BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  NGUYỄN VĂN ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG RIFAMPICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  NGUYỄN VĂN ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG RIFAMPICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS: Trần Thị Lan Hương ThS: Tạ Mạnh Hùng Nơi thực hiện: Trung tâm đánh giá tương đương sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận lúc em xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian qua Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành tới ThS Trần Thị Lan Hương ThS Tạ Mạnh Hùng, người thầy dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn anh chị trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương tận tình giúp đỡ, bảo em suốt trình thực đề tài Trong suốt năm học tập trường đại học Dược Hà Nội, em nhận dìu dắt, dạy bảo tận tình thầy Em xin chân thành cảm ơn! Với tất tình thương yêu, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, anh chị em người bạn – người ln động viên, khích lệ em suốt thời gian qua Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2013 Sinh viên Nguyễn Văn Đức Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan Rifampicin (RIF) 1.1.1.Cấu trúc hóa học 1.1.2.Tính chất hóa lý 1.1.3.Dược động học 1.1.4.Phổ tác dụng chế 1.1.5.Chỉ định .3 1.1.6.Một số chế phẩm thị trường 1.1.7.Một số phương pháp định lượng RIF dịch sinh học HPLC .5 1.2.Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.1.Định nghĩa 1.2.2.Một số thông số trình sắc ký 1.2.3.Nguyên tắc cấu tạo hệ thống máy HPLC .8 1.2.4.Cơ sở lý thuyết việc lựa chọn điều kiện sắc ký 1.2.5.Phương pháp định lượng HPLC 13 1.3.Thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học 14 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3.Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1.Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .18 2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích 20 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng rifampicin huyết tương: 24 3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký nội chuẩn 24 3.1.2 Khảo sát tìm điều kiện xử lý mẫu có Rifampicin 28 3.1.3 Qui trình phân tích RIF huyết tương 31 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 31 3.2.1 Tính chọn lọc 32 3.2.2 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 34 3.2.3 Giới hạn định lượng 37 3.2.4 Độ – độ lặp lại ngày khác ngày 37 3.2.5 Tỷ lệ thu hồi phương pháp 40 3.2.6 Độ ổn định mẫu huyết tương 42 3.3 Bàn luận 45 3.3.1 Phương pháp xử lý mẫu huyết tương có Rifampicin 45 3.3.2 Phương pháp định lượng rifampicin huyết tương 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .49 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CC : Đường chuẩn HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao (High Quality Control Sample) HT : Huyết tương IS : Nội chuẩn (Internal Standard) LLOQ : Giới hạn định lượng (Lower Limit Of Quantification) LQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control Sample) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol MQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình (Middle Quality Control Sample) QC : Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control Sample) RIF : Rifampicin SKĐ : Sắc ký đồ SPE : Chiết pha rắn (Solid-phase extration) ULOQ : Nồng độ giới hạn định lượng (Upper Limit Of Quantification) US-FDA : Cục quản lý thuốc thực phẩm Mỹ (The United States Food and Drug Administration) UV-VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet - Visible) WHO : Tổ chức y tế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Các chế phẩm rifampicin thị trường 1.2 Một số nghiên cứu định lượng rifampicin dịch sinh học 2.1 Các chất chuẩn dùng nghiên cứu 17 2.2 Các hóa chất dùng nghiên cứu 18 2.3 Chuẩn bị đường chuẩn 19 2.4 Chuẩn bị mẫu kiểm tra 20 2.5 Chuẩn bị mẫu giới hạn định lượng 20 3.1 3.2 Kết xác định ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm trùng thời gian lưu rifampicin nội chuẩn Kết tương quan nồng độ rifampicin huyết tương tỷ lệ đáp ứng pic 34 35 3.3 Kết thẩm định đường chuẩn 36 3.4 Kết thẩm định giới hạn định lượng 37 3.5 Kết thẩm định độ đúng, độ lặp lại ngày 38 3.6 Kết thẩm định độ đúng, độ lặp lại ngày 39 3.7 Kết thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn 40 3.8 Kết thẩm định tỷ lệ thu hồi rifampicin 41 3.9 3.10 3.11 Kết thẩm định độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kỳ đông–rã Kết thẩm định độ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ phòng thời gian ngắn Kết thẩm định độ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ 800C thời gian dài 42 43 44 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Nội dung Trang 1.1 Cấu trúc cột LC – DB 11 1.2 Cấu trúc cột có gốc isopropyl 11 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS rifampicin 24 3.2 3.3 3.4 3.5 Sắc đồ chuẩn rifampicin pha động: methanol - đệm phosphat (65:35) Sắc đồ chuẩn nội chuẩn pha động: methanol - đệm phosphat (65:35) Sắc đồ chuẩn rifampicin pha động: methanol - acetonitril đệm phosphat (48,8: 16,2: 35) Sắc đồ chuẩn nội chuẩn pha động: methanol - acetonitril - đệm phosphat (48,8: 16,2: 35) 26 26 27 27 3.6 Sắc đồ chuẩn rifampicin nội chuẩn với tốc độ dòng khác 28 3.7 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng tủa protein methanol 29 3.8 3.9 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng thêm rifampicin nội chuẩn tủa protein với 1,5 mL methanol Sắc đồ mẫu huyết tương trắng thêm rifampicin nội chuẩn tủa protein với 1,0 mL methanol 29 29 3.10 Sắc đồ chuẩn rifampicin methanol có Vitamin C 1,0 mg/mL 30 3.11 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng thẩm định độ chọn lọc 32 3.12 3.13 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn rifampicin (nồng độ 0,2 µg/mL) nội chuẩn Sắc đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn rifampicin (nồng độ 9,0 µg/mL) nội chuẩn 33 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Lao bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phổ biến Bệnh vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây Cơ quan chịu tác động phổ biến vi khuẩn lao phổi Ngồi ra, vị trí khác gây bệnh vi khuẩn lao xương, khớp, hạch não Theo tổ chức y tế giới, lao mối đe dọa lớn toàn cầu vấn đề sức khỏe [21] Việt Nam nằm danh sách nước có số ca mắc lao cao giới, đứng thứ 12/23 nước có số lượng bệnh nhân lao cao toàn cầu Đặc biệt, số liệu gần cho thấy tỷ lệ số bệnh nhân lao tái phát thất bại điều trị có xu hướng gia tăng [20] Rifampicin năm thuốc thuốc điều trị lao nhóm gồm có isoniazid, rifampicin, pyrazinamid, ethambutol, streptomycin Vi khuẩn lao kháng thuốc có xu hướng gia tăng