TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HCM KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM  BÁO CÁO THỰC HÀNH THÍ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM GVHD: Ts Trịnh Khánh Sơn NHÓM SVTH: MSSV Trần Thị Như Hảo 16116126 Hà Thị Trinh 16116187 Trương Thị Thu 16116176 Trần Thị Sao Mai 16116148 Nguyễn Thị Yến 16116200 Hoàng Ngọc Thương 16116179 Lớp thứ 3,5,7 – tiết 15 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 MỤC LỤC Bài 1: TIÊU BẢN GIỌT TREO VÀ TIÊU BẢN GIỌT ÉP Bài 2: TẠO VẾT BÔI VÀ NHUỘM ĐƠN BÀI 3: NHUỘM GRAM Bài 4: NHUỘM BÀO TỬ .13 Bài 5: KĨ THUẬT PHÒNG ẨM (QUAN SÁT NẤM SỢI) 16 Bài 6: KỸ THUẬT CẤY RIA .19 Bài 7: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN 23 Bài 8: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN, NẤM MỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 27 Bài 9: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 31 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Tiêu giọt ép nước dưa cải chua độ phóng đại ×1000 Hình 2: Vi khuẩn hình que nước dưa cải muối chua nhuộm crystal violet quan sát độ phóng đại ×1000 Hình 3: Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram dương (trái) Gram âm (phải) 10 Hình 4: Kết nhuộm bào tử 13 Hình 5: Nấm sợi 16 Hình 6: Hệ sợi nấm 17 Hình 7: Kết sau cấy men bánh mỳ ( bên trái), Yakult (bên phải) lên môi trường 19 Hình 8: Thạch đứng sau nuôi cấy mẫu Yakult 19 Hình a-b: Thạch đứng sau nuôi cấy nấm men .20 Hình 10: Thạch nghiêng sau nuôi cấy nấm men .21 Hình 11: Ống nghiệm dương tính 23 Hình 12: So sánh ống nghiệm dương tính ống nghiệm khơng dương tính 24 Hình 13: Ống nghiệm dương tính 25 Hình 14: Khuẩn lạc mọc đĩa thạch với độ pha loãng mẫu 27 Hình 15: Khuẩn lạc mọc đĩa thạch có độ pha lỗng mẫu 28 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Kết so sánh vi khuẩn lactic nhuộm Gram nhuộm đơn crystal violet safranin O Bảng 2: Tỉ lệ thành phần có cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram dương Gram âm (Nguyễn Lân Dũng cộng sự, 2003) .11 Bảng 3:Số ống dương tính 24 Bảng 4: Số ống dương tính nồng độ 25 Bảng 5: Số ống dương tính nồng độ 25 Bảng 6: Số khuẩn lạc đếm độ pha loãng .29 Bảng 7: Bảng kết 32 Bài 1: TIÊU BẢN GIỌT TREO VÀ TIÊU BẢN GIỌT ÉP Mục đích Quan sát hình dạng, kích thước cách x ếp c tế bào vi sinh v ật s ống môi trường lỏng Quan sát khả di động vi sinh vật môi tr ường l ỏng, t phân biệt chuyển động tự thân chuyển động Brown Kết thí nghiệm Kết làm tiêu thu hình ảnh hệ vi sinh vật n ước d ưa c ải muối chua việc sử dụng kính hiển vi quang học sáng Trong đó, có nhi ều nh ất vi khuẩn hình que có độ dài ngắn khác nhau, suốt (đ ộ t ương ph ản v ới sáng thấp) Các vi khuẩn đứng riêng lẻ xếp thành chuỗi Các vi khuẩn khơng di động, có dịch chuy ển hỗn loạn so với v ị trí ban đ ầu chuyển động phân tử nước kéo theo Hình 1: Tiêu giọt ép nước dưa cải chua độ phóng đại ×1000 Kết quan sát chuyển động vi khuẩn mẫu nước dưa cải chua: https://drive.google.com/open?id=1D0fQmMN8boiHn3Pm0sQXDpDiRPFKOenP Nhận xét giải thích Muối dưa hình thức lên men quen thuộc nhờ hoạt động c vi khu ẩn lactic acid (*) Vi khuẩn lactic vi khuẩn gây thối ban đ ầu có th ể phát tri ển, sau thời gian lượng acid lactic tích lũy làm ức chế phát tri ển c nhóm vi khuẩn gây thối (Nguyễn Lân Dũng, 2003) Sự diện axetic acid pH th ấp c mơi trường có lợi cho phát triển vi khuẩn lactic acid (*) Các vi khuẩn lactic acid xếp chung vào họ Lactobacteriaece Các vi khuẩn lactic khơng đồng mặt hình thái (vi khu ẩn d ạng que ng ắn, que dài l ẫn vi khuẩn hình cầu), Gram dương, khơng tạo thành bào tử hầu hết khơng di động Vì thế, hình ảnh thu tiêu giọt treo tiêu gi ọt ép c vi khuẩn lactic acid Các vi khuẩn có chuy ển động Brown, h ầu nh không di đ ộng Các vi khuẩn dịch chuyển hỗn loạn gần vị trí ban đầu s ự chuy ển đ ộng c phân tử nước kéo theo Tiêu giọt treo tiêu giọt ép cho phép quan sát vi sinh v ật s ống mơi trường lỏng nên ta thu hình dạng s ự di động c vi sinh v ật m ột cách chân thực Bàn luận Tiêu giọt treo tiêu giọt ép cho ta thấy d ễ dàng cách di chuy ển c vi sinh vật sống môi trường chất lỏng Đây phương pháp đ ơn gi ản ti ện l ợi để tìm hiểu hình dạng chuyển động vi sinh vật Tuy nhiên, kích thước vi khuẩn bé suốt nên để thu hình thái xác c vi khuẩn ta cần có phương pháp khác Để phân biệt chuyển động Brown chuyển động tự thân vi sinh vật tiêu giọt treo tiêu giọt ép, ta cần quan sát xác định:   Quãng đường vi khuẩn di chuyển khoảng thời gian Hướng di chuyển vi khuẩn so với hướng dịch chuy ển phân t ch ất lỏng Có thể so sánh chuyển động Brown vi khuẩn lactic n ước d ưa c ải mu ối chua với chuyển động tự thân vi khuẩn nước thịt thối quan sát b ằng tiêu giọt treo để phân biệt khác hai loại di chuyển vi sinh vật Chuyển động vi khuẩn có nước thịt thối: https://drive.google.com/open?id=1qnRsGtzmw1rrTF2Fa0mxVscsfwxysg4a Khi vi sinh vật quan sát có di chuy ển tự thân, cần có ph ương pháp khác đ ể xác định chế di chuyển vi khuẩn Những vi khuẩn di chuy ển thật s ự có th ể di chuyển nhờ tiên mao (flagellar motion), di chuy ển theo ki ểu xoắn ốc (corkscrew-type motion) uốn khúc (bending-type motion) tr ượt nh ẹ nhàng (gliding motion) Ngoài ra, mẫu tiêu có vật chất có hình d ạng cách di chuy ển khác với vi khuẩn lactic Tuy nhiên vật chất không ph ải đ ối t ượng quan sát không đủ sở để đưa kết luận chúng Để thực tiêu gọt treo ta cần lưu ý số điều sau:  Đặt vị trí quan sát phía rìa giọt nước vi khuẩn tập trung nhi ều khu vực  Tiêu giọt treo quan sát chuyển động vi sinh vật d ễ dàng h ơn quan sát tế bào vi khuẩn có kích thước lớn  Nhờ có lớp gờ Vaseline giữ ẩm, tiêu gi ọt treo có th ể quan sát gi ữ mẫu vi sinh vật lâu Trong đó, tiêu giọt ép có số ưu điểm hạn chế như:  Dụng cụ dễ kiếm, thao tác đơn giản, chuẩn bị mẫu nhanh  Quan sát hệ vi sinh vật có mẫu tự nhiên  Tiêu dễ bị khô chịu ảnh hưởng nhiệt độ đèn chi ếu sáng nên không giữ lâu Đồng thời, sử dụng kính hiển vi quang học sáng cho tiêu gi ọt treo tiêu giọt ép, cần điều chỉnh nguồn sáng cường độ yếu để vi sinh v ật suốt có tương phản với sáng để dễ quan sát Tài liệu tham khảo Lê Văn Việt Mẫn (2006) Thí nghiệm Vi sinh vật Thực phẩm, NXB ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003) Vi sinh vật học NXB Giáo dục Webleyd, D M (1953) A Simple Method for Producing Microcultures in Hanging Drops with special reference to Organisms Utilizing Oils.Macaulay Institute