuẩn phân lập 46 3.2.3 Kết xác định khả mẫn cảm với số kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập 52 3.3 Nghiên cứu biện pháp phòng, chống bệnh Tai xanh cho lợn 59 3.3.1 Nghiên cứu phác đồ điều trị viêm phổi viêm phổi kế phát lợn bệnh Tai xanh xảy 59 3.3.2 Xác định khả bảo hộ vắc xin AMERVAC®PRRS phòng bệnh Tai xanh lợn Tun Quang 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 Kết luận 71 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN: Acid Deoxyribonucleic A pleuropneumoniae: Actinobaccillus pleuroneumoniae CAMP: Chiristie - Atkinson - Munch - Peterson CFU: Colony Forming Unit CPS: Capsule polysaccharide Cs: Cộng DNT: Dermanecrotic toxin ELISA: Enzyme - linked Immuno sorbant assay IPMA: Immuno – Peroxidase Monolayer Assay NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide OMPs: Outer membrane proteins PCR: Polymerase Chain Reaction P multocida: Pasteurella multocida PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Sta aureus: Staphylococcus aureus S suis: Streptococcus suis TSA: Tryptic Soya Agar TSB: Tryptone soya broth VK: Vi khuẩn VP: Voges Prokauer YE: Yeast Extract vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Đánh giá mức độ mẫn cảm vi khuẩn với số loại kháng sinh (NCCLS - 2002) 34 Bảng 3.1 Tỷ lệ lưu hành virus gây bệnh Tai xanh lợn huyện, thành tỉnh Tuyên Quang 35 Bảng 3.2.Tỷ lệ lưu hành virus gây bệnh Tai xanh theo lứa tuổi 37 Bảng 3.3.Tỷ lệ lưu hành virus gây bệnh Tai xanh theo mùa năm 39 Bảng 3.4 Sự lưu hành virus gây bệnh Tai xanh lợn theo phương thức chăn nuôi 41 Bảng 3.5 So sánh kết xác định lưu hành virus gây bệnh Tai xanh phương pháp sử dụng kít POCKIT IPMA 42 Bảng 3.6 Kết phân lập vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis lợn tỉnh Tuyên Quang 44 Bảng 3.7 Kết giám định số đặc tính sinh vật, hóa học chủng vi khuẩn A pleuroneumoniae phân lập 46 Bảng 3.8 Kết giám định số đặc tính sinh vật, hóa học chủng vi khuẩn P multocida phân lập 49 Bảng 3.9 Kết giám định số đặc tính sinh vật, hóa học chủng vi khuẩn S suis phân lập 51 Bảng 3.10 Mức độ mẫn cảm kháng sinh chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập 53 Bảng 3.11: Mức độ mẫn cảm với số kháng sinh vi khuẩn P multocida phân lập 55 Bảng 3.12 Mức độ mẫn cảm với số kháng sinh vi khuẩn S suis phân lập 56 Bảng 3.13 Tổng hợp khả mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis phân lập 58 Bảng 3.14 Thử nghiệm hiệu lực ba phác đồ điều trị viêm phổi cho lợn61 Bảng 3.15 Ứng dụng hai phác đồ điều trị viêm phổi cho lợn thành phố Tuyên Quang 64 Bảng 3.16 Chỉ tiêu sinh lý lợn trước sau tiêm vắc xin 66 Bảng 3.17 Biểu lợn trước sau tiêm vắc xin 66 Bảng 3.18 Hiệu giá kháng thể lợn sau tiêm vắc xin tháng 67 Bảng 3.19 Hiệu giá kháng thể lợn sau tiêm vắc xin tháng 68 Bảng 3.20 Hiệu giá kháng thể lợn sau tiêm