BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ TẾ BÀO Võ Hồng Sơn, Nguyễn Đoàn Nam Sơn, Lê Văn Sinl, Châu Mỹ Nga GVHD: Võ Thanh Phúc Trường Đại Học Bách Khoa – ĐHQG TP HCM ABSTRACT Từ khoá: Sinningia speciose, Chrysanthemum sp , Lilium sp , Artemisia dracunculus, nuôi cấy mô, tạo chồi bất định, PLB, tạo sẹo, nhân chồi bên GIỚI THIỆU Nuôi cấy mô tế bào thực vật phương pháp nhân giống trồng thu nhận hợp chất thứ cấp nhanh hiệu điều kiện in vitro dựa sở tính tồn tế bào sử dụng rộng rãi khắp nước giới Trong mơn học thí nghiệm cơng nghệ tế bào mơn Cơng nghệ sinh học – Khoa Kỹ thuật Hố học - Đại học Bách Khoa Tp HCM, làm thí nghiệm đối tượng thực vật: Tử la lan, Cúc, Ly ly Ngải giấm Tử la lan (Sinningia speciosa) hay gọi hoa chng loại có dạng thân củ, thân thấp (12-15 cm), hình thn oval, hoa hình chng to, khoe sắc có nhiều hoa to nở lúc Tử la lan xem lồi trồng năm, sau nở hoa khoảng 6-8 tuần, hoa tàn đi, rơi vào trạng thái ngủ, sau khoảng thời gian tiếp tục hồi sinh hoa Cúc (Chrysanthemum sp.) loại hoa trọng làm cảnh lâu đời quan trọng giới Hoa cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc Nhật Bản Ở Việt Nam, hoa cúc du nhập vào kỉ XV, người Việt Nam coi hoa cúc biểu tượng cao Hoa cúc không ưa chuộng màu sắc hình dáng mà đặc tính bền lâu loại hoa khác Ly ly (Lilium sp.) loại có hoa thân vẩy, rễ gốc to sinh trưởng khỏe quan chủ yếu hút nước chất dinh dưỡng chủ yếu, tuổi thọ tới năm Hoa ly ly có hình loa kèn, nhiều màu tuỳ loài, Hoa bày bán rộng rãi khắp cửa hang hoa giới vẻ đẹp ý nghĩa Ngải giấm (Artemisia dracunculus) hay gọi Tarragon loại thân thảo thuộc họ Cúc sống nhiều năm, cao 90 cm; thân mọc thẳng đứng, mảnh, phân nhánh Lá không cuống, nhẵn, ngun hay có răng, hình giáo dài 3–8 cm, rộng 2-4mm Cụm hoa đầu nách lá, cuống dài đến 1,5 cm, mảnh; bao chung cao 2mm; bắc dày, hoa hình ống màu lục hay trắng, có lông Quả bế nhẵn, dài 0,6mm Cây ưa đất tốt, khơng ẩm ướt chịu sang Cây có nhiều công dụng y học trừ giun, khai vị, lợi tiểu, trị sung viêm,… ẩm thực thí Ngải giấm bốn loại gia vị thảo mộc ẩm thực Pháp, dùng làm gia vị có mùi thơm đặc trưng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Các mẫu thực vật cung cấp phòng thí nghiệm Cơng nghê sinh học - Đại học Bách Khoa Đại học quốc gia Tp HCM Thân, cuống 30 ngày tuổi sử dụng làm nguyên liệu tạo chồi trực tiếp tử la lan Các mẫu thân, lá, cuống để tạo sẹo cúc; lá, vảy để tạo PLB ly ly thân, để nhân chồi bên ngải giấm nuôi cấy 30 ngày để làm nguyên liệu cho thí nghiệm Phương pháp Tạo chồi bất định tử la lan - - Môi trường tạo chồi mơi trường MS có bổ sung Meso