B ộ• GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO • • B ộ Y TÉ• TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • _ • • • CAO CƠNG KHÁNH NGHIÊN CỨU XÂY D ựN G QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐƠNG THỜI VITAMIN A VÀ VITAMIN E TRONG SỮA BẰNG KỸ THUẬT HPLC LUẬN VĂN THẠC SỸ Dược HỌC • • • • HÀ NỘI - 2010 ỉtll »'■■ —— — s s b b s s s b êbêêêb b s b êêM B ộ YTÉ B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO • • • TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • Dược HÀ NỘI • • CAO CƠNG KHÁNH NGHIÊN CỨU XÂY Dự NG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI VITAMIN A VÀ VITAMIN E TRONG Sữ A BẰNG KỸ THUẬT HPLC • LUẬN VĂN THẠC SỸ D ợ c HỌC • • • • CHUYÊN NGÀNH: KIể M NGHIỆM THUỐC VÀ Độc CHẤT MÃ SỐ: 62 73 15 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tường Vy TR Ư Ơ N G ĐH ĐƯ ỢC HÀ N Ộ I T H U ' V ỈỆ SM HÀ N Ộ I-2 N gày th án g ’năm 20 .í SỐ3KCB: Ịi i — * “ LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực luận văn, nhận bảo tận tình thầy cơ, eiúp đỡ anh chị, gia đình đồng nghiệp Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - TS Nguvễn Tường Vy - Phòng sau đại học, Trường đại học Dược Hà Nội người trực tiếp hướng dẫn chu đáo, nhiệt tình để tơi có kết Xin gửi tới Cô aiáo lời cảm ơn chân thành Xin trân trọng cảm 077/ - Đảng uỷ, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học Trường đại học Dược Hà Nội - Thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội, Bộ mơn Hóa Phân tích dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho năm tháng học tập trường Xin gửi lời cảm 07ĩ chân thành tới: - Lãnh đạo Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phâm quốc gia tạo điều kiện cho học tập nâng cao kiến thức - Labo Hóa độc thực phẩm - Viện KNATVSTPQG ln giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Xim cảm ơn Cha mẹ, bạn bè, đồng nghiệp người thân dành tình cảm, độnR viên khích lệ thời gian qua Hà Nội, ngày tháng năm 2010 Cao Công Khánh MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Đặt vấn đề Chương 1: Tổng quan 1.1 Đại cưong vitamin A vitamin E 1.1.1 Đặc điểm lý hóa 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng vitamin A vitamin E 1.2 Các phưong pháp xác định vitamin A vitamin E sữa 1.2.1 Tách chiết hai vitamin A E khỏi mẫu thử .7 1.2.2 Các kỹ thuật định lượng vitamin Avàvitamin E 11 1.2.3 Phương pháp xác định đồng thời hai vitamin A vitamin E HPLC 13 Chưong 2: Đối tượng, nội dung, phương pháp nghiên cứu 16 2.1 Đối tuọng nghiên cứu 16 2.1.1 Các loại sữa: 16 2.1.2 Cách lấy mẫu: 16 2.2 Phưoug tiện nghiên cứu 17 2.2.1 Thiết bị phân tích: 17 2.2.2 Dụng cụ phân tích 17 2.2.3 Hóa chất, thuốc thử 18 2.3 Nội dung nghiên c ứ u 18 2.3.1 Xây dựng quy trình xác định đồng thời vitamin A E sữa HPLC 18 2.3.2 Thấm định quy trình xây dựng 19 2.3.3 ứ n g dụng quy trình kỹ thuật xây dựng kiểm nghiệm thực phẩm 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu: 19 2.5 Phưong pháp xử lý số liệu .19 Chương 3: Kết nghiên u 21 3.1 Quy trình xác định đồng thòi vitamin A E sữa H P L C 21 3.1.1 Lựa chọn van bơm mẫu: 21 3.1.2 Lựa chọn bước sóng phát 21 3.1.3 Lựa chọn cột sẳc ký 22 3.1.4 Lựa chọn thành phần pha động 22 3.1.5 Lựa chọn nhiệt độ buồng cột 23 3.1.6 Lựa chọn tốc độ pha động 24 3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 25 3.2.1 Lựa chọn dung môi chiết 25 3.2.2 Khảo sát thời gian thủy phân m ẫ u 26 3.2.3 Khảo sát nhiệt độ thủy phân mẫu 26 3.2.4 Khảo sát nồng độ KOH ethanol 27 3.3 Thẩm định quy trình xây dựng 30 3.3.1 Độ chọn lọc .30 3.