for Soil Research, Craigiebuckler, Aberdeen 66-71 Anthony W Thomas (2011) Making a wet mount microscope slide Microbehunter Microscopy Magazine, 1: 5-6 Bài 2: TẠO VẾT BÔI VÀ NHUỘM ĐƠN Mục đích Tạo vết bơi giúp cố định vi sinh vật lên phiến kính, vi khuẩn bắt màu thuốc nhuộm tốt để dễ dàng quan sát hình thái đặc điểm cấu trúc vi sinh vật Nhuộm vi sinh vật phẩm nhuộm xác định xác hình thái, xếp, kích thước vi khuẩn không màu, xác định đặc điểm cấu tạo tế bào vi khuẩn dựa thuốc nhuộm chuyên biệt Kết thí nghiệm Q trình tạo vết bơi nhuộm đơn tiến hành nước dưa cải muối chua chứa vi khuẩn lactic acid Hình 2: Vi khuẩn hình que nước dưa cải muối chua nhuộm crystal violet quan sát độ phóng đại ×1000 Tạo vết bơi nhuộm đơn nước dưa cải muối chua cho thấy hình ảnh vi khuẩn hình que có độ dài ngắn khác nhau, bắt màu tím đen thuốc nhuộm crystal violet Các vi khuẩn đứng riêng lẻ (A) xếp thành chuỗi (B), ngồi có hình ảnh trường hợp vi khuẩn xếp thành cụm tế bào hình que song song Nhận xét giải thích Mẫu nước dưa cải muối chua chứa nhiều vi khuẩn lactic acid Những vi khuẩn có hình que, đứng riêng lẻ tạo thành chuỗi Căn vào hình dạng, vi khuẩn quan sát được gọi bacillus (số nhiều bacilli), chúng đứng thành chuỗi gọi streptobacilli Trường hợp quan sát vi khuẩn xếp thành cụm tế bào hình que song song vi khuẩn bước vào q trình nhân đơi phân chia Khi đó, kích thước vi khuẩn nhỏ vi khuẩn giai đoạn sinh trưởng nên hình ảnh thu vi khuẩn hình que có kích thước khác Trong q trình tạo vết bơi nhuộm đơn, vết bôi dày làm vi khuẩn xếp chồng lên dẫn đến khó quan sát xác hình dạng, kích thước cách xếp vi khuẩn Bàn luận Các thành phần tế bào vi sinh vật nhạy cảm với thuốc nhuộm Phẩm nhuộm sử dụng để nhuộm vi khuẩn có ion tự có khả kết hợp kết hợp với thành phần tế bào để tạo thành muối có khả bắt màu giữ màu phẩm nhuộm tốt Những lỗi thường gặp trình tạo vết bôi nhuộm đơn:  Tạo vết bôi dày, lượng mẫu vi sinh vật nhi ều làm vi sinh v ật x ếp ch ồng lên    Thời gian nhuộm ngắn qúa dài loại thuốc nhuộm Lượng thuốc nhuộm dư khơng rửa trơi tồn Hơ q nóng làm phá vỡ cấu trúc tế bào vi khuẩn Tài liệu tham khảo Lê Văn Việt Mẫn (2006) Thí nghiệm Vi sinh vật Thực phẩm, NXB ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh M.R.Adams and M.O.Moss.(2000) Food Microbiology Second Edition The Royal Sociaty of Chemistry Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty.(2003), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục TS Trịnh Khánh Sơn (2018) Các kĩ thuật thực nghiệm vi sinh vật học NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Michael J Leboffe and Burton E Pierce 2010 Microbiology Laboratory Theory & Application.Third Edition Morton Publishing Company Churchman, J.W (1912) The selective bactericidal action of gentian violet, Journal of Experimental Medicine, 16 (2): 221–247, plates 21–31 BÀI 3: NHUỘM GRAM Mục đích Phân biệt lồi vi khuẩn thành hai nhóm Gram d ương Gram âm T phân biệt khác thành phần hóa sinh thành tế bào Kết thí nghiệm Thuốc nhuộm Kết Crystal violet ( nhuộm đơn) (thuốc nhuộm thứ nhất): vi khuẩn có màu tím đen Safranin O (nhuộm đơn) (thuốc nhuộm thứ hai) vi khuẩn có màu hồng Crystal violet + safranin O (nhuộm Gram): vi khuẩn giữ màu tím đen (B) màu hồng (A) Bảng 1: Kết so sánh vi khuẩn lactic nhuộm Gram nhuộm đơn crystal violet safranin O Trong quy trình nhuộm Gram, crystal violet đóng vai trò thuốc nhu ộm th ứ nhất, Safranin O đóng vai trò thuốc nhuộm thứ hai Bọt khí Thạch đứng tách làm phần Hình 4a Hình 4b Hình a-b: Thạch đứng sau ni cấy nấm men 20 Hình 10: Thạch nghiêng sau nuôi cấy nấm men Nhận thấy: xuất bọt khí q trình ni cấy Nhận xét Mật độ khuẩn lạc hai mẫu có độ khác rõ rệt thời gian phát tri ển chênh lệch tương đối đáng kể, khuẩn lạc men bánh mì dày đặc Yakult mọc lên cách thưa thớt Khuẩn lạc mẫu men bánh mì phân lập gần nh ững đ ường c cu ối cùng, bên cạnh khuẩn lạc Yakult phân lập đ ường cấy đ ầu tiên Bàn luận Trong kĩ thuật cấy ria mật độ vi sinh vật gi ảm dần để hình thành khu ẩn l ạc riêng rẽ do: số lượng khuẩn lạc lấy với số lượng lớn đầu que cấy vòng sau ria bề mặt mơi trường thạch, chúng bám dính lên mơi tr ường giảm dần theo đường cấy Tại số vị trí đường cấy tế bào riêng l ẻ r ời khỏi đường cấy phát triển thành khuẩn lạc riêng rẽ v ậy không ph ải m ỗi khuẩn lạc hình thành đĩa thạch sau trình cấy ria đ ều đ ược hình thành t m ột tế bào ban đầu Môi trường sử dụng để đổ đĩa M1 (môi trường giá đậu đường) bổ sung chất dinh dưỡng thích hợp giúp khuẩn lạc phát tri ển bên c ạnh 21 chứa lượng Agar loại polysaccharide tách từ m ột loại rong bi ển Đây loại phức hợp polysaccharide mà thành phần agarose agaropectin khó để vi sinh vật tiêu thụ t ạo ều ki ện cho khu ẩn l ạc bám dính (Hồng Kim Anh.2006) Ở kỹ thuật cấy thạch đứng, trình phát triển vi sinh v ật có sinh bọt khí, vi sinh vật phát triển mạnh bọt khí nhi ều nh ưng không th ể n ổi lên bề mặt xảy tượng nứt thạch agar gi ữa mi ếng th ạch b ị khí sinh đẩy lên Sự khác kỹ thuật thạch đứng thạch nghiêng: kỹ thuật th ạch nghiêng vi khuẩn phát triển bề mặt môi trường (trong ều ki ện hi ếu khí) chúng phân giải Glucose thành CO nước sinh lượng, sau hết Glucose chúng tiếp tục dị hóa Pepton để tiếp tục sinh lượng Pepton có thành phần chính: peptide, protein, axit amin t ự Sự phân gi ải acid amin pepton tạo NH3 làm bề mặt có mơi trường kiềm Ngược lại kỹ thuật thạch đứng vi khuẩn phát triển điều kiện yếm khí Glucose lên men t ạo sản phẩm acid hữu làm PH môi trường giảm xuống (Linde 1999) Các yếu tố số lưu ý kĩ thuật cấy ria:  Số lượng mẫu lấy vào đầu que cấy vừa phải, khơng q nhi ều nh th ế khó để tách thành tế bào riêng rẽ  Cần bảo quản (bọc kín) cách cẩn thận để tránh phát tri ển c nấm mốc lên môi trường dẫn tới hư mẫu  Kỹ thuật cấy khơng đạt dẫn đến đường cấy bị đè lên nhau, l ượng mẫu dày mơi trường thạch Tài liệu tham khảo Hồng Kim Anh.2006.Hidrocacbon.In hóa học thực phẩm.Nhà xuất khoa học kỹ thuật 224-226 J.j.M.Ter Linder, H Liang, R.W Davis, H.Y.Steensma, J.P.Van Dijken, J.T Pronk.1999 Genome-Wide Transcriptional Analysis of Aerobic and Anaerobic Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae Journal of bacteriology 7409-713 TS Trịnh Khánh Sơn (2018) Các kĩ thuật thực nghiệm vi sinh vật học NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 22 Bài 7: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN Mục