BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y ***************** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH TỪ MỘT SỐ VI KHUẨN TRONG MÔI TRƯỜNG Sinh viên thực : LÂM THỊ ÁI LINH Lớp : DH05DY Ngành : Thú Y Niên khóa : 2005 – 2010 Tháng 08/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y ***************** LÂM THỊ ÁI LINH BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH TỪ MỘT SỐ VI KHUẨN TRONG MÔI TRƯỜNG Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Bác sỹ thú y chuyên ngành Dược Giáo viên hướng dẫn TS HỒ THỊ KIM HOA BSTY LÊ HỮU NGỌC Tháng 8/2010 i NHẬN XÉT GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TP HCM, ngày … tháng 08 năm 2010 Giáo viên hướng dẫn TS Hồ Thị Kim Hoa ii LỜI CẢM TẠ Chân thành biết ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Ban Chủ Nhiệm khoa Chăn Ni Thú Y tồn thể thầy tận tình giảng dạy tơi suốt năm ñại học Chân thành biết ơn TS Võ Thị Trà An tạo điều kiện cho tơi tham gia ñề tài này, phần nhỏ ñề án nghiên cứu tồn trữ gen kháng kháng sinh APUA (Alliance for the Prudent Use of Antibiotic) Đặc biệt, tơi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Hồ Thị Kim Hoa BSTY Lê Hữu Ngọc ñã tận tình hướng dẫn hết lòng giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Cảm ơn tất bạn lớp Dược Y 31 đồng hành tơi năm qua Và bạn, anh chị phòng thí nghiệm: Thể, Thành, Thức, Tuấn, chị Hợp, chị Tuyền, Hải Linh giúp đỡ tơi nhiều Lâm Thị Ái Linh iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Bước ñầu tìm hiểu ñề kháng kháng sinh từ vi khuẩn mơi trường” thực từ 09/2009 đến 06/2010 phòng Kiểm Nghiệm Thú Sản Mơi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Qua phân lập 31 mẫu nước (nước ao nuôi cá, nước thải chăn nuôi, nước sơng) 39 mẫu đất rau (có bón phân chuồng) theo qui trình phân lập APUA (2009) với số thay đổi cho phù hợp, chúng tơi đạt kết sau Tỷ lệ phát Aeromonas spp môi trường nước 45,16 % (nước ao nuôi cá 71,43 %, nước sông 33,33 % nước thải chăn nuôi heo 18,18 %) Tỷ lệ phát Acinetobacter spp môi trường nước 70,97 % (nước ao nuôi cá 92,86 %, nước sông 100 %, nước thải chăn ni heo 27,27 %) đất 74,3 % Tỷ lệ phát Pseudomonas spp môi trường nước 32,26 % (nước thải chăn nuôi 54,55 %, nước ao nuôi cá 21,43 %, nước sông 16,67 %) ñất 12,82 % Tỷ lệ phát S maltophilia đất 51,28 % Kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh phương pháp khuếch tán thạch 13 gốc Aeromonas spp cho thấy tỷ lệ nhạy cảm với nitrofurantoin, chloramphenicol, gentamicin, ciprofloxacin, doxycycline 100 % nhạy cảm với ampicillin 15,4 %, cephalexin 46,2 % Trong 17 gốc Pseudomonas spp., tỷ lệ nhạy cảm với ciprofloxacin 100 %, doxycycline 94,1 %, gentamicin 88,2 % hầu hết gốc Pseudomonas spp có tỷ lệ ñề kháng cao với nitrofurantoin, ampicillin 100 %, cephalexin 88,2 %, rifampicin 82,4 % Trong 51 gốc Acinetobacter spp., tỷ lệ nhạy cảm với gentamicin, doxycycline 98 %, ciprofloxacin 96 %, tetracycline 90,2 % nhạy cảm với nitrofurantoin 29,4 %, ampicillin 25,5 %, rifampicin 31,4 %, cephalexin 31,4 % Trong 20 gốc S maltophilia, tỷ lệ nhạy cảm cao với ciprofloxacin, doxycycline 100 %, tetracycline 90 % ñề kháng với cephalexin 100 %, nitrofurantoin 95 % iv MỤC LỤC Trang Trang tựa i Nhận xét giáo viên hướng dẫn ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt luận văn iv Mục lục iv Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Danh sách sơ ñồ ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn ñề .1 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn môi trường 2.1.1 Vai trò vi khuẩn môi trường 2.1.2 Giới thiệu số vi khuẩn mơi trường có liên quan đến đề tài 2.1.2.1 Acinetobacter spp 2.1.2.2 Aeromonas spp 2.1.2.3 Pseudomonas spp 2.1.2.4 Stenotrophomonas maltophilia 12 2.2 Giới thiệu sơ lược kháng sinh .13 2.2.1 Khái niệm 13 2.2.2 Các nhóm thuốc kháng sinh 13 2.2.2.1 Nhóm beta - lactam 13 2.2.2.2 Nhóm aminoglycoside 14 2.2.2.3 Nhóm polypeptide 15 2.2.2.4 Nhóm tetracycline 15 v 2.2.2.5 Nhóm phenicol 15 2.2.2.6 Nhóm macrolide 16 2.2.2.7 Nhóm sulfonamide 16 2.2.2.8 Nhóm diaminopyrimidine 17 2.2.2.9 Nhóm quinolone 17 2.3 Sự ñề kháng kháng sinh 18 2.3.1 Nguyên nhân ñề kháng kháng sinh 18 2.3.1.1 Đề kháng tự nhiên 18 2.3.1.2 Đề kháng thu nhận 18 2.3.2 Các chế ñề kháng kháng sinh vi khuẩn .20 2.3.2.1 Sản xuất enzyme làm bất hoạt kháng sinh .20 2.3.2.2 Ngăn chặn kháng sinh xâm nhập qua thành tế bào .20 2.3.2.3 Thay ñổi ñiểm tác ñộng 20 2.3.2.4 Phát sinh ñường chuyển hóa 20 2.3.2.5 Sản xuất nhiều chất cạnh tranh với kháng sinh 20 2.3.2.6 Đề kháng chéo 20 2.4 Các phương pháp xác ñịnh ñộ mẫn cảm vi khuẩn ñối với kháng sinh 21 2.4.1 Phương pháp ñịnh tính .21 2.4.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng ñến kết phản ứng 21 2.4.1.2 Chọn lựa ñĩa kháng sinh .22 2.4.1.3 Quy trình kiểm tra chất lượng 23 2.4.2 Phương pháp ñịnh lượng 25 2.5 Những nghiên cứu liên quan ñến ñề kháng kháng sinh môi trường 26 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 3.1 Thời gian ñịa ñiểm 28 3.1.1 Thời gian 28 3.1.2 Địa ñiểm 28 3.2 Đối tượng .28 3.3 Nội dung nghiên cứu tiêu theo dõi 28 3.4 Phương pháp tiến hành 29 vi 3.4.1 Môi trường hóa chất 29 3.4.2 Cách lấy mẫu bảo quản mẫu 30 3.4.1.1 Mẫu nước .30 3.4.1.2 Mẫu ñất 31 3.4.2 Phân lập vi khuẩn .33 3.4.2.1 Qui trình phân lập Aeromonas spp Pseudomonas spp 33 3.4.2.2 Qui trình phân lập Pseudomonas spp Acinetobacter spp .35 3.4.2.3 Qui trình phân lập Stenotrophomonas maltophilia 37 3.4.3 Thực kháng sinh ñồ 38 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 39 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 4.1 Phân lập ñịnh danh vi khuẩn 40 4.1.1 Tỉ lệ phát Aeromonas spp môi trường nước 40 4.1.2 Tỉ lệ phát Acinetobacter spp mơi trường nước đất 41 4.1.3 Tỉ lệ phát Pseudomonas spp mơi trường nước đất 42 4.1.4 Tỷ lệ phát Stenotrophomonas maltophilia mơi trường đất .44 4.1.5 Sự tương thích kết phân lập ñề tài với kết kiểm chứng Đại học Tufts, Hoa Kỳ 44 4.2 Thực kháng sinh ñồ .45 4.2.1 Kết thực kháng sinh ñồ ñối với gốc Aeromonas spp 45 4.2.2 Kết thực kháng sinh ñồ ñối với gốc Acinetobacter spp 47 4.2.3 Kết thực kháng sinh ñồ ñối với gốc Pseudomonas spp 48 4.2.4 Kết thực kháng sinh