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính: 30 3.3.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng: 36 3.3.4 Tính thích hợp hệ thống: 37 3.3.5 Độ lặp lại phương pháp .38 3.3.6 Độ đúng, độ thu hồi phương pháp 39 3.3.7 Độ bền vững/on định phương pháp 42 3.4 ứng dụng quy trình xây dựng phân tích số mẫu sữ a 43 3.4.1 Kết phân tích mẫu thực t ế : 43 3.4.2 Kết thử nshiệm liên phòng: 48 Chưong 4: Bàn luận .51 4.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật 51 4.1.1 Các điều kiện phân tích hệ thống HPLC 51 4.1.2 Điều kiện xử lý mẫu: .51 4.2 Thẩm định quy trình xây dựng 52 K ết luận kiến n g h ị: 55 Tài liệu tham khảo 57 Phụ lục 60 AOAC : (Association of Official Analytical Chemists) Hiệp hội nhà hóa học phân tích BHA : (Butylate HydroxyAnisole) - chất chống oxy hóa BHT : (Butylate HydroxyToluene) - chất chống oxy hóa CA, Ce : Nồng độ vitamin A, vitamin E FSV : (Fat Soluble Vitamins) - vitamin tan dau GLC: (Gas Liquid Chromatography) - sac ký khí lỏng m A- m E : hàm lượng trung bình vitamin A, vitamin E HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao IU : (International Units) - đơn vị quốc tế LOD : (Limit of detection) - giới hạn phát LOQ : (Limit of Quantitation) - giới hạn định lượng mg% : mg/100g PA : (Pure Analysis) - tinh khiết phân tích PDA : (Photo Diode Array) - mảng diod quang ppm : (part per million) - phần triệu RDI : (Recommended Daily Intake) - nhu cầu hàng ngày khuyến RSD : (Relative Standard Deviation) - độ lệch chuẩn tương đối STT : Số thứ tự Si : Diện tích píc sắc ký S : Diện tích píc trung bình TBHQ : Ir ■ (tert-butylhydroquinone) - chất chống oxy hóa thời gian lưu trung bình v - VIS : (Ultra Violet - Visible) - tử ngoại khả kiến TT T ên bảng T n g b ản g 1.1 Liều khuyến cáo bo sung vitamin hàng neày 3.2 Chương trình gradient pha động 23,25 3.3 Ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân mẫu 26 3.4 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân mẫu Ảnh hưởng nồng độ KOH trình xử lý mẫu: 27 28 3.6 Sự phụ thuộc diện tích píc với nơng độ vitamin A 31 3.7 Sự phụ thuộc diện tích píc với nông độ vitamin E 32 3.8 Kêt kiêm tra đường chuân vitamin A 34 3.9 Kêt kiêm tra đường chuân vitamin E 35 3.10 Độ lặp lại vê thời Ĩan lưu diện tích píc vitamin A 37 Độ lặp lại vê thời gian lưu diện tích píc vitamin E 38 3.12 Độ lặp lại phân tích vitamin A 38 3.13 Độ lặp lại phân tích vitamin E 39 3.14 Độ thu hồi phương pháp cho vitamin A 40 3.15 Độ thu hồi phương pháp cho vitamin E 41 3.11 3.16 Ket phân tích mẫu sữa hệ thống HPLC ban đầu 42 3.17 Kết phân tích mẫu sữa hệ thống thiết bị khác 42 TT Tên hình Trang 1.1 Cơng thức cấu tạo Retinol 1.2 Công thức cấu tạo vitamin E 3.3 Phô hâp thụ vitamin A 21 3.4 Phơ hâp thụ vitamin E 22 3.5 Quy trình xử lý mâu tách vitamin A E từ sữa 29 3.6 Sự phụ thuộc diện