đích Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất diện lớn đơn vị thể tích mẫu Định lượng dựa kết định tính loạt ống nghiệm lặp lại số độ pha loãng khác Kết thí nghiệm a Sau cho mẫu vào môi trường LSB Bảng 3:Số ống dương tính 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 3 0 Sinh bọt khí Hình 11: Ống nghiệm dương tính 23 Ống nghiệm đổi màu Hình 12: So sánh ống nghiệm dương tính ống nghiệm khơng dương tính Từ kết thí nghiệm lựa chọn tiến hành tra bảng MPN ta thu kết sau: Bảng 4: Số ống dương tính nồng độ 10-2 10-3 10-4 Tra bảng MPN MPN/ml 43 43×102 b Sau cho mẫu vào môi trường BGBL Bảng 5: Số ống dương tính nồng độ Nồng độ 10-1 10-2 10-3 Số ống dương tính 24 Bọt khí Hình 13: Ống nghiệm dương tính 25 Nhận xét Dựa vào kết thu cho thấy mật độ Coliforms mẫu tương đối Bàn luận Coliform có khả lên men lactose (là chất có LSB) sinh h acid Khi acid tạo thành độ pH môi trương bị gi ảm xu ống v ậy m ẫu ống nghi ệm có tượng đổi màu Cần phải sử dụng ống Durham để nhận biết bọt khí sinh (bọt vào ống Durham), mắt thường quan sát cách rõ ràng Độ xác trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghi ệm lặp l ại độ pha mẫu Phương pháp MPN sử dụng để nhận diện số sinh vật có khả sinh khí đổi màu mơi tr ường đ ược ch ọn Ph ương pháp cho phép đ ịnh lượng mật độ vi khuẩn thấp thể tích mẫu lớn Sau thu ống nghiệm dương tính mơi tr ường LSB cần s d ụng môi trường EC hay BGBL (trong dùng BGBL) đ ể kh ẳng đ ịnh xác s ự có m ặt Coliforms vi sinh vật có biểu dương tính loại mơi tr ường Bên cạnh chuyển đổi môi trường để cung cấp thêm l ượng chất dinh d ưỡng cho vi sinh vật Một số ứng dụng: xác định độ nhiễm khuẩn mẫu nước sinh hoạt, n ước thải công nghiệp Các yếu tố ảnh hưởng đến độ xác thí nghiệm:  Pha mẫu Pipette nên nồng độ đạt khơng chuẩn xác kỹ thuật người làm  Thời gian giữ ống bể nước ấm kéo dài khiến mẫu bị nhiễm khuẩn từ môi trường ảnh hưởng đến kết cuối  Người quan sát mắc sai lầm nhận định ống dương tính Tài liệu tham khảo Trinh Khanh Son 2018 Các kỹ thuật thực nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại Học Quốc Gia TP.HCM 103-105 26 Bài 8: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN, NẤM MỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Mục đích Thí nghiệm dùng để định lượng tổng số nấm men, nấm mốc có 1ml mẫu nước pha loãng lấy từ tự nhiên tính tốn t lượng nấm men n ấm m ốc có 1g đất mẫu, từ ứng dụng thực tế vào định l ượng t s ố n ấm men, nấm mốc có mẫu thực phẩm mang phân tích Kết thí nghiệm Theo kết thu đĩa thạch xuất khuẩn lạc có hình dạng tròn, lồi viền mọc riêng lẻ với độ phân tán không với số lượng không nhi ều, s ố lượng giảm nhiều với đĩa thạch có độ pha loãng cao Số l ượng khu ẩn l ạc nằm khoảng 25-250 CFU xảy đĩa thạch có độ pha lỗng mẫu Khuẩn lạc Hình 14: Khuẩn lạc mọc đĩa thạch với độ pha lỗng mẫu 27 Hình 15: Khuẩn lạc mọc đĩa thạch có độ pha lỗng mẫu Bảng 6: Số khuẩn lạc đếm độ pha loãng Độ pha loãng 10-2 10-3 10-4 10-5 - Tính kết quả: Đĩa 109 Đĩa 80 1 Đĩa 78 0 Theo kết qủa quan sát có đĩa petri với độ pha lỗng có số khuẩn l ạc đĩa nằm khoảng 25-250 CFU nên tổng số khuẩn lạc 1ml huyền phù tính theo cơng thức: 28 Trong đó: N số khuẩn lạc 1ml mẫu tổng số khuẩn lạc tất đĩa đếm