vấn đề lớn gây thất bại điều trị Có nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến kết điều trị nồng độ thuốc chống lao máu có liên quan chặt chẽ đến hiệu điều trị thực tế Để đánh giá xác việc điều trị có đạt u cầu hay khơng, việc định lượng nồng độ thuốc máu yêu cầu cần thiết đặt Điều đáng ý, năm 2010 Bộ Y tế quy định thuốc chứa hoạt chất rifampicin phải có báo cáo, số liệu đánh giá tương đương sinh học invivo cấp phép đăng ký lưu hành thị trường Việt Nam [7] Do vậy, để xác định nồng độ rifampicin huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị đánh giá tương đương sinh học chế phẩm chứa hoạt chất rifampicin, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng rifampicin huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao” với mục tiêu: Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng rifampicin huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao với detector UV Thẩm định phương pháp xây dựng theo qui định US-FDA Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.TỔNG QUAN VỀ RIFAMPICIN (RIF) 1.1.1.Cấu trúc hóa học - Cơng thức phân tử: C43H58N4O12 ; M=822,95 g/mol - Công thức cấu tạo: - Tên khoa học: (12Z,14E,24E) (2S,16S,17S,18R,19R,20R,21S,22R,23S) – 5,6,9,17,19- pentahydroxy – 23 – methoxy – 2,4,12,16,18,20,22 – heptamethyl – – [N-(4methyl-1-pipeainyl) pentadecatrienoimino] -1,2-dihydronaphtho [2,1-b] furan -21yl acetat [2], [4], [13], [19] 1.1.2.Tính chất hóa lý - Bột kết tinh màu đỏ cam, đỏ nâu, không bền bị ẩm - Dễ tan cloroform; tan methanol; tan nước, ethanol, ether - Dung dịch RIF không bền biến đổi tùy thuộc vào pH nhiệt độ Ở pH kiềm, RIF dễ bị oxy hóa oxy khơng khí làm chuyển RIF sang dạng quinon; Ở pH acid, RIF bị thủy phân hợp chất 3-formyl rifamycin SV Các nhóm ester bị thủy phân pH trung tính [2], [4], [13], [19] Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 36 Bảng 3.3: Kết thẩm định đường chuẩn STT Nồng độ thực Nồng độ tìm thấy(a) (µg/mL) (µg/mL) 0,204 0,510 1,019 2,038 4,076 8,153 16,306 20,382 Độ đúng(b) (%) Đạt/ Không đạt 0,212 104,0 Đạt 0,205 100,4 Đạt 0,454 89,2 Đạt 0,504 99,0 Đạt 1,016 99,7 Đạt 1,010 99,1 Đạt 2,134 104,7 Đạt 2,112 103,6 Đạt 3,993 98,0 Đạt 3,965 97,3 Đạt 8,063 98,9 Đạt 7,937 97,4 Đạt 16,437 100,8 Đạt 16,294 99,9 Đạt 21,346 104,7 Đạt 21,074 103,4 Đạt (a) tính từ phương trình hồi qui (b) % so với nồng độ thực Như vậy, tất điểm đường chuẩn giá trị nồng độ tính lại từ đường chuẩn so với nồng độ thực tế có mẫu có độ nằm khoảng từ 85 – 115%, riêng điểm thấp đường chuẩn sai số không vượt 20% (4% 0,4%) Do khoảng nồng độ từ 0,2 – 20,0 µg/mL có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ RIF huyết tương với tỷ lệ diện tích pic RIF/IS thu 37 3.2.3 Giới hạn định lượng Tiến hành thẩm định với mẫu chuẩn RIF nồng độ khoảng 0,2 µg/mL với mẫu độc lập Tiến hành tương tự mục 2.3.3.5 Kết xác định giá trị LLOQ phương pháp trình bày bảng 3.4: Bảng 3.4: Kết thẩm định giới hạn định lượng (LLOQ) Mẫu trắng Stt Mẫu chuẩn (0,204 µg/mL) Đáp ứng (mAU.s) RIF IS (mAU.s) (mAU.s) Nồng độ tìm (a) thấy (µg /mL) Độ đúng(b) (%) Đạt/ Không đạt 4453 167742 0,233 93.6 Đạt 4309 165712 0,229 119.4 Đạt 4007 168551 0,210 96.0 Đạt 4252 171227 0,219 116.5 Đạt 4253 171360 0,219 96.1 Đạt 4327 169799 0,225 109.6 Đạt TB 0,223 109,2 CV (%) 3,7 3,7 (a) tính từ phương trình hồi qui Đạt (b) % so với nồng độ thực Nhận xét: Kết cho thấy phương pháp có: - Độ nằm khoảng từ 80 – 120% so với nồng độ thực (93,6 – 119,4%) - Độ xác với giá trị CV% ≤ 20% (3,7%) Như mẫu chuẩn chứa RIF có nồng độ 0,2 µg/mL đáp ứng yêu cầu LLOQ độ đúng, độ xác phương pháp phân tích dịch sinh học 3.2.4 Độ – độ lặp lại ngày khác ngày 3.2.4.1.Độ đúng, độ lặp lại ngày Pha mẫu LQC, MQC, HQC mục 2.3.1 Mỗi loại QC gồm mẫu độc lập có nồng độ Tiến hành xử lý mẫu sắc ký theo điều Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 38 kiện lựa chọn Kết xác định độ đúng, độ lặp lại ngày trình bày bảng 3.5: Bảng 3.5: Kết thẩm định độ đúng,độ lặp lại ngày LQC (0,603µg/mL) Tỷ lệ Mẫu diện Nồng Độ tích độ(a) đúng(b) píc (µg/mL) (%) RIF/IS MQC (9,038µg/mL) Tỷ lệ diện tích píc RIF/IS Nồng Độ độ(a) đúng(b) (µg/mL) (%) HQC (18,075µg/mL) Tỷ lệ diện tích píc RIF/IS Nồng Độ độ(a) đúng(b) (µg/mL) (%) 0,078 0,593 98,4 1,185 9,741 107,8 2,320 19,113 105,7 0,078 0,593 98,5 1,163 9,557 105,7 2,332 19,214 106,3 0,077 0,585 97,1 1,132 9,301 102,9 2,258 18,606 102,9 0,078 0,593 98,5 1,140 9,366 103,6 2,283 18,808 104,1 0,076 0,579 96,0 1,154 9,480 104,9 2,338 19,260 106,6 0,079 0,600 99,5 1,104 9,065 100,3 2,142 17,643 97,6 0,590 98,0 9,419 104,2 18,774 103,9 TB CV (%) 1,2 2,5 3,2 (a): tính từ phương trình hồi qui (b): % so với nồng độ thực Kết cho thấy phương pháp định lượng có độ tốt nằm khoảng 96,0 – 107,8%, độ lệch nằm giới hạn cho phép ± 15%, độ lặp lại ngày với giá trị CV% nhỏ (1,2 – 3,2%), đáp ứng yêu cầu độ đúng, xác phương pháp phân tích dịch sinh học 3.2.4.2 Độ đúng, độ lặp lại khác ngày Tiến hành phân tích mẫu LQC, MQC, HQC chuẩn bị tương tự xác định độ đúng, độ lặp lại ngày theo phương pháp xây dựng ngày khác Xác định nồng độ RIF mẫu QC dựa vào đường chuẩn tiến hành song song ngày Kết xác định độ độ lặp lại khác ngày phương pháp trình bày bảng 3.6 39 Bảng 3.6: Kết thẩm định độ đúng, độ lặp lại ngày LQC (≈ 0,6 µg/mL) Ngày Nồng độ(a) (µg/mL) Độ đúng(b) (%) MQC (≈ 9,0 µg/mL) Nồng độ(a) (µg/mL) Độ đúng(b) (%) HQC (≈ 18,0 µg/mL) Nồng độ(a) (µg/mL) Độ đúng(b) (%) 0,668 104,1 10,217 106,2 19,591 101,8 0,640 99,8 9,002 93,5 19,588 101,8 0,619 96,5 8,940 92,9 19,682 102,2 0,608 94,7 9,341 97,0 19,568 101,7 0,595 92,7 9,018 93,7 19,537 101,5 0,588 91,6 9,340 97,0 19,399 100,8 0,593 98,4 9,741 107,8 19,113 105,7 0,593 98,5 9,557 105,7 19,214 106,3 0,585 97,1 9,301 102,9 18,606 102,9 0,593 98,5 9,366 103,6 18,808 104,1 0,579 96,0 9,480 104,9 19,260 106,6 0,600 99,5 9,065 100,3 17,643 97,6 0,550 89,0 8,526 92,0 17,817 96,2 0,583 94,5 8,633 93,2 17,678 95,4 0,625 101,2 8,799 95,0 17,288 93,3 0,544 88,0 9,026 97,4 17,479 94,3 0,591 95,6 8,760 94,6 17,606 95,0 0,591 95,7 8,920 96,3 17,424 94,0 I II III TB (%) 96,2 98,6 100,1 CV (%) 4,3 5,4 4,4 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 40 Kết thực nghiệm cho thấy nồng độ (0,6; 9,0; 18,0 µg/mL), phương pháp cho độ khoảng 85% đến 115%, độ lặp lại khác ngày với giá trị CV% ≤ 15% (4,3 – 5,4%) chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có độ đúng, độ xác cao, đáp ứng yêu cầu phương pháp dùng dịch sinh học 3.2.5 Tỷ lệ thu hồi phương pháp 3.2.5.1.Tỷ lệ thu hồi nội chuẩn Xử lý lơ mẫu QC theo qui trình lựa chọn Tiến hành phân tích xác định diện tích pic IS Song song, xác định diện tích pic IS mẫu chuẩn pha dung môi pha mẫu (không qua xử lý) Kết xác định tỷ lệ thu hồi IS trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7: Kết thẩm định tỷ lệ thu hồi IS STT Đáp ứng IS (mAU.s) Huyết tương Dung môi 168477 165217 169264 169659 169032 170108 163877 168898 167941 170205 169999 168031 TB 168098 168686 CV (%) 1,3 1,1 Tỷ lệ thu hồi (%) 99,7 Kết thực nghiệm cho thấy, tỷ lệ thu hồi nội chuẩn đạt 99,7% (thỏa mãn điều kiện nằm khoảng 30 – 110%) CV% nồng độ IS ≤ 15% (1,3 1,1%) Do qui trình xử lý mẫu huyết tương nghiên cứu phù hợp để chiết tách chất nội chuẩn 41 3.2.5.2.Tỷ lệ thu hồi RIF Chuẩn bị lô mẫu QC mục 2.3.1 xử lý mẫu chuẩn RIF pha huyết tương theo phương pháp xây dựng Tiến hành sắc ký, xác định nồng độ RIF có mẫu Song song, định lượng mẫu chuẩn pha dung môi pha mẫu (không qua xử lý) Kết xác định tỷ lệ thu hồi RIF trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8: Kết thẩm định tỷ lệ thu hồi RIF Đáp ứng RI F (mAU.s) STT LQC (≈0,6 µg/mL) MQC (≈9,0 µg/mL) HQC (≈18,0 µg/mL) Huyết Dung Huyết Dung Huyết Dung tương môi tương môi tương môi 13614 12661 198897 191051 395893 388350 13280 12541 201631 191605 399660 385584 13188 12540 201283 189818 397386 377560 13084 12588 203755 190974 400252 382496 12864 12653 196816 188198 405840 384346 13259 12938 192219 188601 397722 382187 TB 13215 12654 199100 190041 399459 383421 CV (%) 1,9 1,2 2,1 0,7 0,9 1,0 Tỷ lệ thu hồi (%) 104,4 104,8 104,2 Kết thực nghiệm cho thấy khoảng nồng độ (0,6; 9,0; 18,0 µg/mL), phương pháp cho hiệu suất chiết nằm khoảng 30 – 110% ( 104,4 ; 104,8 ; 104,2%), giá trị CV% nồng độ RIF ≤ 15% (từ 0,7 – 2,1%) Do phương pháp xử lý mẫu xây dựng phù hợp để chiết tách RIF từ huyết tương Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 42 3.2.6 Độ ổn định mẫu huyết tương 3.2.6.1.Độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kỳ đông – rã đông Pha mẫu LQC HQC mục 2.3.1 tiến hành mục 2.3.3.7 Kết xác định nồng độ RIF mẫu LQC, HQC sau chu kỳ đông – rã mẫu tiến hành phân tích sau pha (nồng độ ban đầu) trình bày bảng 3.9: Bảng 3.9: Kết độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kỳ đông–rã Nồng độ (µg/mL) Mẫu Mẫu LQC (≈0,6 µg/mL) Mẫu HQC (≈18,0 µg/mL) Ban đầu Sau chu kỳ đông- rã Ban đầu Sau chu kỳ đông- rã 0,612 0,561 17,487 18,159 0,549 0,599 18,520 17,884 0,574 0,635 18,281 17,530 0,582 0,502 17,832 17,642 0,551 0,499 18,310 17,282 0,567 0,502 18,605 17,765 TB 0,573 0,550 18,172 17,710 CV (%) 4,1 10,6 2,4 1,7 Độ lệch (%) -4,0 -2,5 Kết cho thấy, nồng độ RIF mẫu sau chu kỳ đông – rã đông sai khác so với nồng độ ban đầu không 15% (LQC: -4,0% HQC: -2,5%) giá trị CV% kết định lượng ≤ 15% Như mẫu huyết tương ổn định sau chu kỳ đông – rã đông 3.2.6.2.Độ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ phòng thời gian ngắn Pha mẫu LQC HQC mục 2.3.1 tiến hành mục 2.3.3.7 Kết xác định nồng độ RIF mẫu LQC, HQC để nhiệt độ phòng sau nồng độ RIF xử lí sau rã đơng trình bày bảng 3.10 43 Bảng 3.10: Kết độ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ phòng thời gian ngắn: Nồng độ (µg/mL) Mẫu Mẫu LQC (≈0,6 µg/mL) Mẫu HQC (≈18,0 µg/mL) Xử lý Sau Xử lý Sau 0,586 0,551 16,583 16,380 0,578 0,568 16,649 16,108 0,576 0,566 15,933 15,986 0,570 0,575 16,558 15,903 0,587 0,577 16,167 16,363 0,562 0,573 16,541 16,440 0,577 0,568 16,405 16,197 1,7 1,6 1,8 1,4 TB CV (%) Độ lệch (%) -1,4 -1,3 Kết cho thấy, nồng độ RIF mẫu xử lí sau để nhiệt độ phòng sai khác so với nồng độ mẫu xử lí khơng q 15% (LQC: -1,4% HQC: -1,3%) giá trị CV% kết định lượng ≤ 15% Như mẫu huyết tương ổn định nhiệt độ phòng sau 3.2.6.3.