ñồ ñối với gốc S maltophilia .49 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 52 Tài liệu tham khảo 53 Phụ lục 57 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa số loài Pseudomonas Bảng 2.2 Các bệnh cảm nhiễm Pseudomonas ñộng vật 11 Bảng 2.3 Đường kính vòng vơ khuẩn 24 Bảng 3.1 Bảng phân bố lấy mẫu nước số lượng mẫu 31 Bảng 3.2 Bảng phân bố lấy mẫu ñất 32 Bảng 4.1 Tỉ lệ phát Aeromonas spp loại môi trường nước 40 Bảng 4.2 Tỉ lệ phát Acinetobacter spp loại môi trường nước 41 Bảng 4.3 Tỉ lệ phát Pseudomonas spp loại môi trường nước 43 Bảng 4.4 Sự tương thích kết phân lập ñề tài với kết kiểm chứng Đại học Tufts, Hoa Kỳ 44 Bảng 4.5 Kết thực kháng sinh ñồ với gốc Aeromonas spp 46 Bảng 4.6 Kết thực kháng sinh ñồ với gốc Acinetobacter spp 47 Bảng 4.7 Kết thực kháng sinh ñồ với gốc Pseudomonas spp 48 Bảng 4.8 Kết thực kháng sinh ñồ với gốc S maltophilia 49 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 3.1 Cách lấy mẫu nước 30 Hình 3.2 Cách lấy mẫu đất 32 Hình 4.1 Kết thực kháng sinh đồ 39 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Qui trình phân lập Aeromonas Pseudomonas từ môi trường 33 Sơ ñồ 3.2 Qui trình phân lập Pseudomonas spp Acinetobacter spp từ môi trường 35 Sơ đồ 3.3 Qui trình phân lập S maltophilia ñất 37 ix Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian thực đề tài “Bước đầu tìm hiểu ñề kháng kháng sinh từ vi khuẩn mơi trường” chúng tơi có kết luận sau Phân lập thành công vi khuẩn Aeromonas spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia theo qui trình APUA (2009) cung cấp ñã ñược cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam với tỷ lệ phân lập Aeromonas spp mơi trường nước 45,16 %; Acinetobacter spp môi trường nước 70,97 % ñất 74,3 %; Pseudomonas spp môi trường nước 32,26 % ñất 12,82 %; S maltophilia môi trường ñất 51,28 % Sự tương thích kết luận định danh đạt 90,63 % so với kiểm định phòng thí nghiệm Đại học Tufts, Hoa Kỳ Các gốc Aeromonas spp có tỷ lệ nhạy cảm cao với nitrofurantoin, chloramphenicol, gentamicin, ciprofloxacin, doxycycline (100 %) lại nhạy cảm với ampicillin 15,4 %, cephalexin 46,2 % Tỷ lệ nhạy cảm gốc Acinetobacter spp với gentamicin, doxycycline (98 %), ciprofloxacin 96 %, tetracycline 90,2 % nhạy cảm với nitrofurantoin 29,4 %, ampicillin 25,5 %, rifampicin 31,4 %, cephalexin 31,4 % Tỷ lệ nhạy cảm gốc Pseudomonas spp với ciprofloxacin 100 %, doxycycline 94,1 %, gentamicin 88,2 % tỷ lệ ñề kháng cao với kháng sinh như: nitrofurantoin 100 %, ampicillin 100 %, cephalexin 88,2 %, rifampicin 82,4 %, trimethoprim/ sulfamethoxazole 64,7 %, chloramphenicol 64,7 % Các gốc S maltophilia có tỷ lệ 51 nhạy cảm cao với ciprofloxacin, doxycycline (100 %), tetracycline 90 % ñề kháng với cephalexin 100%, nitrofurantoin 95%, ampicillin 60% 5.2 Đề nghị - Qua việc thực kháng sinh ñồ với số chủng phân lập từ mơi trường cho thấy mức độ ñề kháng cao ñối với số kháng sinh như: ampicillin, cephalexin, nitrofurantoin Điều cho ta thấy cần có quản lý chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh ñể tránh gia tăng ñề kháng