inositol 100 mg/l; sucrose 30 g/l; agar 5.5 g/l; BA 2.5 mg/l; NAA 0.1 mg/l Điều kiện nuôi cấy: Mẫu cấy trì nhiệt độ 25 ± oC , độ ẩm 70%, điều kiện sáng 4000 lux, 12h/ngày Mẫu cấy theo dõi tuần với tiêu theo dõi : Tỉ lệ mẫu cấy thân, lá, cuống tạo chồi sau 2,3,4 tuần nuôi cấy Số lượng chồi/mẫu cấy sau 2,3,4 tuần nuôi cấy Hình thái chồi (chiều cao, màu sắc, số lượng lá) sau tuần nuôi cấy Các bước tiến hành cấy (thực tủ cấy vô trùng): Dùng kẹp vô trùng (khử trùng cách cho đầu kẹp vào giếng khử trùng phút trước đó) gắp từ ống nghiệm chứa mẫu cho vào đĩa petri (vô trùng cách hơ vành đĩa qua đèn cồn trước đó) Dùng dao cấy vơ trùng (khử trùng tương tự kẹp gắp) cắt thành mẫu sau: đoạn thân, đoạn khoảng 5-7mm (không mang chồi nách) cho vào ống nghiệm chứa môi trường; đoạn cuống ( không lấy phần chồi nách ), mẫu cho vào ống nghiệm chứa mơi trường; mẫu (có thể cắt đôi lớn thành mẫu nhỏ), mẫu cho vào ống nghiệm chứa môi trường Đem mẫu nuôi cấy điều kiện theo dõi tiêu tuần nuôi Tạo sẹo cúc : - - Mơi trường tạo sẹo mơi trường MS có bổ sung Meso inositol 100 mg/l; sucrose 30 g/l; agar 5.5 g/l; BA mg/l; 2,4-D mg/l Điều kiện nuôi cấy: Mẫu cấy trì nhiệt độ 25 ± oC , độ ẩm 70%, điều kiện sáng 4000 lux, 12h/ngày Mẫu cấy theo dõi tuần với tiêu theo dõi : Tỉ lệ mẫu thân, lá, cuống tạo sẹo sau 1,2,3 tuần ni cấy Hình thái mơ sẹo sau 1,2,3 tuần nuôi cấy Trọng lượng tươi mô sẹo sau tuần nuôi cấy Các bước tiến hành cấy: Dùng kẹp vô trùng (khử trùng cách cho đầu kẹp vào giếng khử trùng phút trước đó) gắp từ ống nghiệm chứa mẫu cho vào đĩa petri (vô trùng cách hơ vành đĩa qua đèn cồn trước đó) Nếu dài dùng kéo vô trùng (khử trùng tương tự kẹp gắp) cắt thành đoạn nhỏ kéo Tiếp tục dung kéo vô trùng cắt thành mẫu sau: đoạn thân, đoạn khoảng 5-6mm (không mang chồi nách) cho vào ống nghiệm chứa môi trường; đoạn cuống ( không lấy phần chồi nách ), mẫu cho vào ống nghiệm chứa môi trường; mẫu (có thể cắt đơi lớn thành mẫu nhỏ), mẫu cho vào ống nghiệm chứa môi trường Đem mẫu nuôi với điều kiện theo dõi tiêu tuần nuôi Tạo PLB ly ly : - - Môi trường tạo PLB môi trường MS có bổ sung Meso inositol 100 mg/l; sucrose 30 g/l; agar 5.5 g/l; BA 0.5 mg/l; NAA 0.5 mg/l Điều kiện ni cấy: Mẫu cấy trì nhiệt độ 25 ± oC , độ ẩm 70%, điều kiện sáng 4000 lux, 12h/ngày Mẫu cấy theo dõi tuần với tiêu theo dõi : Tỉ lệ mẫu cấy vảy tạo PLB sau 1,2,3 tuần nuôi cấy Trọng lượng tươi mày sắc PLB sau tuần nuôi cấy Các bước tiến hành cấy: Dùng kẹp vô trùng (khử trùng cách cho đầu kẹp vào giếng khử trùng phút trước đó) gắp từ ống nghiệm chứa mẫu cho vào đĩa petri (vô trùng cách hơ vành đĩa qua đèn