vắc xin tháng 69 Bảng 3.21 Hiệu giá kháng thể lợn sau tiêm vắc xin tháng 70 Ảnh 6, 7: Kiểm tra xác định lưu hành virus gây bệnh Tai xanh từ mẫu huyết Ảnh 8: Kết sử dụng kit POCKIT (Ảnh 7: Mẫu số 2,3,4,5,7 âm tính; mẫu 1,6,8 dương tính Ảnh 8: mẫu 1,2,3,4,5,6,7,8 dương tính) Phân lập vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis điều trị bệnh viêm phổi cho lợn Ảnh 9: Phổi cuống họng lợn Ảnh 10: Phổi cuống họng lợn bị viêm phổi bình thường Ảnh 11, 12: Ni cấy phân lập vi khuẩn Ảnh 13: Khuẩn lạc vi khuẩn Ảnh 14: Khuẩn lạc vi khuẩn A pleuropneumoniaeP Multocida Ảnh 15: Khuẩn lạc vi khuẩn S suis Ảnh 16: Vi khuẩn A Pleuropneumoniae Ảnh 17: Vi khuẩn S suis Ảnh 18: Vi khuẩn P multocida Ảnh 19: Phản ứng lên men đường loài vi khuẩn Ảnh 20, 21: Kiểm tra khả mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn Ảnh 22: Thuốc kháng sinh Cefanew-LA Ảnh 24: Thuốc kháng sinh Amicin Ảnh 23: Thuốc Ampicillin – 1000 Ảnh 25: Thuốc Gluco – K – C- Namin Ảnh 26, 27: Điều trị cho lợn bị viêm phổi TP Tuyên Quang Ảnh 28, 29: Vắc xin Amervac PRRS dung dịch pha để phòng bệnh viêm phổi cho lợn Tuyên Quang Ảnh 30, 31: Lấy máu lợn vịnh tĩnh mạch cổ sau tiêm vắc xin Ảnh 32: Huyết lợn sau 1, 2, tháng tiêm vắc xin (dùng để xác định hiệu giá kháng thể) Ảnh 33: Thảm tế bào MARC – 145 Ảnh 35: Ly tâm huyết Ảnh 37: Huyết cho chất Ảnh 34: Dung dịch Trypsin Ảnh 36:Gây nhiễm tế bào PRRSV Ảnh 38: Mẫu huyết dương tính với PRRSV Ảnh 39: Mẫu huyết âm tính với PRRSV Ảnh 40: Ngưng kết hiệu giá 1/80 Ảnh 41: Ngưng kết hiệu giá 1/160 Ảnh 42: Ngưng kết hiệu giá 1/640 Ảnh 43: Ngưng kết hiệu giá 1/2560 Ảnh 44 : Đối chứng (không ngưng kết) (-) PHỤ LỤC II: HỆ THỐNG POCKIT VÀ CÁCH SỬ DỤNG - Hệ thống POCKIT Với ưu phòng PCR di động, hệ thốngPockit vận hành phát Acid nucleic lúc, nơi Phương pháp IQ PLUS: PCR phương pháp xác ứng dụng để phát bệnh IQ Plus dựa kỹ thuật iiPCR (insulated isothermalPCR) - hệ thống PCR trường cho phép phát bệnh dễ dàng, nhanh chóng kinh tế quản lý bệnh thủy sản.Chỉ vòng cho kết xác PCR kit dễ dàng vận chuyển nhiệt độ phòng - Thiết kế internal control - Độ nhạy ~ 10copy/phản ứng Máy đọc kết Máy ly tâm - Thiết kế kênh huỳnh quang song song với hai bước sóng: 520nm, 550nm - Thời gian phản ứng: ~ 58 phút - Màn hình cảm ứng hiển thị liệu - Tự động phân tích kết phản ứng hoàn thành - Số mẫu tối đa lần chạy: mẫu - Trọng lượng: 4,5kg - Rotor thiết kế cho ống 0.2 2ml, bao gồm ống R-tube - Motor vân hành tốc độ cao, đặc biệt thích hợp cho li trích Nucleic acid cột lắng Hệ thống POCKIT - Ưu điểm phương pháp sử dụng kít POCKIT iiPCR (Insulated isothermal PCR) - Kỹ thuật PCR đẳng nhiệt điểm phương pháp cấp nhiệt cố định đáy ống mao dẫn, từ tạo đối lưu nhiệt làm phản ứng PCR thực với gradien nhiệt diễn ống mao dẫn Pockit vận hành linh hoạt phát acid nucleic Người sử