kháng sinh mơi trường - Nếu có điều kiện nghiên cứu chế ñề kháng (kiểu gen) vi khuẩn ñể hiểu rõ mối nguy vai trò mà chúng đem đến việc lan tràn chế ñề kháng, ảnh hưởng ñến sức khỏe cộng ñồng - Một vấn ñề liên quan ñến thao tác phân lập vi khuẩn có số gốc vi khuẩn sau thời gian giữ giống ngăn ñá tủ lạnh bị chết, Aeromonas spp Do nên cẩn thận thao tác giữ gốc cần có tủ lạnh – 800C để đảm bảo 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Võ Thị Trà An, 2007 Kháng sinh cho vật nuôi Nhà xuất Đà Nẵng 184 trang Tô Minh Châu, Trần Thị Bích Liên, 2001 Bài giảng vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Trần Thị Thu Hằng, 2003 Dược lực học Tái lần thứ Nhà xuất y học 738 trang Nguyễn Đức Lượng, 2004 Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học tập Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp HCM 463 trang Võ Thị Chi Mai Ngô Thị Quỳnh Hoa, 2004 Nhiễm khuẩn S maltophilia (1999 – 2002) Tạp chí Y học, Tập 8, Số 1: 36 – 38 Lương Đức Phẩm, 2009 Cơ Sở Vi Sinh Trong Công Nghệ Bảo Vệ Môi Trường Nhà xuất giáo dục 572 trang Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009 Bài giảng Hóa Dược Trường Đại Học Nông Lâm, Tp HCM Phạm Hồng Sơn, 2008 Giáo trình Vi Sinh Vật Học Thú Y Trường Đại Học Huế Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học thủy sản - Phần - Bệnh truyền nhiễm động vật thủy sản Viện nghiên cứu ni trồng thủy sản I 31/05/2010 10 Trần Linh Thước, 2004 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nhà xuất giáo dục 232 trang 11 Nguyễn Hồng Thu Trang, 2007 Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn tính đề kháng kháng sinh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa nước uống Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa Cơng Nghệ Sinh trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 53 12 Lê Quốc Tuấn, 2009 Bài giảng Vi Sinh Môi Trường Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Tài liệu nước 13 Abulhamd A T., 2009 Characterization of Aeromonas hydrophila Isolated from Aquatic Environments Using Phenotypic and Genotyping Methods Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 5(6): 923-931 14 Auling G., Pilz F., Busse H J., Karrasch S., Streichan M., Schon G (1991) Analysis of The Polyphosphate-accumulating Microflora in Phosphoruseliminating, Anaerobic-aerobic Activated Sludge Systems by Using Diaminopropane as a Biomarker for Rapid Estimation of Acinetobacter spp Applied Environmental Microbiology 57:3585-3592 15 Baquero F., Martine J L., Canton R., 2008 Antibiotics and antibiotic resistance in water environment Current Opinion in Biotechnology 19:260–265 16 Baumann P., 1968 Isolation of Acinetobacter from Soil and Water Journal of Bacteriology P 39-42 17 Berg G., Roskot N., and Smalla K., 1999 Genotypic and Phenotypic Relationships between Clinical and Environmental Isolates of Stenotrophomonas maltophilia Journal of Clinical Microbiology P 3594– 3600 18 Bollet C., Regli A D., and Micco P D., 1995.A Simple Method for Selective Isolation of Stenotrophomonas maltophilia from Environmental Samples