tích píc với nông độ vitamin A 31 3.7 Đường chuân biêu diên phụ thuộc tuyên tính 32 3.8 Sự phụ thuộc diện tích píc với nơng độ vitamin E 32 3.9 Đường chuân biêu diên phụ thuộc tuyên tính 33 3.10 Săc vitamin A nơng độ 0,016 ppm 36 3.11 Sắc đồ vitamin E nồng độ 0,25 ppm 36 hình ĐẠT VAN ĐE Trong sống hàng ngày, nhu cầu dinh dưỡng thể người vô quan trọne thiết yếu Nó CU112 cấp nguồn lượng yếu tố vi chất cần thiết khác siúp người tồn phát triển, đặc biệt trẻ nhỏ Trong số đó, khơng thể thiếu vitamin Vitamin phân tử hữu cần thiết cho hoạt độna, chuyển hố bình thường thể sinh vật Chúng thuộc nhóm chất có hoạt tính sinh học cao thể tự tổng họp mà phải đưa từ bên ngồi vào theo thức ăn Vì yếu tố vi lượng nên thể người cần lượng nhỏ vitamin loại thực phẩm thường ngày hay loại thực phẩm bổ sune Có nhiều loại vitamin chúng khác chất hoá học lẫn tác dụng sinh lý Vitamin A có nhiều chức quan trọng đổi với thể neười, đặc biệt thị giác Ngồi vitamin A ảnh hưởng để sinh trưởng phát triến mô, tể bào xương thể Nó có tác dụng làm tăng chức miễn dịch cần thiết cho sinh sản phát triển thai nhi Tuy nhiên, dùna liều, vitamin A gây độc: tăng áp lực nội sọ, chóng mặt, chứng nhìn đơi, trẻ em bị lồi thóp, co giật, viêm da tróc vảy tử vong Vitamin E chất chổng oxy hố tốt cản trở phản ứng sây hại ốc tự tế bào thể Nó ngăn ngừa lão hóa làm chậm phát sinh số bệnh ung thư làm giảm nguy mắc số bệnh tim mạch Nsồi ra, vitamin E kích thích hệ thống miễn dịch trì hoạt động bình thường Thiếu vitamin E gây bệnh thần kinh ngoại biên, điều hòa, viêm võng mạc Ngược lại, dùng vitamin E liều cao (trên 3000 IU ngày) gây rối loạn tiêu hóa (buồn nôn, đầy hơi, lỏng, viêm ruột hoại tử) Có nhiều nguồn thực phẩm cung cap vitamin A E cho Tron^ đó, loại thực phẩm có nguồn sốc động vật thườne phong phú loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật Trong loại thực phẩm sữa nguồn cung cấp vitamin A E quan trọng Nhu cầu hàng ngày người vitamin tính khoảng lOppm - lOOppm) nshiên cứu chúng tơi có khoảng tuyến tính vitamin A vitamin E rộng nhiều Giới hạn xác định nghiên cứu xác định vitamin A 0,016ppm vitamin E 0,25ppm So sánh với phương pháp khác, phương pháp có giới hạn phát gần tương đương với phương pháp Soledad A Hurtado cộng [23] (có LOD vitamin A 0,01 ppm LOD vitamin E 0,3ppm) Đồng thời, xác định giới hạn định lượng vitamin A 0,053ppm vitamin E 0,833ppm Hệ thống HPLC sử dụng phân tích định lượng vitamin A vitamin E có độ ổn định tốt, đạt yêu cầu tính tương thích Từ kết thực nghiệm thu cho thấy: độ lặp lại vitamin A có RSD% = 2,47%, độ lặp lại vitamin E có RSD% = 2,52% Kết so sánh với độ lặp lại thu nghiên cứu tác giả M Kuhn cộng [24] (có RSD nằm khoảng 1,2% - 4,8%) độ lặp lại thu nghiên cứu tác giả S.Albala-Hurtado cộng [23] (có RSD vitamin A 3,27% RSD vitamin E 2,25% Ngoài ra, so sánh với phương pháp tác giả A Escriva với cộng [20] (độ lặp lại có RSD vitamin A 5,24% vitamin E 6,99%) phương pháp chúng tơi có độ lặp lại tốt phân tích vitamin A vitamin E sữa Bảng 3.31: Độ lặp lại nồng độ khác (theo AO AC) Đon vị RSD (% ) H àm lượng % Tỷ lệ chất 100 10 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001 0.000001 0.0000001 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 100% 10% 1% 0.1 % lOOppm lOppm lppm lOOppb lOppb lppb 1.3 1.8 2.7 3.7 5.3 7.3 11 15 21 30 Nghiên cứu chúng tơi cho thấy: độ thu hồi trung bình vitamin A tất điểm nồng độ vào khoảng 95,33% độ thu hồi trung bình vitamin E tất điểm none độ vào khoảng 95,88% Các kết phương pháp gần tương đương với kết thu nghiên cứu tác giả A Escriva cộng [20] (có độ thu hồi vitamin A vitamin E 95,6% 96,5%) nghiên cứu tác giả M Kuhn cộng [24] (có độ thu hồi vitamin A vitamin E 106,3 ± 1,5% 102,3 ± 1,5%) So sánh với phương pháp khác, nghiên cứu chúng tơi có độ thu hồi tốt so với phương pháp tác giả Soledad A Hurtado cộng [23] (có độ thu hồi vitamin A 97,51 ± 1,45% vitamin E 85,98 ± 1,68%) Bảng 3.32: Độ thu hồi nồng độ khác (theo AO AC) H àm lượng [ %] Tỷ lệ chất Đon vị Độ thu hồi [%] 100 100% 98-102 >=10 10-1 10% 98-102 >=1 10-2 1% 97-103 >=0.1 10-3 0.1 % 95-105 0.01 10-4 ìooppm 90-107 0.001 10-5 lOppm 80-110 0.0001 10-6 lppm 80-110 0.00001 10-7 lOOppb 80-110 0.000001 10-8 lOppb 60-115 0.0000001 10-9 lppb 40-120 Các kết thực nghiệm chứng minh phương pháp xác định đồng thời vitamin A vitamin E sữa kỹ thuật HPLC có độ on định tốt Kết phân tích mẫu sữa thực mẫu sữa thử nghiệm liên phòng đạt kết cao Từ kết bảng cho thấy: hàm lượng trung bình (kết trung bình tất phòng thí nghiệm tham gia thử nghiệm) vitamin A mẫu DDP-3 DDP-4 841 |ig/100g 585 )ig/100g; hàm lượng trung bình vitamin E 16,28 mg/100g 6,45 mg/100g Bảng tổng họp cho thấy so với tập hợp kết chung vitamin A có z-score -0,804 1,813; vitamin E có z-score 0,409 -0,064 Các giá trị \z-score\ vitamin A vitamin E nhỏ Như phương pháp nghiên cửu định lượng đồng thời vitamin A vitamin E sữa đạt yêu cầu phân tích thử nghiệm liên phòng thí nghiệm KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ • KÉT LUẬN: Sau hoàn thành nghiên cứu này, sở kết phân tích thực nghiệm để xác định hàm lượng vitamin A vitamin E sữa kỹ thuật sắc ký lỏns hiệu cao HPLC, đạt kết sau: * Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời hai vitamin A E sữa tương ứng với giai đoạn: - Xử lý mẫu: Mầu sữa thủy phân dung dịch KOH 20%/Ethanol, sau chiết bans dung mơi n-Hexan Dịch chiết rửa với dung dịch NaCl 5% đem quay đến cạn Hòa cặn bang methanol, lọc qua màng lọc 0,45 Ịim đem phân tích hệ thống HPLC - Phân tích bàng HPLC: + Cột sắc ký: Symmestry Waters C18 tiền cột + Pha động: Methanol H20 thay đổi theo gradient + Detector PDA 292nm (vitamin E) 325nm (vitamin A) + Tổc độ dòng: ml/phút, nhiệt độ buồng cột: 40°c * Phương pháp xây dựng thẩm định cho thấy có tính chọn lọc, có độ ổn định cao, có độ lặp lại độ thu hồi tốt, áp dụng vào thực tế - Khoảng tuyến tính rộng: + Vitamin A: từ 0,064ppm đến 96ppm + Vitamin E: từ lppm đến 250ppm - Giới hạn phát hiện: + Vitamin A 0,016ppm + Vitamin E 0,25ppm - Giới hạn định lượng: + Vitamin A 0,053ppm + Vitamin E 0,83 3ppm - Độ lặp lại độ thu hồi đáp ứnơ yêu cầu AOAC * Áp dụng quy trình phân tích xây dựng trên, chúns tơi tiến hành xác định hàm lượng vitamin A vitamin E số mẫu sữa bột sữa lỏng Phươns pháp cũne đạt kết tốt tham gia phân tích mẫu sữa liên phòng thí nehiệm • KIÉN NGHỊ: - Phươne pháp cho kết định lượng hai vitamin A E với độ tin cậy cao Cần tiếp tục nahiên cứu mở rộng phân tích đối tượng khác như: sữa đặc, sữa chua, váng sữa sản phẩm từ sữa bơ, mát, - Đe xây dựng sở liệu hàm lượng vitamin A vitamin E trone loại sữa thị trường Việt Nam, cần thiết phải mở rộng nehiên cứu nhiều loại sữa sản phẩm từ sữa nữa, nhằm đáp ứne nhu cầu sử dụng người tiêu dùns nhà khoa học dinh dưỡng - Đây phương pháp có nhiều ưu điếm: đơn eiản, phù hợp với điều kiện nhiều phòng thí nahiệm Neu có thể, chúng tơi mong tiếp tục nghiên cứu thêm để hoàn chỉnh phương pháp phương pháp chuẩn công nhận trona, nước TÀI LIỆU THAM KHẢO rp > • 1• ^ r Ả* * T* Á Tài liệu tiêng Việt Bộ Y tế (2002): -‘Dược điển Việt Nam III” NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2006): "Dược lâm sàng" NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2006): ‘*Hóa Dược”, tập NXB Y học Hà Nội Bộ Y tế (2006): "Hóa Phân tích", tập NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2006): “‘Kiểm nghiệm dược phẩm” NXB Y học, Hà Nội Phạm Luận (1989): Giáo trình sở lý thuyết sắc ký lỏng cao áp HPLC, trường đại học tổng hợp Hà Nội Thái Phan Quỳnh Như (2005): Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu cao, Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tể Lan Phương (2001), ‘"Bách khoa tồn thư vitamin, muối khốne yếu tố vi lượns" NXB Y học, Hà Nội Phạm Văn sổ, Bùi Thị Như Thuận (1978): “Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm'’ NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 10.TCVN 7081-1:2002: “Sữa bột gầy: Xác định hàm lượng vitamin A, phần 1: phương pháp so mầu" 11.TCVN 7081-2:2002: “Sữa bột gầy Xác định hàm lượng vitamin A Phần 2: Phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu cao” 12 Viện Dinh Dưỡng (2007): "Hỏi đáp dinh dưỡng’', NXB Y học, Hà Nội 13 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phấm quốc gia (2010): “Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh’’ NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 14 AOAC International (2002): Official method o f analysis o f AOAC International, 17th edition 15 AO AC Official Method 992.03: "Vitamin E Activity (All-rac-a- Tocopherol) in Milk-Based Infant Formula" Liquid Chromatographic Method 16 AOAC Official Method 992.06: "Vitamin A (Retinol) in Milk-Based Infant Formula" Liquid Chromatographic Method 17 Ake M., Fabre H., Malan A K Mandrou B (1998) “Column liquid chromatography determination of vitamins A and E in powdered milk and local flour: a validation procedure” Journal o f Chromatography A , Volume 826 (2), Pages 183-189 18 Blake c J (2007): "Committee on Food Nutrition: Fat-Soluble Vitamins" General referee reports: Journal o f AO AC international, 90 (1) 19 Chavez-Servin J L., (2008): ‘'Vitamins A and E content in infant milkbased powdered formulae after opening the packet" Food Chemistry, 106, p.299-309 20 Escriva A., Esteve M.J (2002): “Determination of liposoluble vitamins in cooked meals, milk and milk products by liquid chromatography" Journal o f Chromatography A, 947, p.313-318 21 Granado-Lorencio F.