BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - PHẠM NGỌC LÂM PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - PHẠM NGỌC LÂM PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHÍ QUYẾT TIẾN PGS.TS VŨ THU TRANG Hà Nội - Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Học viên: Phạm Ngọc Lâm Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn : TS Phí Quyết Tiến PGS.TS Vũ Thu Trang Tên luận văn: ―Phân lập xác định số đặc điểm sinh học xạ khuẩn nội sinh Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)‖ Nội dung cam đoan: Tơi xin cam đoan, suốt q trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, hướng dẫn bảo tận tình giáo viên hướng dẫn, tơi tiến hành nghiên cứu luận văn cách trung thực, toàn nội dung báo cáo luận văn trực tiếp thực Tất nghiên cứu không chép từ báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách tác giả Học viên Phạm Ngọc Lâm I LỜI CẢM ƠN Đối với học viên cao học, luận văn tốt nghiệp cơng trình khoa học nhỏ mang ý nghĩa lớn, đánh dấu bước trưởng thành người đường ứng dụng kiến thức học vào thực tiễn Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến, Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam PSG.TS Vũ Thu Trang, Phó trưởng Khoa Công nghệ thực phẩm, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức q báu để giúp tơi hồn thành luận văn Trong thời gian thực tập làm việc phòng Cơng nghệ Lên men - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, nhận quan tâm giúp đỡ, bảo tận tình chun mơn, kĩ thuật động viên chân thành tập thể cán phòng Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Cuối xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên khuyến khích tơi suốt trình học tập để đạt kết ngày hôm Hà Nội, tháng 10 năm 2017 Học viên Phạm Ngọc Lâm II DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Các kí hiệu/ chữ viết tắt Ý nghĩa DNA Deoxyribonucleic acid FISH Fluorescent insitu hybridization IAA Indole acetic acid IC50 Inhibitory concentration 50% - Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh MIC Minimum inhibitory concentrationNồng độ ức chế tối thiểu NRP Nonribosomal peptide NRPS Nonribosomal peptide synthetase 10 PKS Polyketide synthase 11 PKS-I Polyketide synthase type I 12 PKS-II Polyketide synthase type II 13 RNA Ribonucleic acid III DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số hoạt chất tìm thấy xạ khuẩn nội sinh dược liệu .10 Bảng 1.2 Một số loài xạ khuẩn nội sinh phân lập từ dược liệu .16 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA 32 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ mẫu Màng tang Thanh Hóa, Hà Nội Phú Thọ 35 Bảng 3.2 Khả kháng vi sinh vật kiểm định số chủng xạ khuẩn 45 Bảng 3.3 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng MPT28 .51 Bảng 3.4 Màu sắc khuẩn lạc chủng MPT28 nuôi cấy môi trường 52 Bảng 3.5 Khả đồng hóa nguồn cacbon, nitơ chủng xạ khuẩn MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cấy 30°C 53 Bảng 3.6 Nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh trưởng chủng MPT28 54 Bảng 3.7 Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA xạ khuẩn MPT28 với trình tự gen tương ứng chủng xạ khuẩn đăng ký GenBank 56 IV DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Bản đồ vị trí 34 vùng có đa dạng thực vật cao việc lấy mẫu để phân lập xạ khuẩn nội sinh .15 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc chủng xạ khuẩn nội sinh môi trường ISP5 (a), SPA (b), HV (c), TA (d), STA (e), CA (f) sau tuần ni cấy 34 Hình 3.2 Sự phân bố xạ khuẩn nội sinh phận Màng tang: số liệu tổng số 03 vùng (a); số liệu thống kê theo vùng (b) 38 Hình 3.3 Sự phân bố xạ khuẩn nội sinh loại môi trường phân lập khác 39 Hình 3.4 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn nội sinh phân bố theo nhóm màu sắc khuẩn ty Thanh Hóa, Hà Nội Phú Thọ 41 Hình 3.5 Biểu đồ thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 143 chủng xạ khuẩn nội sinh 42 Hình 3.6 Khả kháng vi sinh (VSV) vật kiểm định 47 chủng xạ khuẩn nội sinh (XKNS) 43 Hình 3.7 Hoạt tính kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A) Bacillus cereus ATCC 11778 (B) số chủng xạ khuẩn nội sinh 44 Hình 3.8 Tỉ lệ chủng xạ khuẩn kháng chủng vi sinh vật kiểm định phân bố Thanh Hoá, Hà Nội Phú Thọ 47 Hình 3.9 Tỉ lệ chủng kháng vi sinh vật kiểm định phân bố theo vị trí rễ, thân, 49 Hình 3.10 Hình thái khuẩn lạc (a) mơi trường ISP1 bề mặt chuỗi bào tử (b) kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần chủng MPT28 .52 Hình 3.11 Điện di đồ DNA tổng số (a) sản phẩm PCR (b) gel agarose 1,0% .55 Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại chủng MPT28 .57 V MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .2 LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ v MỤC LỤC vi MỞ ĐẦU .1 Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Xạ khuẩn nội sinh thực vật dƣợc liệu 1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh 1.1.2 Cơ chế nội sinh xạ khuẩn thực vật 1.1.3 Ứng dụng xạ khuẩn nội sinh thực vật .4 1.