Applied Environmental Microbiology 61:1653-1654 19 Boswell C D., Dick R E., Eccles H and Macaskie L.E (2001) Phosphate Uptake and Release by Acinetobacter johnsonii in Continuous Culture and Coupling of Phosphate Release to Heavy Metal Accumulation Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 26:333-340 20 Collins C H., Lyne P M and Grange J M., 1989 Collins and Lyne’s Microbiological Methods 21 Denton M and Kerr K G., 1998 Microbiological and Clinical Aspects of Infection Associated with Stenotrophomonas maltophilia Journal of Clinical Microbiology p 3594–3600 54 22 Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K H and Stackebrandt E., 2006 The Prokaryotes A Handbook on the Biology of Bacteria Volume 6: Proteobacteria: Gamma Subclass p1193 23 Francisco R., Alpoim M C and Morais P V (2002) Diversity of ChromiumResistant and -Reducing Bacteria in a Chromium-Contaminated Activated Sludge Journal Applied Microbiology (92):837-43 24 Freney J., Hansen W., Etienne J., Vandenesch J and Fleurette' J., 1988 Postoperative Infant Septicemia Caused by Pseudomonas luteola (CDC Group Ve-1) and Pseudomonas oryzihabitans (CDC Group Ve-2) Journal of Clinical Microbiology, p 1241-1243 25 Haleem D A E., 2003 Acinetobacter: Environmental and Biotechnological Applications African Journal of Biotechnology Vol (4), p 71-74 26 Holt J., Krieg N., Sneath P., Staley J and Williams S., 1994 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Ninth edition Lippincott Williams and Wilkins 27 Idomir M., Nemet C., Pascu A and Ardeleanu M., 2009 Acinetobacter spp – Pathogenic Role and Resistance to Antibiotics Bulletin of the Transilvania University of Brasov Vol (51) – 2009 Series VI: Medical Sciences 28 Marshall B M., Ochieng D J., and Levy S B., 2009 Commensals: Underappreciated Reservoir of Antibiotic Resistance Volume 4, Number Microbe 29 Palleroni N J, 1992 Present situation of the taxonomy of aerobic pseudomonads In:E Galli, S Silver, and B Witholt (Eds.) Pseudomonas: Biology and Biotechnology American Society for Microbiology Press p105–115 30 Percival S L., Chalmers R M., Embrey M., Hunter P R., Sellwood J., and Jones P W., 2004 Microbiology of Waterborne Diseases p 24 31 Quinn P J., Carter M E., Markey B K and Cater G R., 1998 Clinical Veterinary Microbiology Copyright Lincensing Agency P 684 32 Qureshi A., Mooney L., Denton M and Kerr G K, 2005 Stenotrophomonas maltophilia in Salad Emerging Infectious Diseases www.cdc.gov/eid 55 33 Uchino M., Kosako Y., Uchimura T and Komagata K., 2000 Emendation of Pseudomonas straminea Iizuka and Komagata 1963 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology , p1513–1519 34 Urriza M., Pineau L., Capdepuy M., Roques C., Caumette P and Quentin C., 2000 Antimicrobial resistance of mesophilic Aeromonas spp isolated from two European rivers Journal of Antimicrobial Chemotherapy p 297-301 35 Vicent A D., 1989 Serotypes and Pyocin Types of Pseudomonas aeruginosa Isolated from Natural Waters Letters in Applied Microbiology 1990, p 77-80 36 Wagner M., Erhart