„ Olmedilla-Alonso B., Heưero-Barbudo c (2006) ‘'Simultaneous determination of vitamins A, E and 25-OH-vitamin D: Application in clinical assessments'’, Clinical Biochemistry 39, p 180-182 22 Hewavitharana A K Hamett M (1996): “Simultaneous liquid chromatographic determination of vitamins A, E and (3-carotene in common dairy foods*’,International Dairy Journal, (6), Pages 613-624 23 Hurtado s A , (1997): ‘'Determination o f vitamins A and E in infant milk formulae by high-performance Chromatography A, 778, p.243-246 liquid chromatography” Journal of 24 Kuhn M., Nakib s (2008): •"Simultaneous determination of retinol and tocopherol in polymeric diets for enteral nutrition" Journal of Chromatography A, 1205, p 186-190 25 Kienen V., Costa w F Visentainer J V (2008), “Development o f a green chromatographic method for determination of fat-soluble vitamins in food and pharmaceutical supplement", Talanta 75, p 141-146 26 Luque-Garcia J L., Luque de Castro (2001): "Review: Extraction of fatsoluble vitamins'’ Journal o f Chromatography A, 935, p.3-11 27 Maraschiello c , Garcia-Resueiro J A (1998): "Procedure for the determination of retinol and a-tocopherol in poultry tissues using capillary gas chromatography with solvent venting injection" Journal of Chromatography A, 818, p 109-121 28 Nolet L.M.L (1992): “Food analysis by HPLC”, Marcel Dekker, p.276-339 29 Rizzolo A , Polesello s (1992): “Review: Chromatographic determination o f vitamins in foods'’ Journal o f Chromatography, 624, p 103-152 30 Rishi L , Aseher M., Yaqoob M , Nabi A (2009), "Enzymatic determination of vitamin A in pharmaceutical formulations with spectrophotometric detection”, Spectrochimica Acta Part A 72, p 989-993 31 Rodas-Mendoza B , Pons s M , Lopez-Sabater M c (2003): “Rapid determination by reversed-phase high-performance liquid chromatography of Vitamins A and E in infant formulas" Journal o f Chromatography A , 1018 (2), Pages 197-202 32 Steghens J p., Van Kappel A L., Riboli E., (1991): “Simultaneous measurement of seven carotenoids, retinol, and alpha-tocopherol in serum by hi ah performance liquid chromatography”, Journal o f Chromatography A, 572, p 103-106 33 Turner c , Mathiasson L (2000): “Determination of vitamins A and E in milk powder using supercritical fluid extraction for sample clean-up” Journal o f Chromatography A, 874, p.275-283 PHỤ LỤC * Sắc đồ vitamin A mẫu sữa thẩm định độ lặp lại: Detector A Ch1:325nm < 'ễ « l I 0.0 l!o f 2.0 Z.0 4.0 5.0 6.0 v U u U 7Ì0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 nin * Sắc đồ vitamin E mẫu sữa thẩm định độ lặp lại :ỊDetector A Ch2:292nm 60-j 50^ 40- 30^ 20 10-= y~ĩ — — o!o J _ _ 1.0 2.0 3.0 4.0 s'o 6.0 7^0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 nin 12.0 13.0 14 nin * Sắc đồ vitamin A mẫu sữa thêm chuấn nồng độ thấp Detector A Chĩ:325nm 75- I 501 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 * Sắc đồ vitamin E mẫu sữa thêm chuấn nồng độ thấp rrt/ o!o 10 2!o Z.0 40 5.0 ôlo 7.0 8!o 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 rrin 13.0 14.0 rrin' 14 mn * Sắc đồ vitamin E mẫu sữa thêm chuẩn none độ trune bình rrV _ - Detector A Ch2:292nm o!o 10 2.0 3.0 40 5.0 6.0 7.0 ao 9.0 10.0 11.0 12.0 * Sắc đồ vitamin A mẫu sữa thêm chuẩn nồng độ cao rĩị/Detector A Ch1:325nm < E IL ^ 0.0 10 2.0 3^0 4.0 5.0 6^0 7.0 8.0 9.0 10.0 * Sắc đồ vitamin E mẫu sữa thêm chuẩn nồng độ cao ni/ 11.0 12.0 _ 13.0 mAU mAU mAU Sắc đồ vitamin A mẫu sữa liên phòng DDP-4 mAU * Mnutes j I j > 10 12 14 10 12 14 mAU Sắc đồ vitamin E mẫu sữa liên phòng DDP-4 mAU * Minutes Minutes * Độ tinh khiết píc: j\ Purily Match \ Purify Ktoch /y| 7ẶA 999 Ạ fịt ỉ :tw i552' V, *» ;-ik «*i Wavelength í nm) Wavelength (nm) piiỉTS tmpuit N B a 7.a s a A Tim e (m in) * Sơ đồ hệ thống HPLC: HPLC System Solvent HPLC Column Data Injector Ị AutoSampler Pump Detector Waste QUY TRÌNH KỸ THUẬT Xác định hàm lượng vitamin A vitamin E sữa kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Nguyên lý Vitamin A vitamin E trons mẫu sữa thủy phân dung dịch KOH/ethanol chiết bane n-hexan Dịch chiết đem , hồ cặn bans methanol phân tích bàng máy HPLC, cột sắc ký pha đảo c 18, với detector PDA Dung môi pha động sử dụne là: methanol H20 Phạm vi áp dụng Quy trình áp dụne cho loại sữa Tài liệu viện dân 3.1.Guillermo A., Chichester c o , Luis A M et al, (1982) Biochemical Methodology’fo r the Assessment o f Vitamin A Status, The International Vitamin A Consultative Group-IVACG 14-74 3.2 Leo M L N (1992) Food Analysis by HPLC, Food Science and Technolog 275-340 Định nghĩa: Không Dụng cụ, thiết bị 5.1 Thiết bị 5.1.1 Hệ thống sac ký lỏns hiệu năne cao với detector PDA RF 5.1.2 Máy quana phổ hấp thụ UV-VIS ÍTP ^ • 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.1.7 1• a • ^ A Máy cất quay chân không Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ Cân phân tích độ xác 0,1 mg 0,0lm g Cân kỳ thuật độ xác 0,01 2, Máy đồng mẫu 5.2 Dụng cụ 5.2.1 Pipet loại 5.2.2 Bình định mức loại 5.2.3 Lọ nhựa có nắp 5.2.4 Phễu chiết 5.2.5 Bình cất quay chân khơng Hóa chất, thuốc thử 6.1.1 Chuẩn Retinol, a-Tocopherol 99,5% (Sigma) 6.1.2 Acetonitril (merck) 6.1.3 Methanol (Merck) 6.1.4 n-hexan (TQ) 6.1.5 Natri chlorua (TQ) 6.1.6 Natri sulfat khan (TQ) 6.1.7 Ethanol (Merck)) 1.8 BHA, BHT, TBHQ (TQ) 6.1.9 KO H(TQ ) Các dung mơi hóa chất sử dụng loại tinh khiết phân tích Các bưóc tiến hành 7.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 7.1.1 Dune dịch chuẩn gốc 1000|^g/ml: Cân xác 100 mg chất chuẩn Retinol/a-Tocopherol (6.1.1) cân phân tích (5.1.5), hồ tan chuyên vào bình định mức 100ml (5.2.2), định mức băng ethanol (6.1.7) nhiệt độ phòns, lắc kỹ Các dung dịch chuẩn gốc bảo quản 4°c, sử dụng thána 7.1.2 Duna dịch chuẩn trung gian 100|!g/ml: Lấy xác 10ml dung dịch chuẩn gốc 1000 |ig/ml (7.1.1) pipet (5.2.1) cho vào bình định mức 100ml (5.2.2), pha loãng tới vạch mức bang ethanol (6.1.7) nhiệt độ phòng lắc kỹ, bảo quản 4°c sử dụng tháng 7.1.3 Duns dịch chuẩn làm việc Retinol 10 ng/ml: Lấy xác ml dung dịch chuẩn 100|ag/ml (7.1.2) pipet (5.2.1) vào bình định mức 50ml (5.2.2), định mức tới vạch bang Ethanol (6.1.7) nhiệt độ phòng, lắc hỗn họp.