cồn trước đó) Dùng dao cấy vô trùng (khử trùng tương tự kẹp gắp) cắt thành mẫu sau: mẫu vảy (mỗi vảy cắt đơi dược mẫu), mẫu cho vào ống nghiệm chứa môi trường; mẫu lá, mẫu dài khoảng 5-6 mm, mẫu cho vào ống nghiệm chứa môi trường Đem mẫu nuôi điều kiện theo dõi mẫu tuần Nhân chồi bên ngải giấm: - - Môi trường tạo chồi môi trường MS có bổ sung Meso inositol 100 mg/l; sucrose 30 g/l; agar 5.5 g/l; BA 0.1 mg/l Điều kiện nuôi cấy: Mẫu cấy trì nhiệt độ 25 ± oC , độ ẩm 70%, điều kiện sáng 4000 lux, 12h/ngày Mẫu cấy theo dõi tuần với tiêu theo dõi : Tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi sau 1,2 tuần nuôi cấy Số lượng chồi/mẫu cấy sau 1,2 tuần nuôi cấy Hình thái chồi/cây (chiều cao, màu sắc, số đốt thân, số lượng lá, chiều dài lá) sau tuần nuôi cấy Các bước tiến hành cấy : Dùng kẹp vô trùng (khử trùng cách cho đầu kẹp vào giếng khử trùng phút trước đó) gắp từ ống nghiệm chứa mẫu cho vào đĩa petri (vô trùng cách hơ vành đĩa qua đèn cồn trước đó) Nếu dài dùng kéo vô trùng (khử trùng tương tự kẹp gắp) cắt thành đoạn nhỏ kéo Tiếp tục dùng kéo cắt đoạn thân khoảng 1-1.5 cm mang chồi nách đoạn mang chồi ngọn, đoạn cắm vào ống nghiệm theo chiều thẳng đứng cho nách nằm ngồi mơi trường ( cấy mẫu thân ) Đem mẫu nuôi điều kiện theo dõi tiêu tuần nuôi cấy KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo chồi bất định tử la lan Với nồng độ chất điều hoà sinh trưởng auxin (BA) : cytokinin (NAA) = 25 >> khả tạo chồi bất định mẫu tử la lan cao Tuy nhiên kết thu sau tuần nuôi cấy tất mẫu 100% tạo sẹo Một số mẫu chuyển sang màu vàng thiếu sức sống Nguyên nhân q trình cấy, kẹp dao cấy q nóng làm mẫu bị thương nặng, khả phục hồi tái sinh kém, chậm Mặt khác, thời gian tuần chưa đủ để mẫu tạo chồi từ mơ sẹo hình thành Hình: Mẫu ngả vàng sau tuần ni cấy Hình: Mơ sẹo mẫu theo thứ tự mẫu lá, mẫu cuống mẫu thân Tổng kết với kết nhóm, ta có tỉ lệ tạo chồi sau: mẫu thân 37,5% với chồi/mẫu; mẫu 18,75% với 1,5 chồi/mẫu; mẫu cuống 6,25% tạo chồi với chồi/mẫu  ... nách) cho vào ống nghiệm chứa môi trường; đoạn cuống ( không lấy phần chồi nách ), mẫu cho vào ống nghiệm chứa mơi trường; mẫu (có thể cắt đôi lớn thành mẫu nhỏ), mẫu cho vào ống nghiệm chứa môi... nách) cho vào ống nghiệm chứa môi trường; đoạn cuống ( không lấy phần chồi nách ), mẫu cho vào ống nghiệm chứa môi trường; mẫu (có thể cắt đơi lớn thành mẫu nhỏ), mẫu cho vào ống nghiệm chứa môi... vảy để tạo PLB ly ly thân, để nhân chồi bên ngải giấm nuôi cấy 30 ngày để làm nguyên liệu cho thí nghiệm Phương pháp Tạo chồi bất định tử la lan - - Môi trường tạo chồi mơi trường MS có bổ sung