Độ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ -800C thời gian dài Pha mẫu LQC HQC mục 2.3.1 tiến hành mục 2.3.3.7 Trong khuôn khổ phạm vi làm khóa luận nên chúng tơi tiến hành thử độ ổn định mẫu huyết tương sau 21 ngày Kết xác định nồng độ RIF mẫu LQC, HQC sau 21 ngày mẫu tiến hành phân tích sau pha (nồng độ ban đầu) trình bày bảng 3.11 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 44 Bảng 3.11: Kết độ ổn định mẫu huyết tương thời gian dài Nồng độ (µg/mL) Mẫu Mẫu LQC (≈0,6 µg/mL) Mẫu HQC (≈18,0 µg/mL) Ban đầu Sau 21 ngày Ban đầu Sau 21 ngày 0,612 0,580 17,487 16,504 0,549 0,603 18,520 18,009 0,574 0,576 18,281 17,559 0,582 0,579 17,832 18,006 0,551 0,614 18,310 17,627 0,567 0,597 18,605 18,320 0,573 0,591 18,172 17,671 4,1 2,6 2,4 3,6 TB CV (%) Độ lệch (%) 3,3 -2,8 Kết cho thấy, nồng độ RIF mẫu sau 21 ngày sai khác so với nồng độ ban đầu không 15% (LQC: 3,3 % HQC: -2,8%) giá trị CV% kết định lượng ≤ 15% Như mẫu huyết tương ổn định sau nhiệt độ -80 0C khoảng thời gian 21 ngày  Nhận xét chung: Từ kết thẩm định độ đặc hiệu – chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ - độ xác, tỷ lệ thu hồi, nghiên cứu độ ổn định thu cho thấy phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích dùng sinh học Chúng cho phương pháp hoàn toàn phù hợp để định lượng rifampicin huyết tương áp dụng để định lượng rifampicin huyết tương người tình nguyện nghiên cứu sinh khả dụng đánh giá tương đương sinh học chế phẩm chứa rifampicin điều trị 45 3.3 BÀN LUẬN 3.3.1 Phương pháp xử lý mẫu huyết tương có Rifampicin Xử lý mẫu giúp loại bỏ nhiều thành phần tạp chất có mẫu, tạo điều kiện thuận lợi cho trình phân tách, định lượng rifampicin phương pháp HPLC Dựa vào đặc tính rifampicin, tham khảo số tài liệu khảo sát thực tế xây dựng phương pháp xử lý mẫu dùng định lượng rifampicin huyết tương So với phương pháp SPE, phương pháp xử lý mẫu sử dụng khóa luận – tủa protein với dung môi MeOH – đơn giản, dễ dàng thực điều kiện phòng thí nghiệm khơng đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt, dễ dàng triển khai tiết kiệm mặt chi phí, đồng thời hiệu suất chiết cao nên tạo điều kiện tối ưu cho định lượng RIF huyết tương Phương pháp xử lý mẫu tương đồng với nghiên cứu tác giả R.Panchagnula [18] AK.Hemanth Kumar [11] 3.3.2 Phương pháp định lượng rifampicin huyết tương Phương pháp HPLC định lượng rifampicin huyết tương sử dụng nghiên cứu thẩm định theo tiêu US-FDA bao gồm: độ đặc hiệu – chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ - độ xác, tỷ lệ thu hồi, nghiên cứu độ ổn định Với điều kiện sắc ký không phức tạp, dễ dàng triển khai phòng thí nghiệm Việt Nam, chất phân tích rifampicin tách hồn tồn khỏi thành phần tạp có huyết tương với thời gian triển khai sắc ký phút Thời gian triển khai sắc ký không dài cho phép định lượng số lượng mẫu lớn ngày, giúp tiết kiệm thời gian chi phí, đặc biệt điều kiện hạn hẹp thiết bị đại tài So với nghiên cứu Co, B G, Wagan, E G, Lagdameo, E E, Molinar, Adelaida M [14] có sử dụng chất nội chuẩn dipyridamol phương pháp sử dụng đề tài có khoảng nồng độ tuyến tính rộng (từ 0,20 đến 20,0 µg/mL so với 0,50 đến 20 µg/mL) Khoảng nồng độ tuyến tính phương pháp chưa Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 46 kết Lau YY, Hanson GD, Carel BJ (từ 0,50 đến 35 µg/mL) với phương pháp xử lý mẫu SPE [15] điểm có nồng độ cao đường chuẩn (20 µg/mL) nằm khoảng từ – lần giá trị Cmax (7 – µg/mL) nên khoảng nồng độ tuyến tính đáp ứng yêu cầu nghiên cứu Giá trị giới hạn định lượng (LLOQ) phương pháp sử dụng đề tài thấp 0,20 µg/mL thấp so với nghiên cứu Co, B G, Wagan, E G, Lagdameo, E E, Molinar, Adelaida M [14]; Lau YY, Hanson GD, Carel BJ [15] nên phương pháp có độ nhạy cao xác Độ ổn định phương pháp: tiến hành đánh giá tiêu độ ổn định phương pháp, cho thấy sai khác nhỏ nồng độ RIF sau chu kỳ đông rã, sau thời gian nhiệt độ phòng sau thời gian 21 ngày so với dung dịch sau pha, đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích dịch sinh học Tuy nhiên, khuôn khổ luận văn tốt nghiệp dược sỹ đại học nên chưa thẩm định đầy đủ tiêu như: độ ổn định dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn nội gốc độ ổn định mẫu huyết tương với thời gian dài để phục vụ nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.KẾT LUẬN Qua trình thực đề tài, chúng tơi đạt mục tiêu đề sau: Xây dựng quy trình phân tích RIF huyết tương cách tương đối hoàn thiện bao gồm xử lý mẫu điều kiện sắc ký Cụ thể là:  Quy trình xử lí mẫu: -Mẫu huyết tương để rã đơng nhiệt độ phòng -Ngay sau rã đơng, lấy 0,5 mL huyết tương thêm Vitamin C (nồng độ khoảng 1,0 mg/mL), thêm 50 L dung dịch nội chuẩn 1,0 mL MeOH -Lắc xoáy 15 giây, ly tâm 10000v/phút x phút, hút lớp dung môi, tiêm sắc ký  Điều kiện sắc ký: -Cột sắc ký: Rp18, 250x4,6 mm, µm Bảo vệ cột Rp18, x mm, 5µm -Pha động: MeOH – MeCN – đệm phosphat 0,02M pH 4,5 tỷ lệ 48,8 : 16,2 : 35 -Tốc độ dòng: 0,01 – 6,50 phút: 1,5 mL/phút 6,51 – 9,51 phút: 2,0 mL/phút -Detector: UV,  = 337 nm -Thể tích tiêm: 50 µL -Autosampler: 40C Tồn q trình xử lý mẫu phân tích sắc ký tiến hành điều kiện tránh ánh sáng Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng RIF với tiêu: độ đặc hiệu – chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ - độ lặp lại, tỷ lệ thu hồi, nghiên cứu độ ổn định Kết cho thấy: - Phương pháp có độ đặc hiệu – chọn lọc với RIF - Có tương quan tuyến tính chặt chẽ đáp ứng phân tích nồng độ RIF khoảng nồng độ khảo sát với r > 0,999 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 48 - Phương pháp có độ tốt (88,0 – 107,8 %), độ lặp lại với giá trị CV% ≤ 15% Đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích chất dịch sinh học US – FDA 4.2.KIẾN NGHỊ Ứng dụng phương pháp để định lượng RIF huyết tương người tình nguyện nghiên cứu sinh khả dụng đánh giá tương đương sinh học chế phẩm có chứa RIF thị trường Tiếp tục nghiên cứu định lượng RIF huyết tương bệnh nhân sử dụng thuốc chống lao phối hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội tr 1008 – 1010 Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt Nam IV, tr 546 – 550 Bộ Y tế (2007), Dược lý học, trường Đại học Dược Hà Nội, tập 2, Nhà xuất Y học, tr.185 – 186, 188 – 190 Bộ Y tế (2007), Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập 2, Nhà xuất Y học, tr 175 – 176 Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích, Trường đại học Dược Hà Nội, tập 2, Nhà xuất Y học, tr 123 – 138, 142 – 143, 168 – 188 Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, tr 84 – 95, 104 – 110 Bộ Y tế (2010), Hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/ tương đương sinh học đăng ký thuốc, số 08/2010/TT-BYT Tạ Mạnh Hùng (2006), “Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học viên nang Cefaclor Stada® 250 sản xuất Việt Nam”, Luận văn Thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Lê Thị Luyến (2005), “Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao định lượng Rifampicin huyết tương người uống đồng thời rifampicin – pyrazinamid – isoniazid”, tạp chí dược học, số 347, tr.32 – 35 10 Nguyễn Thị Nhung (2011), “Xây dựng phương pháp định lượng acid fenofibric huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học khóa 2005 – 2010, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Tiếng Anh: 11 AK Hemanth Kumar, I Chandra, R Geetha, KS Chelvi, V Lalitha, G Prema (2004), “A validated high-performance liquid chromatography method for the determination of rifampicin and desacetyl rifampicin in plasma and urine”, The Indian Journal of Pharmacology, Volume 36, Issue 4, p 231 – 233 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 12 A.L Allanson, M.M Cotton, J.N.A Tettey, A.C Boyter (2007), “Detemination of rifampicin in human plasma and blood spots by high performance liquid chromatography with UV detection: A potential method for therapeutic drug monitoring”, Journal of Pharmaceutical anh Biomedical Analysis, Volume 44, Issue 4, p 963 – 969 13 British Pharmacopoeia 2009, pp.5206 – 5208 14 Co, B G, Wagan, E G, Lagdameo, E E, Molinar, Adelaida M (2003), “The quantification of rifampicin in human plasma using high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet”, Science and Technology Research Colloquium 15 Lau YY, Hanson GD, Carel BJ (1996), “Determination of rifampin in human plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection”, Journal of Chromatography, Vol 676(1):147-152 16 Michael W.Dong and Ahuja Satinder (2005), Handbook of pharmaceutical analysis by HPLC, United Kingdom, p.19 – 45 17 Pharmacopoeia of the people’s republic of China (2005), Volume II, pp 294 – 296 18 R Panchagnula, A Sood, N Sharda, K Kaur, C.L Kaul (1999), “Determination of rifampicin and its main metabolite in plasma and urine in presence of pyrazinamide and isoniazid by HPLC method”, Journal of Pharmaceutical anh Biomedical Analysis, Volume 18, Issue 6, p 1013 – 1020 19 The United Stated Phamcopenia 32 (2009), Volume &2, pp 3501 – 3502 20 WHO (2009), Global tuberculosis control: epidemilogy, strategy, financing: WHO report 2009 21 WHO (2009), The Global TuberculosisEpidemic WHO factsheet 22 Yuri Karakevich & Rosario Lobrutto (2007), HPLC for Pharmaceutical Scientists, p.139 – p.188, p.75 – p.132 Trang Web: 23 www.thuocbietduoc.com.vn ... phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  NGUYỄN VĂN ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG RIFAMPICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS: Trần... giá tương đương sinh học chế phẩm chứa hoạt chất rifampicin, tiến hành đề tài: Nghiên cứu định lượng rifampicin huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao với mục tiêu: Khảo sát, xây dựng phương pháp định. .. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 .Định nghĩa Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) kỹ thuật phân tích dựa sở phân tách chất pha tĩnh chứa cột nhờ dòng di chuyển pha động lỏng áp suất cao Pha tĩnh