(Chuẩn làm việc a-Tocopherol 100|ig/ml: lẩy xác 5ml dung dịch chuẩn gốc lOOOụg/ml (7.1.1) pipet (5.2.1) cho vào bình định mức 50ml (5.2.2), định mức tới vạch ethanol (6.1.7) nhiệt độ phòng, lắc hỗn hợp Bảo quản ngăn đá tủ lạnh, pha dung dịch hàng tuần 7.1.4 Xây dựng đường chuẩn: - Dung dịch chuẩn Retinol chạy sắc ký (0.1; 0,5; fig/ml ) Lấy xác 0,1ml; 0,5ml; lml; 5ml chuẩn làm việc (7.1.3) pipet (5.2.1) cho vào bình định mức 10ml (5.2.2) Định mức tới vạch ethanol (6.1.7Ì nhiệt độ phòng - Dung dịch chuẩn a-Tocopherol chạy sắc ký (5; 25; 50 100 }!g/ml) Lấy xác 1,0; 5,0; 10ml duns dịch chuẩn làm việc (7.1.3) bàng pipet (5.2.1) cho vào bình định mức 20ml (5.2.2), định mức đến vạch bang ethanol (6.1.7) nhiệt độ phòng lẳc kỹ hỗn hợp - Bơm dung dịch vào HPLC tính tốn diện tích tạo thành Lập đường chuẩn mối quan hệ diện tích nồng độ tương ứng Đường chuẩn xây dựng phân tích với lượng mẫu lớn Có thê thay thê phương pháp tính theo đường chuẩn phương pháp so sánh với dung dịch chuẩn có nồng độ gần với nồng độ Retinol/a-Tocopherol mâu 7.2 Chuẩn bị mẫu 7.2.1 Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Lượng mẫu đem xử lý sơ khoảng lOOg - 200g Với mẫu sữa dạng bột mịn mẫu sữa dạng lỏng, cần lắc trộn trước đem cân 7.2.2 Mau thử Tuỳ thuộc vào hàm lượng vitamin có mẫu, cân xác 2-5 g mẫu xử lý sơ (7.2.1) cân phân tích (5.1.5) vào lọ nhựa có nắp (5.2.3) Thêm vào lọ khoảng 50ml dung dịch KOH 20% pha Ethanol cho khoảng 0,0lg BHT để chổng oxi hoá, khuấy trộn Thuỷ phân mẫu 80°c 35 p h ú t Chiết dung dịch sau thuỷ phân lần n-hexan (6.1.4) (lần với 100ml, lần với 50ml) , lấy lóp hữu bỏ lớp nước Gộp lóp dung mơi hữu chiết làm X 100ml nước muối 5% (có cho vài eiọt n-hexan đe bão hồ) trung tính Dịch chiết thu cho lọc qua giấy lọc có Natri sulfat khan (6.1.6) đế loại nước Dịch lọc đem cô quay chân không 40°c đến cạn, hoà cặn 5ml Methanol (6.1.7), chuyển vào lọ thuỷ tinh mầu có nắp kín tiến hành chạy sắc ký 7.2.3 M ầutrắns Tiến hành tươne tự mẫu thử (7.2.1) 7.2.4 Mau kiểm tra (thu hồi, QC) Tiến hành tương tự mẫu thử (7.2.1), thêm lượng xác chất chuẩn vào mẫu sau cân xác 7.3 Điều kiện chạy máy Hệ thống sẳc ký lỏng HPLC với detector PDA * Điều kiện chạy pha đảo: - Cột sắc ký lỏng C18 Waters (250mm X 4,6mm X 5|im) - Dung môi pha động: _ Thời gian (phút) % h 20 %Methanol 0.01 20 80 100 10 100 11 20 80 15 20 80 - Detector PDA : Ằ, = 325nm (với Vitamin A) X = 292nm (với Vitamin E) - Tốc độ dòng: ml/phút - Nhiệt độ buồng cột: 40°c - Thể tích tiêm mẫu: 50^L Tính tốn kết Căn vào đường chuẩn tương quan diện tích chiều cao pic nồng độ, vào diện tích chiều cao pic mẫu tính kết theo cơng thức sau X (mg/100g) = (100 X V X C m )/m l000 Trong đó: - V: thể tích dịch chiết cuối chạy máy HPLC (ml) - Cm nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đường chuẩn (ng/ml) - m: Khối lượns mẫu phân tích (g) -X: hàm lượng Vitamin A, E mẫu thử (mg/100g) ... tài Nghiên cứu xây dựng quy trìn h xác định đồng thòi hai vitamin A E s a HPLC với hai mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời vitamin A E s a bột - ứ n g dụng quy trình xây dựng. .. pháp xác định đồng thời hai vitamin A E HPLC: * Khả xác định đồng thời hai vitamin A E: Trong nghiên cứu sần đây, tác giả M Kuhn, s Nakib xác định đồng thời hai vitamin A vitamin E thực phẩm Quy. .. YỚi vitamin E) [20] * ứng dụng HPLC xác định đồng thời hai vitamin A E: Vitamin A vitamin E thuộc nhóm vitamin tan dầu (fat soluble vitamins - FSV) Chúng rat phân cực, độ phân cực hai vitamin