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh 11 1.2.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh 11 1.2.2 Môi trường phân lập .13 1.2.3 Các nghiên cứu cải tiến hiệu phân lập 13 1.3 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh thực vật 14 1.3.1 Đa dạng thực vật - nguồn tiềm đa dạng xạ khuẩn nội sinh 14 1.3.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo phương pháp phân lập chủng loại 18 1.4 Khả sinh tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn nội sinh dƣợc liệu 21 1.4.1 Kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 22 1.4.2 Các gen tham gia vào trình tổng hợp kháng sinh hợp chất trao đổi thứ cấp 23 1.5 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh thực vật Việt Nam .24 1.6 Cây Màng tang tiềm khai thác xạ khuẩn nội sinh 25 Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1 Vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Mẫu Màng tang, chủng giống vi sinh vật .28 2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 28 VI 2.1.3 2.2 Môi trường nuôi cấy .29 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Thu thập chuẩn bị mẫu .29 2.2.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh mẫu Màng tang 29 2.2.3 Sàng lọc chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ……………………………………………………………………… 30 2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 .30 2.2.5 Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa phân tích trình tự gen 16S rRNA ……………………………………………………………………… 32 2.1.1 Phương pháp xử lý số liệu 33 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân lập đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang vùng sinh thái khác 34 3.1.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh Màng tang Thanh Hóa, Hà Nội Phú Thọ 34 3.1.2 3.2 Sự phân bố xạ khuẩn nội sinh Màng tang .37 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn nội sinh …………………………………………………………………………….42 3.2.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn phân bố theo vùng sinh thái khác 47 3.2.2 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn phân bố theo vị trí .49 3.3 Đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn MTP28 .50 3.3.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 51 3.3.2 Phân loại dựa xác định trình tự gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn MPT28 ……………………………………………………………………… 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 71 VII MỞ ĐẦU Sự xuất vi khuẩn gây bệnh kháng nhiều loại kháng sinh với lây lan rộng lớn chúng mối đe dọa nghiêm trọng thu hút mối quan tâm hàng đầu cộng đồng Sự gia tăng tác nhân gây bệnh cho thấy nhiều loại thuốc kháng sinh lỗi thời khơng hiệu Trong đó, thành cơng giải pháp thay tổng hợp hóa học hạn chế, tạo khoảng trống đường tìm loại thuốc Vì vậy, nay, nhà khoa học doanh nghiệp dược phẩm giới khơng ngừng tìm kiếm nguồn hợp chất tự nhiên khác để phát triển loại kháng sinh nhằm khắc phục tình trạng kháng thuốc Xạ khuẩn đối tượng quan tâm nghiên cứu nhiều nhà khoa học giới độ đa dạng hoạt chất sinh học chúng, đặc biệt chất kháng sinh Các loài xạ khuẩn nội sinh sống mô thực vật tạo số hợp chất thúc đẩy phát triển chủ giúp chúng tồn chủ Trong số hợp chất này, chất có hoạt tính sinh học hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét hứa hẹn nhiều tiềm ứng dụng y học Việc phân lập xạ khuẩn nội sinh sàng lọc chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hướng nghiên cứu tiềm Cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) loại dược liệu phân bố nước châu Á, có Việt Nam Chúng chứa nhiều tinh dầu mà thành phần citral, có tác dụng kháng khuẩn, kháng ung thư, chống oxy hóa Mặc dù tinh dầu Màng tang sử dụng nhiều sống đến số lượng nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh Màng tang khả kháng khuẩn chúng Việt Nam hạn chế Xuất phát từ định hướng trên, thực nghiên cứu: “Phân lập xác định số đặc điểm sinh học xạ khuẩn nội sinh Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)” CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Pham Ngoc Lam, Dang Thi Thuy Duong, Vu Thi Hanh Nguyen, Chu Ky Son, Vu Thu Trang, Phi Quyet Tien (2017) – ―Distribution and antimicrobial activity of endophytic actinomycetes isolated from Litsea cubeba (Lour.) Pers in northern provinces of Vietnam‖, Vietnam Journal of Science and Technology, 55(5A) p.160-168 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội Phan Thị Hồng Thảo, Nguyễn Vũ Mai Linh, Nguyễn Thị Hồng Liên, Nguyễn Kiều Băng Tâm, Nguyễn Văn Hiếu (2016), ―Xạ khuẩn nội sinh Streptomyces parvulus HNR3X4 bưởi Diễn Hà Nội tiềm sinh tổng hợp chất kháng khuẩn‖ Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 32(1S) tr 327-333 Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kỳ Sơn, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), ―Đánh giá sàng lọc xạ khuẩn nội cộng sinh quế có khả kháng vi sinh vật gây bệnh‖, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 12(2) tr 1-7 Trịnh Thị Trang, Kim Văn Vạn, Trương Đình Hồi, Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Ngọc Tuấn (2016), ―Phân lập đánh giá hoạt tính kháng khuẩn xạ khuẩn nội cộng sinh Màng tang (Litsea cubeba) vi khuẩn gây bệnh cá chép rô phi‖, Tạp chí KH Nơng nghiệp Việt Nam, 14(12) tr 1886-1893 Vũ Thu Trang, Nguyễn Thị Hoa (2015) ―Nghiên cứu hiệu kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus sử dụng kết hợp loại tinh dầu Việt Nam‖, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 54 (4), tr 417-424 Tiếng Anh Akshatha J.V., Prakash H.S and Nalini M.S (2016), ―Actinomycete endophytes from the ethnomedicinal plants of Southern India: antioxidant activity and characterization studies‖, J Biol Active Prod Nat, pp 150–165 Al-Askar A.A., Waleed M.A., Younes M (2014), ―Streptomyces griseorubens E44G: a potent antagonist isolated from soil in Saudi Arabia‖, J Pure Appl Microbio, 8(2) pp 221-230 60 Anil K.S and Dipak C (2013), ― Screening of fruit and leaf essential oils of Litsea cubeba Pers from North - East India - chemical composition and antimicrobial activity‖, Journal of Essential Oil Research, 25(4) pp 330 – 338 Bascom-Slack C.A., Ma C., Moore E., Babbs B, (2009), ―Multiple, novel biologically active endophytic actinomycetes isolated from upper Amazonian rainforests’, Microb Ecol, 58 pp 374– 383 10 Bérdy J (2012), ―Thoughts and facts about antibiotics: where we are now and where we are heading‖, Journal of Antibiotics, 65(8), pp 385–395 11 Castillo U., Strobel G., Ford E., Hess W., Porter H., Jensen J (2002), ―Munumbicins, wide- spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans‖, Microbiol, 148 pp 2675–2685 12 Castillo U.F., Harper J.K., Strobel G.A., Sears J., Alesi K., Ford E (2003), ―Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia‖, FEMS Microbiol Lett, 234 pp 183–190 13 Castillo U.F., Strobel G.A., Mullenberg K., Folgiano V (2006), ―Munumbicins E-4 and E-5: novel broad-spectrum antibiotics from Streptomyces NRRL 3052‖, FEMS Microbiol Lett, 255 pp 296–300 14 Conn V.M., Walker A.R (2008), ―Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana‖, Mol Plant Microbe Interact, 21 pp 208–218 15 Coombs J.T, Michelsen P.P, Franco C.M.M (2004), ―Evaluation of endophytic actinobacteria as antagonists of Gaeumannomyces graminis var tritici in wheat‖, Biol Control, 29 pp 359–366 16 Coombs J.T., Franco C.M.M (2003), ―Isolation and identification of actinobacteria from surface-sterilized wheat roots‖, Appl Environ Microbiol, 69 pp 5603–5608 17 Crawford D.L., Lynch J.M., Whipps J.M.,Ousley M.A (1993) ―Isolation and characterization of actinomycete antagonists of a fungal root pathogen‖, Appl Environ Microbiol, 59 (11), pp 3889–3905 18 Das A and Varma A (2009), ―Symbiosis: the art of living, in Symbiotic Fungi‖, Springer, pp 1-28 19 Dochhil H., Dkhar M.S., Barman D (2013), ―Seed germination enhancing activity of endophytic Streptomyces isolated from indigenous ethno-medicinal plant Centella asiatica‖, Int J Pharm Biol Sci, 4(1), pp 256–262 61 20 El-Gendy M.M.A., EL-Bondkly A.M.A (2010), ―Production and genetic improvement of a novel antimycotic agent, saadamycin, against