R., Manz W., Amann R., Lemmer H., Wedi D and Schleifer K.H., 1994 Development of an rRNA-targeted Oligonucleotide Probe Specific for The Genus Acinetobacter and Its Application For In Situ Monitoring in Activated Sludge Applied Environmental Microbiology 60:792-800 56 PHỤ LỤC Các hình ảnh mơ tả vi khuẩn Aeromonas Hình Hình thái vi khuẩn Hình Phản ứng di động Aeromonas kính hiển vi khơng di động thạch (TSI (Đ/V, V/V), urease (-), citrate (+), glucose (+), mannitol (+), sucrose (+), indol (+)) Hình Các phản ứng sinh hóa phân lập Aeromonas Các hình ảnh mơ tả vi khuẩn Pseudomonas Hình Hình thái vi khuẩn (citrate (+), indol (-), nitrate (+), TSI (Đ/Đ) Pseudomonas kính hiển Hình Các phản ứng sinh hóa để phân lập Pseudomonas 57 Các hình ảnh mơ tả Acinetobacter (TSI (Đ/NC), nitrate (-), indol (-), citrate (+)) Hình Hình thái vi khuẩn Acinetobacter kính hiển vi Hình Các phản ứng sinh hóa phân lập Acinetobacter Các hình ảnh mơ tả vi khuẩn S maltophilia Hình Vi khuẩn S maltophilia Hình Phản ứng urease (-) gelatin (+) mọc gần ñĩa kháng sinh Dung dịch ñệm phosphate (APUA, 2009) Dung dịch ñệm 0.04M KH2PO4 Na2HPO4 (pH 6,0) 4,79 g KH2PO4 0,681 g Na2HPO4 Hòa tan l nước cất Mơi trường tăng sinh • Mơi trường Baumann’s (APUA, 2009) Pha theo thành phần Sodium acetate 2g KNO3 2g MgSO4 7H2O 0.2 g 58 Hòa tan 1lít dung dịch đệm 0.04M KH2PO4Na2HPO4 (pH 6,0) Sau đem hấp tiệt trùng 1210C/ 15phút Mơi trường dinh dưỡng • Mơi trường canh NB (Oxoid, CM0067) có bổ sung methionine Khuấy tan 13 g mơi trường đơng khơ NB thêm 50 mg methionine 1000ml nước cất Đun sơi để hòa tan hồn tồn mơi trường Hấp tiệt trùng autoclave 1210C/ 15phút • Môi trường NA (Oxoid, CM0003) Cân 28 g môi trường khơ pha với 1000 ml nước cất, đun cách thủy cho tan agar (hoặc đun microwave) Sau đem hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút, lấy ñể mơi trường nguội khoảng 450C, lắc trước đổ vào ñĩa petri ñã ñược tiệt trùng (khoảng 18 – 20 ml/ đĩa) Mơi trường phân lập • Mơi trường MacConkey (Himedia, M082) Cân 55g mơi trường khơ hòa tan 1000 ml nước cất Đun sơi để hòa tan hồn tồn mơi trường Sau hấp tiệt trùng autoclave 1210C/ 15 phút, lấy ñể nguội ñến nhiệt ñộ khoảng 450C, lắc ñều trước ñổ vào đĩa petri tiệt trùng • Mơi trường Aeromonas Agar (Lab M, Lab 167) Cân 45,5 g môi trường cho vào 1(l) nước cất ñã hấp tiệt trùng autoclave Để cho ngấm 10 phút, lắc ñều trộn lẫn tiệt trùng cách đun sơi cách thủy đến agar tan hồn tồn Lấy để nguội khoảng 470C, lắc ñều ñổ vào ñĩa petri tiệt trùng Đây môi trường chọn lọc cho phân lập Aeromonas spp • Môi trường CHROMagar™ Acinetobacter (Notice 090910) Môi trường bao gồm phần: thành phần (X096B) chất bổ sung (X096S) Có pH 6,9 ± 0,2 Cân 32,8 g mơi trường đơng khơ (X096B) vào 1l nước cất ñã hấp tiệt trùng Sau ñó thêm vào g chất bổ sung vào, lắc ñều ñun cách thủy agar tan hồn tồn Lấy để nguội khoảng 500C, lắc ñều ñổ vào ñĩa petri tiệt trùng 59 Môi trường thực kháng sinh ñồ • Mueller Hinton Agar (Himedia, M173) Cân 38 g mơi trường hòa tan với 1l nước cất, đem hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút, sau đổ vào ñĩa petri tiệt trùng autoclave ñĩa 20 ml/ đĩa có đường kính 90 mm 10 Mơi trường thử nghiệm phản ứng sinh hóa • Phản ứng catalase Dùng dung dịch hydrogen peroxide (H2O2) 30% Kết quả: dương tính có tượng sủi bọt khí O2 tạo Ngược lại âm tính khơng có sủi bọt khí • Phản ứng Indol Thành phần: Tryptone 10 g Sodium Chloride 5g Pha với 1000 ml nước cất cho vào ống nghiệm, ống ml ñậy nút lại Sau ñó hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút Thuốc thử: Kovac’s cân theo chất sau Paradimethylaminobenzadehyde g Isoamyl ahcohol 75 ml Hydrochloride acid 25 ml Kết quả: dương tính có xuất lớp màu đỏ bề mặt mơi trường Ngược lại âm tính có màu vàng thuốc thử bề mặt mơi trường • Phản ứng MRVP Thành phần Buffered Peptone 7g Dextrose 5g Dipotassium phosphate 1.5 g Thuốc thử: a MR (Methyl Red) cân chất sau Methyl Red 0.04 g Ethanol 60 ml 60 b.VP (Voges – Proskauer) cân chất sau: α _Napthol 5g Alcohol 100 ml c KOH 40% cân chất sau Kalihydroxide (KOH) 40 g Nước cất 100 ml Kết quả: Phản ứng MR: dương tính mơi trường có màu đỏ Ngược lại âm tính có màu vàng Phản ứng VP: dương tính mơi trường có màu đỏ Ngược lại âm tính bề mặt mơi trường khơng đổi màu • Phản ứng citrate (Simmons Citrate Agar (Himedia, M099) Cân 24,2 g môi trường khô pha với 1000 ml nước cất Đun cách thủy cho tan agar (hoặc ñun microwave khoảng phút), cho vào ống nghiệm, ống ml ñậy nút lại Hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút Hấp xong ñặt ống nghiệm nằm nghiêng 150, cho mơi trường đơng lại Lưu ý: mơi trường phải chuẩn bị trước sử dụng 24 Kết quả: dương tính mơi trường chuyển sang màu xanh dương Ngược lại âm tính mơi trường giữ ngun màu • Phản ứng TSI (Triple Sugar Iron Agar (Oxoid, CM0003) Cân 64,6 g môi trường pha với 1000 ml nước cất Đun cách thủy cho tan hoàn toàn agar (hoặc ñun microwave khoảng phút), sau ñó cho vào ống nghiệm, ống ml ñậy nút lại Hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút Hấp xong ñặt ống nằm nghiêng 250C, cho mơi trường đơng lại Lưu ý: Môi trường phải chuẩn bị trước sử dụng 24 Kết quả: có trường hợp - Đỏ/ Đỏ: vi khuẩn khơng lên men loại đường mà sử dụng peptone - Đỏ/Vàng: vi khuẩn lên men ñường glucose, sử dụng peptone - Vàng/Vàng: vi khuẩn lên men glucose, lactose và/ sucrose 61 Nếu có khí H2S xuất màu đen ống nghiệm Nếu có gas làm cho thạch nứt • Phản ứng Oxidase Phản ứng cần dung dịch 1% tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride Hoặc mua giấy tẩm sẵn tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride Nam Khoa để thử Kết quả: dương tính xuất màu xanh dương đậm Ngược lại khơng xuất màu xanh phản ứng âm tính Lưu ý: dung dịch ni cấy lâu cho kết khơng xác hoạt tính oxidase bị kìm hãm đường • Phản ứng nitrate Thành phần Beef Extract 3.0g Peptone 5.0g Potassium Nitrate 1.0g Cân 9,0 g 1000 ml nước cất Đun sơi để tan hoàn toàn, cho vào ống nghiệm, ống ml ñậy nút lại Hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút Thuốc thử a Dung dịch Sulphanilic acid (dung dịch A) Hòa tan g sulphanilic acid 1l acid acetic 5N b Dung dịch Alpha – naphthylamine (dung dịch