được: 109, 80, 78 số đĩa độ pha loãng () d độ pha loãng đĩa đầu tiên: Vậy kết đếm khuẩn lạc ta tính được: N8.9 CFU/ml Tổng lượng khuẩn lạc có 10ml mẫu chứa 1g đất ban đầu 8.9 CFU Nhận xét Khi quan sát đĩa thạch ta thấy khuẩn lạc mọc riêng l ẻ khu ẩn đ ược nuôi cấy phương pháp đổ đĩa (được lắc với môi tr ường tr ước ủ-giúp phân tán tế bào khắp môi trường bên thạch v ới điều ki ện vi hi ếu khí kỵ khí) Thời gian ủ ngắn nên quan sát thấy t ế bào phát tri ển lúc ban đầu loại nấm Các tế bào khuẩn lạc xuất đĩa thạch với s ố l ượng n ấm men nấm mốc vi sinh vật hiếu khí, số sinh trưởng điều kiện vi hiếu khí lắc đĩa thạch khơng dẫn đến phân tán khơng đồng Ngồi mẫu chứa vi sinh vật pha lỗng mẫu khơng lắc dẫn đến mật độ khuẩn lạc xuất nhiều độ pha loãng t trở Bàn luận Ưu điểm phương pháp định lượng nấm thông qua vi ệc cấy môi tr ường thạch định lượng tế bào sống mẫu khảo sát ban đ ầu, nhiên cần có thời gian ni cấy đủ lâu kết định lượng thể rõ ràng Môi trường sử dụng để nuôi cấy nấm môi trường (giá đậu đường): Agar, Glucose, Pepton bổ sung thêm Cloramphenicol (kháng sinh) vào đ ể ức ch ế ho ặc tiêu diệt số loại vi sinh vật khác Kỹ thuật cho kết tối ưu kỹ thuật tr ải đĩa h ạn ch ế s ự ti ếp xúc trực tiếp với oxy tế bào nuôi cấy 29 Các yêu cầu lưu ý kỹ thuật định lượng phương pháp đổ đĩa:  Khi pha loãng mẫu cần lắc ống nghiệm chứa mẫu pha loãng máy lắc tiếp tục thực độ pha loãng  Khi đổ đĩa vào chung với môi trường thực thao tác xoay tròn đĩa petri đậy nắp 3-5 vòng ngược chiều cần lưu ý không để môi tr ường ch ứa huy ền phù dính lên thành hay nắp đĩa  Thao tác phải nhanh tránh để môi trường bị đông lại chưa đổ đĩa  Giữ nắp đĩa petri không để tiếp xúc trực tiếp với mặt bàn, lật ngược nắp đĩa petri xuống thạch khô mang ủ tránh nhi ễm loại vi khu ẩn khác vi sinh vật mọc loang làm ảnh hưởng đến kết đếm Tài liệu tham khảo Lê Văn Việt Mẫn 2010 Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, NXB ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh 28-33 Horizontal methods the enumeration of yeasts and moulds 2012 Syrian National Standard Development Draft Part TCVN vi sinh vật thực phẩm 30 Bài 9: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Mục đích Vi khuẩn hiếu khí nhóm vi khuẩn t ồn phát tri ển mơi trường có chứa oxy Vi khuẩn hiếu khí xuất nhiều thực phẩm gây hư hỏng ngộ độc thực phẩm nên việc định lượng có mặt khuẩn hi ếu khí thực phẩm cần thiết Định lượng vi khuẩn hi ếu khí th ực ph ẩm có th ể đ ược thực phương pháp nuôi cấy trải bề mặt thạch (trải đĩa) Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí dùng để đánh giá ch ất l ượng c m ẫu vi sinh vật, nguy hư hỏng, thời hạn bảo quản sản phẩm, m ức độ v ệ sinh trình chế biến, bảo quản sản phẩm Kết thí nghiệm a Kết đếm khuẩn lạc đĩa petri Bảng 7: Bảng kết Độ pha loãng Đĩa Đĩa Đĩa 43 44 28 13 13 Hình đĩa petri 31 4 4 3 b Tính tổng số khuẩn lạc Trong đó: 32 N: số tê bào có 1ml mẫu Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa (25-250 CFU) : số đĩa độ pha loãng (có kết chấp nhận) : Số đĩa độ pha lỗng kế ( có kết chấp nhân) d: độ pha loãng đĩa Với kết khuẩn lạc đếm ta tính tổng số khuẩn lạc 0.1ml huyền phù: (CPU/ml) Nhận xét - Mật độ khuẩn lạc đĩa (