dermatophytes and other clinical fungi from endophytic Streptomyces sp Hedaya48‖, J Ind Microbiol Biotechnol, 37(8), pp 831–841 21 El-Shatoury S., Abdulla H., El-Karaaly O., El-Kazzaz W., Dewedar A (2006), ―Bioactivities of endophytic actinomycetes from selected medicinal plants in the world heritage site of Saint Katherine‖, Egypt Int J Bot, 2(3), pp 307–312 22 El-Shatoury S., El-Kraly O., El-Kazzaz W., Dewedar A (2009), ―Antimicrobial activities of Actinomycetes inhabiting Achillea fragrantissima (Family: Compositae)‖, Egypt J Nat Toxins, 6(2), pp 1–15 23 El-Shatoury S.A., El-Kraly O.A., Trujillo M.E (2013), ―Generic and functional diversity in endophytic actinomycetes from wild Compositae plant species at South Sinai—Egypt‖, Res Microbiol, 164 pp 761–769 24 El-Tarabily K.A., Hardy G.E., Sivasithamparam K (2010), ―Performance of three endophytic actinomycetes in relation to plant growth promotion and biological control of Pythium aphanidermatum, a pathogen of cucumber under commercial field production conditions in the United Arab Emirates‖, Eur J Plant Pathol, 128 pp 527–539 25 El-Tarabily K.A., Sivasithamparam K (2006), ―Non-streptomycete actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters‖, Soil Biol Biochem, 38 pp 1505–1520 26 Ezra D., Castillo U.F., Strobel G.A., Hess W.M (2004), ―Coronamycins, peptide antibiotics produced by a verticillate Streptomyces sp (MSU-2110) endophytic on Monstera sp‖, Microbiology, 150 pp 785–793 27 Finking R and M.A (2004), ―Marahiel, Biosynthesis of nonribosomal peptides 1‖, Annu Rev Microbiol, 58 pp 453-488 28 Gaiero J.R., McCall C.A (2013), ―Inside the root microbiome: bacterial root endophytes and plant growth promotion‖, Am J Bot, 100 pp 1738–1750 29 Gangwar M., Dogra S., Gupta U.P., Kharwar R.N (2014), ―Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India‖, African J Microbiol Res, 8(2), pp 184–191 30 Garrity G.M and Holt J.G (2001), ―The road map to the manual, in Bergey’s Manual® of Systematic Bacteriology‖, Springer, pp 119-166 62 31 Gauze G., Preobrazhenskaya T (1983), ―Opredelitel’aktinomitsetov (Manual on Determination of Actinomycetes)‖, Moscow 32 Gayathri P and Muralikrishnan V (2013), ―Isolation and characterization of endophytic actinomycetes from mangrove plant for antimicrobial activity‖, Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci, 2(11), pp 78-89 33 Gontang E.A., Gaudencio S.P., Fenical W., Jense P.R (2010), ―Sequence-based analysis of secondary-metabolite biosynthesis in marine actinobacteria‖, Appl Environ Microbiol, 76(8), pp 2487 – 2499 34 Goodfellow M., Kampfer P., Busse H.J (2012), ―Bergey’s manual of systematic bacteriology, 2nd edn, vol The Actinobacteria, Part A‖, Springer, New York 35 Hadacek F and Greger H (2000), ―Testing of antifungal natural products: Methodologies, comparability of results and assay choice‖, Phytochem.Anal, 11(3), pp 137-147 36 Hallmann J., Berg G., Schulz B (2006), ―Isolation procedures for endophytic microorganisms, In: Schulz B, Boyle C, Sieber TN (eds) Soil biology, Microbial Root EndophytesSpringer-Verlag‖, Berlin Heidelberg, pp 299–319 37 Hamaki T., Suzuki M., Fudou R (2005), ―Isolation of novel bacteria and actinomycetes using soil-extract agar medium‖, J Biosci Bioeng, 99 p 485–492 38 Hamed, A., Ahmed S., Abdel-Razek M F (2017), ―New oxaphenalene derivative from marine-derived Streptomyces griseorubens sp ASMR4‖, Zeitschrift für Naturforschung B, 72(1), pp 53-62 39 Hayakawa M., Nonomura H (1987), ―Efficacy of artificial humic acid is a selective nutrient in HV agar used for the isolation of actinomycetes‖, J Ferment Technol, 65 pp 609–616 40 Ho C., Jie-Pinge O., Liu Y., Hung C., Tsai M., Liao P., Wang E., Chen Y and Su Y (2010), ―Compositions and in vitro anticancer activities of the leaf and fruit oils of Litsea cubeba from Taiwan‖, Nat Prod Commun, pp 617–620 41 Igarashi Y (2004) ―Screening of novel bioactive compounds from plantassociated actinomycetes‖, Actinomycetolog, 18 pp 63–66 42 Igarashi Y., Iida T., Sasaki T., Saito N., Yoshida R., Furumai T (2002), ―Isolation of actinomycetes from live plants and evaluation of antiphytopathogenic activity of their metabolites‖, Actinomycetolog, 16 pp 9–13 63 43 Igarashi Y., Ogura H., Furihata K., Oku N., Indananda C and Thamchaipenet A (2011), ―Maklamicin, an antibacterial polyketide from an endophytic