B) Hòa tan g Alpha – naphthylamine 1l acid acetic 5N Kết quả: dương tính mơi trường chuyển sang màu hồng Ngược lại dương tính mơi trường khơng chuyển màu • Phản ứng tan chảy gelatinase (Collins Lyne, 1989) Mơi trường NA có thêm % gelatine Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy vng góc vào đĩa, ủ từ 18 – 24 nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn, sau cho dung dịch ammonium sulphate bão hòa vào 62 Kết quả: dương tính xuất vòng sáng xung quanh khuẩn lạc khuẩn sản xuất gelatinase Ngược lại âm tính khơng xuất vòng sáng • Phản ứng MIU (Motile Indol Urease) Sử dụng test MIU Nam Khoa để kiểm tra Kết quả: dương tính mơi trường chuyển sang màu đỏ cánh sen Ngược lại phản ứng dương tính mơi trường khơng đổi màu • Phản ứng di ñộng Thành phần: Tryptone 10 g NaCl 5g Agar No.1 (Oxoid, LP0011) 3g Cân 18 g hòa tan 1(l) nước cất Đun cách thủy cho tan agar (hoặc ñun microwave khoảng phút) Hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút Sau đổ vào đĩa ñã hấp tiệt trùng autoclave Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy vng góc vào đĩa, ủ nhiệt ñộ thích hợp cho vi khuẩn quan sát di ñộng theo mức ñộ thời gian từ 8, 12, 16, 24 Kết quả: dương tính vi khuẩn mọc lan xung quanh chỗ cấy Ngược lại âm tính vi khuẩn khơng mọc lan xung quanh 63 11 Kết xử lý trắc nghiệm Chi – Square (a) So sánh tỷ lệ phát Aeromonas (b) So sánh tỷ lệ phát Pseudomonas spp loại môi trường nước Co spp loại môi trường nước Khong Total NA 10 6.32 NC 4.97 NA 4.52 11 NC 2.71 3.55 NS 3.29 14 17 Total 14 9.48 11 7.45 1.94 31 11 6.03 Total 14 7.68 NS Co Khong Total 4.06 10 21 31 Chi-Sq = 2.139 + 1.761 + Chi-Sq = 0.509 + 0.242 + 1.773 + 1.460 + 1.694 + 0.807 + 0.186 + 0.153 = 7.472 0.452 + 0.215 = 3.919 DF = 2, P-Value = 0.024 DF = 2, P-Value = 0.14 (c) So sánh tỷ lệ phát Acinetobacter (d) So sánh tỷ lệ phát Acinetobacter spp loại môi trường nước spp nước ñất Co Khong Total NA 13 9.94 NC NS Total Co 14 Nước 4.06 3.19 4.26 1.74 22 22 22.59 7.81 Khong Total Đất 11 29 28.41 Total 51 31 8.41 10 39 10.59 19 70 Chi-Sq = 0.015 + 0.041 + 31 Chi-Sq = 0.945 + 2.311 + 0.012 + 0.032 = 0.100 DF = 1, P-Value = 0.751 2.959 + 7.234 + 0.713 + 1.742 = 15.904 DF = 2, P-Value = 0.000 64 (e) So sánh tỷ lệ phát Pseudomonas spp nước ñất Co Khong Nước 6.64 Đất 8.36 Total Total 10 21 31 24.36 34 39 30.64 15 55 70 Chi-Sq = 1.697 + 0.463 + 1.349 + 0.368 = 3.876 DF = 1, P-Value = 0.049 65 ... bạn, anh chị phòng thí nghiệm: Thể, Thành, Thức, Tuấn, chị Hợp, chị Tuyền, Hải Linh giúp đỡ tơi nhiều Lâm Thị Ái Linh iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Bước đầu tìm hiểu đề kháng kháng sinh từ vi khuẩn... Chương TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn môi trường 2.1.1 Vai trò vi khuẩn mơi trường 2.1.2 Giới thi u số vi khuẩn mơi trường có liên quan đến đề tài 2.1.2.1 Acinetobacter... vi khuẩn phân lập ñược Chương TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn môi trường 2.1.1 Vai trò vi khuẩn mơi trường Vi khuẩn mơi trường tồn hai dạng vi khuẩn sống mơi trường (đất, nước) vi khuẩn nhiễm vào môi trường