dụng lựa chọn kít đặc hiệu hay phát triển, thiết kế hệ thống - Mục đích sử dụng TM Bộ kit POCKIT PRRSV-CN sử dụng công nghệ PCR đẳng nhiệt (iiPCR) để phát RNA virus gây bệnh Tai xanh chủng Trung Quốc Bộ kit thiết kế để sử dụng với thiết bị POCKIT Nucleic Acid Analyzer Người dùng thường bác sĩ thú y kỹ thuật viên, người mà kỹ phòng thí nghiệm Bộ kit sử dụng cho mục đích phát bệnh cho mục đích nghiên cứu - Nguyên lý phát bệnh Việc phát virút gây bệnh Tai xanh (PRRSV-CN) dựa vào công nghệ iiPCR Cùng với cặp mồi đặc hiệu, đầu dò huỳnh quang sử dụng để tạo tín hiệu huỳnh quang chuỗi RNA đích PRRSV-CN khuếch đại Mồi đầu dò huỳnh quang gắn vào RNA đích virút không kết hợp với DNA lợn axit nucleic loài khác TM - Hướng dẫn sử dụng kit POCKIT PRRSV-CN + Trình tự: CHÚ Ý: Hòa tan chuẩn p(+) Standard 100ul lStandard buffer trước sử dụng lần Chuẩn P(+) nên bảo quản 4c.Đọc hướng dẫn sử dụng máy POCKIT trước thao tác Mở góiPremix,lấy lọ Premix theo số lượng mẫu cần xét nghiệm Chú ý: Nếu chất khô lọ Premix khơng nằm đáy lọ cần phải ly tâm Mở nắp ống premix, thêm 50ul Premix Buffer B vào lọ Thêm5ul axit nucleic mẫu chuẩn P(+)vào ốngPremix.Lắc ly tâm máy ly tâm cubeetm 10s TM Chuyển50ultrong ống premix vào ống r-tube TM Đóng nắp ống R-tube , đặt vào đỡ, ly tâm 10s Chú ý:Đảm bảo sau ly tâm khơng bọt dung dịch ống R-tubeTM Axit nucleic sau tách chiết nên mang chạy phản ứng PCR vòng 1h để tránh biến tính Bật máyPOCKIT.Máy tự hồn thành việc kiểm tra máy phút L ự a c h n b c s ó n g n m để sử dụng Đặt đỡ mẫu chứa ống R-tube vào máy,ấn nhẹ vào nắp ống r-tube để đảm bảo ống đặt chắn đỡ Đậy nắp máy sau ấn nút”Run”để bắt đầu chạy phản ứng Sau phản ứng kết thúc kết tự động hiển thị hình Đọc kết Kết tự động hiển thị sau phản ứng hồn thành dụ hình hiển thị kết 520 nm Giải thích RSV-CN Posstive -Kết dương tính PRRSV-CN Negative- Kết âm tính Làm lại xét nghiệm với mẫu khác - Độ nhạy phản ứng: Giới hạn phát kít TM POCKIT PRRSVCN lên đến 10 copies/reaction (Pha loãng 10 lần/phản ứng) - Sự cố, nguyên nhân cách khắc phục Sự cố Ngun nhân Micropipette nhiễm bẩn Khơng mẫu kiểm Hóa chất bị nhiễm tạp Khu vực thí nghiệm bị nhiễm bẩn Cách khắc phục Tháo rờipipette sau rửa Dùng hóa chất khác Tham khảo ý kiến từ nhà sản xuất soát hiển nhà phân phối sản phẩm Những vật thị kết tư sử dụng như: ống ly tâm, R- dương tính tube, đầu tip nên thu gom Không đặt vật tư sử dụng gần với Quá trình tách chiết axit nucleic khu vực thao tác để tránh nhiễm tạp Kiểm tra lại quy trình tách chiết thất bại axit nucleic Axit nucleic chất lượng thấp Kiểm tra lại điều kiện lưu trữ mẫu Mẫu bị bệnh hiển thị kết âm tính nồng độ q cao Kiểm tra tỷ số OD260/280 Thông thường tỉ số 1.4-2.0 Ch ấ t ứ c ch ế ph ả n ứ ng PCR Thực thao tác theo quy trình nhà sản xuất hướng dẫn mẫu chuẩn dương kết dương tính khả chất