Micromonospora sp.”, J Nat Prod, 74(4) pp 670-674 44 Ikeda S., Kaneko T., Okubo T., Rallos L.E., Eda S (2009), ―Development of a bacterial cell enrichment method and its application to the community analysis in soybean stems‖, Microb Ecol, 58 pp 703–714 45 Janso J.E and Carter G.T (2010), ―Biosynthetic potential of phylogenetically unique endophytic actinomycetes from tropical plants‖, Appl Environ Microbiol, 76 pp 4377–4386 46 Kaewkla O and Christopher M M F (2013), ―Rational approaches to improving the isolation of endophytic actinobacteria from Australian native trees‖, Microb Ecol, 65 pp 384-393 47 Kavita T and Gupta R.K (2012), ―Diversity and isolation of rare actinomycetes: an overview‖, Crit Rev Microbiol, 39(3), pp 256-294 48 Keswani J., Whitman W.B (2001), ―Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes‖, Int J Syst Evol Microbiol, 51(2), pp 667-78 49 Kizuka M., Enokita R., Okazaki T (1998), ―Studies on actinomycetes isolated from plant leaves‖, Actinomycetologica, 12, pp 89–91 50 Kumar S., Stecher G., and Tamura K (2016) ―MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets‖, Molecular Biology and Evolution, 33 pp 1870-1874 51 Kuster E., Williams S.T (1964), ―Selection ofmedia for isolation of Streptomycetes‖, Nature, 202 pp 928–929 52 Le C.S, Do N D., Tran D T, Duong D H., Isiaka A O (2014), ―Analysis of the essential oils from five Vietnamese Litsea species (Lauraceae)‖, Journal of Essential Oil Bearing Plants, 17(5), pp 960-971 53 Lee S.O., Choi G.J., Choi Y.H (2008), ―Isolation and characterization of endophytic actinomycetes from Chinese cabbage roots as antagonists to Plasmodiophora brassicae‖, J Microbiol Biotechnol, 18 pp 1741–1746 54 Li J., Zhao G.Z., Chen H.H., Wang H.B., Jiang C L and Li W J (2008), ―Antitumour and antimicrobial activities of endophytic Streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest‖, Lett Appl Microbiol, 47 pp 574-580 64 55 Li J., Zhao G.Z., Xu L H., Zhang S., Li W.J and Strobel G (2012), ―Isolation and characterization of culturable endophytic actinobacteria associated with Artemisia annua L.‖, Antonie van Leeuwenhoek, 101 pp 515-527 56 Li W.R., Shi Q.S., Liang Q., Xie X.B., Huang X.M., Chen Y.B (2014), ―Antibacterial activity and kinetics of Litsea cubeba oil on Escherichia coli‖, PLOS one, 9(11), pp – 57 Loria R., Bukhalid R.A., Fry B.A., King R.R (1997, ―Plant pathogenecity in the genus Streptomyces‖, Plant Dis, 81 pp 836-846 58 Lu C., Shen Y (2007), ―A novel ansamycin, naphthomycin k from Streptomyces sp.‖, J Antibiot, 60(10), pp 649–653 59 Ludwig W., Klenk H.P (2005) ―Overview: a phylogenetic backbone and taxonomic framework for prokaryotic systematics In: Brenner DJ, Krieg NR, Staley JT, Garrity GM (eds) Bergey’s manual of systematic bacteriology, 2nd edn, the Proteobacteria, part A, Springer, New York‖, pp 49–65 60 Machavariani N.G., Ivankova T.D., Sineva O.N., Terekhova L.P (2014), ―Isolation of endophytic actinomycetes from medicinal plants of the Moscow region, Russia‖, World Appl Sci J, 30(11), pp 1599–1604 61 Madhurama G., Sonam D., Urmil P.G., Ravindra N.K (2014), ―Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India‖, Afr J Microbiol Res., 8(2), pp 184 – 191 62 Mahera M.S., Sulaiman A.A., Ismet A., Milton W (2013), ―Evaluation of antibiotic producing genes in Streptomyces isolated from a desert environment of Saudi Arabia‖, Life Sci J., 10(4), pp 974 – 980 63 Matsunaga S and Fusetani N (2003), ―Nonribosomal peptides from marine sponges‖, Current Organic Chemistry, 7(10) pp 945-966 64 Mincer T.J., Jensen P.R., Kauffman C.A., Fenical W (2002), ―Widespread and persistent populations of a major new marine actinomycete taxon in ocean sediments‖, Appl Environ Microbiol, 68 pp 5005–5011 65 Myers N., Mittermeier R.A., Mittermeier C.G (2000), ―Biodiversity hotspots for conservation priorities‖, Nature, 403 pp 453–458 66 Nalini M.S and Prakash H.S (2017), ―Review article: Diversity and bioprospecting of actinomycete endophytes from the medicinal plants‖, Lett Appl Microbiol, 64 pp 261–270 65 67 Nina G.M., Tatyana D.I., Olga N.S and Larissa P.T (2014), ―Isolation of endophytic actinomycetes from medicinal plants of the Moscow region, Russia‖, World Appl Sci J, 30(11), pp 1599-1604 68 Okazaki T (2003), ―Studies on actinomycetes isolated from plant leaves, In: Kurtböke (ed.) Selective isolation of rare actinomycetes, Queensland Complete Printing Service‖, Nambour, pp 102-122 69 Otto M (2009), ―Staphylococcus epidermidis—the 'accidental' pathogen‖, Nature Reviews Microbiology, 7(8), pp 555-567 70 Passari A.K., Mishra V.K., Saikia R., Gupta V.K and Singh B.P (2015), ―Isolation, abundance and phylogenetic affiliation of endophytic actinomycetes associated with medicinal plants and screening for their in vitro antimicrobial biosynthetic potential‖, Front Microbiol, pp 273 71 Patrycja G., Magdalena W., Gauravi A., Dnyaneshwar R., Hanna D., Mahendra R (2015), ―Endophytic actinobacteria of medicinal plants: diversity and bioactivity‖, Antonie van Leeuwenhoek, 108 pp 267–289 72 Phuakjaiphaeo C and Kunasakdakul K (2015), ―Isolation and screening for inhibitory activity on alternaria brassicicola of endophytic actinomycetes from Centella asiatica (L.) Urban‖, J Agri Technol, 11(4), pp 903-912 73 Priham T.G and Tenser H.D (1974), ―Streptomyces Waksman and first and second studies‖, Int J Syst Bacteriol, 18 pp 279 74 Pullen C., Schmitz P., Meurer K., Bamberg D.D., Lohmann S (2002), ―New and bioactive compounds from Streptomyces strains residing in the wood of Celastraceae‖, Planta, 216 pp 162–167 75 Qin S., Li J., Chen H.H and Zhu W.Y (2009), ―Isolation, diversity and antimicrobial activity of rare actinobacteria from medicinal plants of tropical rain forests in Xishuangbanna‖, China.Appl.Environ.Microbiol, 75 pp 6176–6186 76 Qin S., Xing K., Jiang J.H., Xu L.H., Li W.J (2011), ―Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria‖, Appl Microbiol Biotechnol, 89 pp 457-473 66 77 Qin S., Yuan B., Zhang Y.J., Bian G.K., and Jiang, J.H (2012a), ―Nocardioides panzhihuaensis sp nov., a novel endophytic actinomycete isolated from medicinal plant Jatropha curcas L.‖, Ant van Leeuw, 102 pp 353–360 78 Quadt-Hallmann A., Benhamou N., Kloepper J.W (1997), ―Bacterial endophytes in cotton: mechanisms of entering the plant‖, Can J Microbiol, 43 pp 577-582 79 Saini P., Gangwar M., Kalia A., Singh N and Narang D (2016), ―Isolation of endophytic actinomycetes from Syzygium cumini and their antimicrobial activity against human pathogens‖, J Appl Nat Sci, 8(1) pp 416 – 422 80 Salam N., Thi-Nhan Khieu., Min-Jiao Liu., Thu-Trang Vu., Son Chu-Ky., Ngoc-Tung Quach., Quyet-Tien Phi., Manik Prabhu Narsing Rao., Angélique Fontana., Samira Sarter., and Wen-Jun Li (2017), ―Endophytic Actinobacteria Associated with Dracaena cochinchinensis Lour.: Isolation, Diversity, and Their Cytotoxic Activities‖, Biomed Res Int, ID 1308563, 11 pages 81 Saritha M., Arora A., Singh S., Nain L (2013), ―Streptomyces griseorubens mediated delignification of paddy straw for improved enzymatic saccharification yields‖, Bioresour Technol,135 pp 12-7 82 Schulz B., Boyle C (2006), ―Microbial root endophytes In: SieberTN (ed) What are endophytes?‖, Springer, Berlin, pp 1–13 83 Schwarzer D., Finking R., and Marahiel M.A (2003), ―Nonribosomal peptides: from genes to products‖, Natural product reports, 20(3), pp 275-287 84 Shimizu M., Suzuki T., Mogami O., Kunoh H (2005), ―Disease resistance of plants induced by endophytic actinomycetes In: Tsuyumu S, Leach JE, Shiraishi T, Wolpert T (eds) Genomic and genetic analysis of plant parasitism and defense APS‖, St Paul, pp 292–293 85 Shirling E.B and Gottlieb D (1966), ―Methods for characterization of Streptomyces species, Int J Syst Bacteriol, 16 pp 313–340 86 Shutsrirung A., Chromkaew Y., Pathom-Aree W., Choonluchanon S., Boonkerd N (2014), ―Diversity of endophytic actinomycetes in mandarin grown in northern Thailand, their phytohormone production potential and plant growth promoting activity‖, Soil Sci Plant Nutr, 59(3) pp 322–330 67 87 Si L., Chen Y., Han X., Zhan Z., Tian S., Cui Q., Wang Y (2012), “Chemical composition of essential oils of Litsea cubeba harvested from its distribution areas in China‖, Molecules, 17(6), pp 7057-7066 88 Sri P., Yulin L., Antonius S., Sri B., Latifah K.D (2012), ―Alpha-glucosidase inhibitor activity and characterization of endophytic actinomycetes isolated from some Indonesian diabetic medicinal plants, IJPSR, 4(1), pp 327-334 89 Strobel G., Daisy B., Castillo U., Harper J (2004), ―Natural products from endophytic microorganisms‖, J Nat Prod, 67 pp 257–268 90 Strobel G.A and Daisy B (2003), ―Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products‖, Microbiol Mol Biol Rev, 67 pp 491–502 91 Surang C., Suphatra H., Akkaraphol S., Pattra C., Watanalai P (2013), ―Endophytic Actinomycetes: A novel source of potential acyl homoserine lactone degrading enzymes‖, Bio Med Res Int, Article ID 782847 92 Taechowisan T., Lu C., Shen Y., Lumyong S (2007), ―Antitumor activity of 4arylcoumarins from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130‖, J Cancer Res Ther, 3(2), pp 86–91 93 Taechowisan T., Peberdy J.F and Lumyong S (2003), ―Isolation of endophytic actinomycetes from selected plants and their antifungal activity‖, World J Microbiol Biotechnol, 19 pp 381–385 94 Taechowisan T., Wanbanjob A., Tuntiwachwuttikul P., Taylor W.C (2006), ―Identification of Streptomyces sp Tc022, an endophyte in Alpinia galanga, and the isolation of actinomycin D‖, Ann Microbiol, 56(2), pp 113–117 95 Takahashi Y., Omura S (2003), ―Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compounds‖, J Gen Appl Microbiol, 49 pp 141–154 96 Tanvir R., Sajid I., Hasnain S (2014), ―Larvicidal potential of Asteraceae family endophytic actinomycetes against Culex quinquefasciatus mosquito larvae‖, Nat Prod Res, 28(22) pp 2048–2052 97 Nhan K.T, Min-Jiao L., Salam N., Ngoc-Tung Q., Son C.K., Quyet-Tien P., Thu-Trang V., Tien-Dat N., Zhi X., Deene M.P., and Li W.J (2015), ―Characterization and evaluation of antimicrobial and cytotoxic effects of Streptomyces sp HUST012 isolated from medicinal plant Dracaena cochinchinensis Lour, Front Microbiol, pp 574 68 98 Tresner H and Danga F (1958), ―Hydrogen sulfide production by Streptomyces as a criterion for species differentiation‖, Journal of bacteriology, 76(3), pp 239 99 Van N.H., Caruso D., Lebrun M., Nguyen N.T., Trinh T.T., Meile J.C., Son C.K., Sarter S (2016) ―Antibacterial activity of Litsea cubeba (Lauraceae, May Chang) and its effects on the biological response of common carp Cyprinus carpio challenged with Aeromonas hydrophila‖, J Appl Microbiol, 121(2), pp 341-51 100 Verma V.C., Gond S.K., Kumar A and Gange A.C (2009), ―Endophytic actinomycetes from Azadirachta indica A Juss.: isolation, diversity, and antimicrobial activity‖, Microb Ecol., 57 pp 749–756 101 Waheeda K., Shyam K.V (2017), ―Formulation of novel surface sterilization method and culture media for the isolation of endophytic actinomycetes from medicinal plants and its antibacterial activity‖, J Plant Pathol Microbiol, pp 399 102 Wang H and Liu Y (2010), ―Chemical composition and antibacterial activity of essential oils from different parts of Litsea cubeba‖, Chem Biodivers, pp 229 - 35 103 Watt M., Hugenholtz P., White R (2006), ―Numbers and locations of native bacteria on field‐ grown wheat roots quantified by fluorescence in situ hybridization (FISH)‖, Environmental Microbiology, 8(5) pp 871-884 104 WHO (2017) ―Publishes list of bacteria for which new antibiotics are urgently needed‖ http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/bacteria-antibioticsneeded/en/ 105 Williams S (1989), ―Genus Streptomyces waksman and henrici 1943‖, BERGEY's Manual of Syntematic Bacteriology, pp 2452-2492 106 Zhang J., Wang J.D., Liu C.X., Yuan J.H., Wang X.J., Xiang W.S (2014), ―A new prenylated indole derivative from endophytic actinobacteria Streptomyces sp neau-D50‖, Nat Prod Res, 28(7) pp 431–437 107 Zhang W, Hu J.F., Zhao Q.C., Shi G.B (2012a), ―Antibacterial, antifungal and cytotoxic isoquinoline alkaloids from Litsea cubeba‖, Molecules, 17, pp 12950 – 12960 108 Yang T.S., Liou M.L., Hu T.F., Peng C.W., Liu T.T (2013), ―Antimicrobial activity of the essential oil of Litsea cubeba on cariogenic bacteria‖, The Journal of Essential Oil Research, 25 (2), pp 120-128 109 Zhao K., Penttinen P., Guan T., Xiao J., Chen Q., Xu J., Lindstro K., Zhang L., Zhang X., Strobel G.A (2011), ―The Diversity and Anti-Microbial Activity of 69 endophytic actinomycetes Isolated from Medicinal Plants in Panxi Plateau, China‖, Curr Microbiol, 62 pp 182–190 110 Zin N.M., Sarmin N.I.M., Ghadin N., Basri D.F., Sidik N.M., Hess W.M and Strobel G.A (2007), ―Bioactive endophytic streptomycetes from the Malay Peninsula‖, FEMS Microbiol Lett, 274 pp 83–88 70 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi cấy - Môi trường TWYE (g/L): Cao thịt 0,25; K2HP04 0,5; agar 15,0; H2O 1000mL; pH 7,2 - Môi trường STA (g/L): Tinh bột 15,0; K2HP04 0,5; MgSO4.7H2O 0,05; FeSO4.7H2O 0,01; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trường HV (g/L): Humic acid 8,0; Na2HPO4 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; CaCO3 0,02; NaNO2 0,9; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trường TA (g/L): Trehalose 18,0; CaCl2 0,3; Na2HPO4 0,3; CaCO3 0,02; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trường SA (g/L): Sodium succinate 15,0; K2HPO4 0,6; FeSO4.7H2O 0,001; CaCl2.2H2O 0,2; KCl 0,3; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trường CA (g/L): Citrate acid 12,0; K2HPO4.3H2O 0,4; CaCl2.H2O 0,05; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trường SPA (g/L): peptone 12,0; K2HPO4 1,0; MgSO4.7H2O 0,1; agar 15,0; H2O 1000 mL, pH 7,2 - Môi trường LBA (Luria-Bertani) (g/L): Cao nấm men 5,0; Tryptone 10,0; NaCl 10,0; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH= 6,5-7,0 - Môi trường ISP1 (g/l): Tryptone 5,0, cao nấm men 3,0; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7,0 - Môi trường ISP2 (g/L): cao nấm men 3,0; cao malt 10,0; dextrose 4,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2 - Môi trường ISP3 (g/L): Bột kiều mạch 20,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH-7,2 - Môi trường ISP4 (g/l): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1,0; MgSO4.7H2O 1,0; NaCl 1,0; (NH4)2SO4 2,0; CaCO3 2,0; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2 - Môi trường ISP5 (g/l): L-Asparagin monohydrate 1,0; glycerol 10,0; K2HPO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 7,0-7,4 - Môi trường ISP6 (g/L): Peptone 10,0; cao nấm men 1,0; xitrat sắt 0,5; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2 71 - Môi trường ISP7 (g/L): Glycerol 15,0; L-tyrosine 0,5; L-Asparagin monohydrate 1,0; FeSO4.7H2O 0,01; K2HPO4 0,5; MgSO4 7H2O 0,5; Nacl 0,5; agar 20; H2O 1000 mL; pH 7,2-7,4 - Môi trường ISP9 (g/L): (NH4)2SO4 2,64; KH2PO4 2,38; K2HPO4 5,65; MgSO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 6,8-7,0 Môi trường YIM38 (g/L): Cao Malt 4,0; cao nấm men 4,0; glucose 4,0; vi lượng ml; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,0 - Phụ lục 2: Trình tự 16S rDNA chủng MPT28 GTAACATGTG ACGCAATCTG CCCTGCAATC TGGGACAAGC CCTGGAAACG GGGTCTAATA 61 CCGGATACTG ACCCGCTTGG GCATCCAAGC GGTTCGAAAG CTCCGGCGGT GCAGGATGAG 121 CCCGCGGCCT ATCAGCTTGT TGGTGAGGTA ATGGCTCACC AAGGCGACGA CGGGTAGCCG 181 GCCTGAGAGG GCGACCGGCC ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC 241 AGCAGTGGGG AATATTGCAC AATGGGCGAA AGCCTGATGC AGCGACGCCG CGTGAGGGAT 301 GACGGCCTTC GGGTTGTAAA CCTCTTTCAG CAGGGAAGAA GCGAAAGTGA CGGTACCTGC 361 AGAAGAAGCG CCGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG CGCGAGCGTT 421 GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGAGCTCGT AGGCGGCTTG TCACGTCGGT TGTGAAAGCC 481 CGGGGCTTAA CCCCGGGTCT GCAGTCGATA CGGGCAGGCT AGAGTTCGGT AGGGGAGATC 541 GGAATTCCTG GTGTAGCGGT GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC 601 GGATCTCTGG GCCGATACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA 661 TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGGTGG GCACTAGGTG TGGGCGACAT TCCACGTCGT 721 CCGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGTGCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC 781 TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GTGGCTTAAT TCGACGCAAC 841 GCGAAGAACC TTACCAAGGC TTGACATACA CCGGAAAGCA TCAGAGATGG TGCCCCCCTT 901 GTGGTCGGTG TACAGGTGGT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA 961 AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTGTCCCG TGTTGCCAGC AGGCCCTTGT GGTGCTGGGG 1021 ACTCACGGGA GACCGCCGGG GTCAACTCTG AAGAAGGTGG GGACGACGTC AAGTCATCAT 1081 GCCCCTTATG CCTTGGGTTG CACACTTGCT ACAATGGTCC GTTACAATGA GCTGCGATAC 1141 CGCCAGGGGG GACCGAATCT CAAAAAGCCG GTCTCAAGTC CGAATTGGG // 72 73 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - PHẠM NGỌC LÂM PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour. ) Pers .). .. xạ khuẩn nội sinh Màng tang khả kháng khuẩn chúng Việt Nam hạn chế Xuất phát từ định hướng trên, thực nghiên cứu: Phân lập xác định số đặc điểm sinh học xạ khuẩn nội sinh Màng tang (Litsea cubeba. .. 3.1 Phân lập đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang vùng sinh thái khác 34 3.1.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh Màng tang Thanh Hóa, Hà Nội Phú Thọ 34 3.1.2 3.2 Sự phân bố xạ khuẩn