ức chế loại bỏ Nếu mẫu chuẩn dương hiển thị kết âm chất ức chế phản ứng Cần chuẩn bị axit nucleic PHỤ LỤC III PHƯƠNG PHÁP IPMA (Immuno – Peroxidase Monolayer Assay) Bước 1: Nuôi cấy tế bào MARC - 145 - Hồi phục tế bào: Tế bào trữ dạng đông lạnh nitơ lỏng, muốn sử dụng phải hồi phục lại tế bào Các bước hồi phục tế bào: + Lấy lọ đựng tế bào từ bình nitơ lỏng ra, ngâm vào nước ấm 37oC, chờ đến nước đá tan hết lấy + Dùng pipette chuyển lượng tế bào bên lọ sang ống ly tâm Cho thêm 10 ml môi trường phát triển vào, chầm chậm giọt Dùng pipette trộn nhẹ để hỗn hợp hòa với + Ly tâm 1500 vòng/phút phút Sau bỏ phần nước trên, búng vào đáy lọ ly tâm để tế bào tách rời + Cho ml môi trường phát triển vào, dùng pipette trộn hút khoảng 0,1 ml để đếm + Cho tế bào vào lọ ni cấy sẵn - 10 ml môi trường phát triển Đưa lọ tế bào vào tủ ấm 37oC bổ sung 5% CO2 + Sau 24 thay đổi mơi trường - Cấy chuyển tế bào: Khi tế bào mọc đầy bề mặt ni cấy, tạo thành tế bào lớp tiến hành cấy chuyển - Tách tế bào khỏi lọ: + Rút bỏ môi trường lọ nuôi cấy, rửa lớp tế bào - 10 ml PBSA, rút bỏ + Cho vào ml trypsin, để tủ ấm phút sau cho tay cầm lọ tế bào đập nhẹ vào lòng tay để đảm bảo tách thành tế bào riêng lẻ + Bất hoạt trypsin ml môi trường phát triển, rút cho vào ống ly tâm (loại 15 ml) + Dùng thêm ml môi trường phát triển để rửa lại lọ nuôi cấy hút cho vào ống ly tâm + Ly tâm 1500 vòng/phút phút Sau đổ phần nước trên, búng vào đáy lọ ly tâm cho tế bào rời Cho vào ống ly tâm ml môi trường phát triển, trộn pipette lấy 0,1 ml để đếm tế bào Đếm tế bào buồng đếm Neubauer: + Cách tiến hành: Trộn 100 μl huyễn dịch tế bào 900 μl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha 1/10) Đưa hỗn hợp thuốc nhuộm tế bào lên buồng đếm cách chạm đầu hút chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp buồng đếm lamella Chỉ đếm tế bào sống (màu vàng nhạt, điểm sáng giữa), không đếm tế bào chết (bắt màu xanh) Vùng đếm ô vuông lớn (ký hiệu L) Cách tính kết quả: Số tế bào 1ml: C= N x d x 104 Trong đó: C: số tế bào ml n: số tế bào ô vuông d: nồng độ pha loãng Cho lượng tế bào cần cấy chuyển vào lọ nuôi cấy - 10 ml mơi trường phát triển Đưa lọ tế bào vào ủ ấm 37oC bổ sung 5% CO2 Theo dõi lần soi buồng đếm Bước 2: Xử lý mẫu để phân lập virus Bệnh phẩm huyết thanh: lắc máy trộn, ly tâm nhanh máy ly tâm vận tốc 8000 vòng/phút phút Sau xử lý nhiệt độ 56oC 30 phút để diệt bổ thể đem tiến hành phương pháp để phát kháng thể Bước 3: Gây nhiễm tế bào virus PRRS - Lấy giống virus chuẩn từ nơi bảo quản, làm tan đá nhanh pha lỗng với mơi trường MEN chứa 5% FCS để liều 500 TCID50 virus/ml (giống virus hiệu chỉnh nồng độ từ trước) - Cho 100 µl dung dịch virus pha loãng vào giếng - Ủ đĩa ngày, 37oC buồng CO2 nồng độ 5% Bước 4: Cố định tế bào - Đổ bỏ môi trường nuôi cấy rửa phiến lần nước muối (saline) - Cho 100 µl dung dịch A (dung dịch cố định tế bào gồm PBS 10% formalin 1% NP40) vào giếng - Ủ nhiệt độ phòng khoảng 30 phút - Đổ bỏ dung dịch A, rửa đĩa lần dung dịch B (dung dịch nước rửa gồm PRS với 1% Tween 80) Bước 5: Pha lỗng huyết - Chia 180 µl NaCl 0,5 M với 4% huyết ngựa 0,5% Tween 80, pH 7,2 (dung dịch đệm), vào giếng hàng A E phiến đệm (dummy plates) - Chia 120 µl dung dịch đệm vào tất giếng khác - Pha 20 µl huyết xét nghiệm hay huyết đối chứng vào giếng hàng A E (độ pha loãng 1/10) lắc - Pha loãng huyết bốn lần chuyển 40 µl từ hàng A E sang hàng B F, tiếp tục vậy, độ pha loãng 1/80, 1/160 Cho huyết vào phiến đại thực bào cố định - Chuyển 50 µl từ giếng đĩa đệm vào giếng tương ứng phiến đại thực bào cố định Đậy đĩa lại ủ 37oC - Đổ bỏ dung dịch huyết rửa đĩa ba lần dung dịch B (dung dịch nước rửa, gồm PBS với 1% Tween 80) Bước 6: Cho kháng kháng thể PRRS gắn enzyme (kháng kháng thể tạo thỏ) - Pha loãng kháng thể với dung dịch pha loãng (dung dịch nước rửa B), theo tỷ lệ 1/80, 1/160 - Thêm 50 µl dịch pha loãng vào giếng đĩa Đậy đĩa ủ 37oC - Rửa phiến ba lần dung dịch B Bước 7: Cho chất - Chia 50 µl dung dịch chất nhiễm sắc/chất (AEC) lọc - dung dịch E (dung dịch ACE, gồm ml dung dịch ACE nguyên chất + 14 ml dung dịch đệm axetat 0,1M (pH = 5,2) + 15µl H2O2 30%) vào giếng đĩa - Ủ đĩa 30 phút nhiệt độ phòng Bước 8: Đọc kết Sử dụng kính hiển vi soi ngược để quan sát - Nếu quan sát thấy thảm tế bào giếng đám tế bào bắt màu đỏ đậm mẫu huyết cho vào giếng dương tính với PRRSV - Nếu quan sát thấy thảm tế bào giếng đám tế bào bắt màu hồng nhạt mẫu huyết cho vào giếng âm tính với PRRSV ... THẢO NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VIRUS GÂY BỆNH TAI XANH (PRRS) Ở LỢN BẰNG BỘ KÍT POCKIT, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG GÂY VI M PHỔI KẾ PHÁT, ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG TẠI TỈNH TUYÊN QUANG. .. Nghiên cứu lưu hành virus gây bệnh Tai xanh (PRRS) lợn Kít POCKIT, xác định số vi khuẩn có khả gây vi m phổi kế phát, đề xuất biện pháp phòng chống tỉnh Tuyên Quang Mục tiêu nghiên cứu Ứng dụng Kít. .. QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Nghiên cứu lưu hành virus gây bệnh Tai xanh huyện, thành tỉnh Tuyên Quang 35 3.1.1 Sự lưu hành virus gây bệnh Tai xanh huyện, thành tỉnh Tuyên Quang
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu sự lưu hành virus gây bệnh tai xanh (PRRS) ở lợn bằng bộ kít POCKIT, xác định một số vi khuẩn có khả năng gây viêm phổi kế phát, đề xuất biện pháp phòng chống tại tỉnh tuyên quang , Nghiên cứu sự lưu hành virus gây bệnh tai xanh (PRRS) ở lợn bằng bộ kít POCKIT, xác định một số vi khuẩn có khả năng gây viêm phổi kế phát, đề xuất biện pháp phòng chống tại tỉnh tuyên quang

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn