BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC HIHI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA VI RÚT PRRS GENOTYPE BẮC MỸ XÁC ĐỊNH ĐƯỢC TẠI TP HCM Ngành học : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố : 2006 – 2010 Sinh viên thực : PHAN THỊ ANH VĂN Tháng 7/2010 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC HIHI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG MÃ HĨA PROTEIN NSP2 CỦA VI RÚT PRRS GENOTYPE BẮC MỸ XÁC ĐỊNH ĐƯỢC TẠI TP HCM Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI PHAN THỊ ANH VĂN KS VÕ KHÁNH HƯNG Tháng 7/2010 i LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin gửi lời cám ơn đến ba mẹ yêu thương tạo điều kiện cho học tập Em cảm ơn anh hai động viên em suốt bốn năm học qua Em xin chân thành cảm ơn: ¾ Ban giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học, tất quý thầy cô dạy kiến thức hay phong cách làm việc tốt cho em suốt năm học ¾ Tập thể cán quý Thầy - Cô Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian thực tập Em xin trân trọng biết ơn Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải hết lòng hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến: ¾ KS Võ Khánh Hưng tận tình giúp đỡ dẫn cho em suốt trình thực đề tài ¾ Các anh, chị nhóm nghiên cứu, tận tình giúp đỡ dẫn em lúc khó khăn ¾ Các bạn nhóm nghiên cứu chia động viên tơi q trình làm việc chung ¾ Các bạn lớp DH06SH học tập suốt thời gian học Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2010 Phan Thị Anh Văn i TĨM TẮT Việc phân tích di truyền virus PRRS có ý nghĩa quan trọng dịch tễ học Từ di truyền ta xác định nguồn gốc phát sinh dịch bệnh, từ có biện pháp hữu hiệu để phòng chống ngăn ngừa lây lan bệnh Việt Nam Chúng tiến hành nội dung nghiên cứu sau: khuếch đại vùng gen mã hóa nsp2 phản ứng RT-PCR với cặp mồi tham khảo Youjun Feng ctv (2007) phân tích di truyền dựa vào vùng gen Xây dựng qui trình xác định đồng nhiễm hai chủng Bắc Mỹ cổ điển Trung Quốc độc lực cao Kết đạt được: Ly trích giải trình tự vùng gen mã hóa protein Nsp2 chủng virus phân lập Tp.HCM, tỉnh phía Bắc Việt Nam (Hà Nội, Bắc Giang) chủng virus vaccine BSL-PS100, ingelVac Trên di truyền dựa tên trình tự mã hóa protein nsp2 (Xây dựng phần mền DNAstar), nhóm vi rút PRRS Tp.HCM, phía Bắc vi rút vaccine BSL-PS100 thuộc nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.2, nhóm với chủng vi rút PRRS độc lực cao Trung Quốc (93,9 - 95,7%) so với chủng vi rút PRRS phân lập Quảng Nam (07QN) 94,6 - 96,2% Độ tương đồng BSLPS100 so với chủng Tp.HCM 96,2 - 100% ii SUMMARY A phylogenetic tree of porcine reproduction and respiratory virus is very important to epidemiology From a phylogenetic tree, the origin of epidemic could be known so that the effective policies established to control and protect the widespread of reproduction and respiratory virus in Ho Chi Minh City We conduct research content following: amplified genes nsp2 by RT-PCR with primers designed by Youjun Feng et al., (2007) and genetic analysis based on this gene Determine the co-infected of two strains: North American and Chinese highly pathogenic Results obtained from the study: Sequencing the nsp2 gene of the strains obtained in Ho Chi Minh City, Hanoi, Bac Giang and BSL- PS100 as well as IngelVac vaccine strains Phylogenetic based on nsp2 gene (Built by software DNAstar) showed the PRRS virus in Ho Chi Minh City, Hanoi, Bac Giang and vaccinal virus belonged to American genotype, subgroup 2.2, and to the same group of highly pathogenic PRRS China strain (93.9 to 95.7%) The similarity of the strains was about 94.6 to 96.2% in comparring with PRRS virus strains isolated in Quang Nam (07QN) The similarity of vaccinal virus strains BSL- PS100 was about 96.2 to 100% in comparring with PRRS virus strains in Ho Chi Minh City iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix Chương MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 1.2.2 Yêu cầu 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) 2.1.2 Lịch sử bệnh 2.1.2 Vi rút gây bệnh hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo 2.1.3 Các chủng vi rút phân bố 2.1.4 Cấu trúc gen vi rút PRRS 2.2 Protein không cấu trúc Nsp2 2.3 Sự khác biệt trình tự hai chủng PRRSV 12 2.4 PRRSV chủng độc lực cao Trung Quốc 13 2.5 Các phương pháp kiểm tra PRRS phòng thí nghiệm 15 2.6 Sơ lược số tài liệu nghiên cứu liên quan 16 2.6.1 Trên giới 16 2.6.2 Trong nước 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Thời gian địa điểm 20 3.2 Nội dung nghiên cứu 20 iv 3.3 Vật liệu hóa chất 20 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 20 3.3.2 Hóa chất 20 3.4 Phương pháp tiến hành 22 3.4.1 Thu nhận mẫu 22 3.4.2 Ly trích RNA 22 3.4.2.1 Ly trích RNA từ huyết 22 3.4.2.2 Ly trích RNA từ mẫu phổi 23 3.4.2.3 Align mồi 24 3.5 Bố trí thí nghiệm nội dung tiến hành thí nghiệm 26 3.5.1 Bố trí thí nghiệm 26 3.5.2 Nội dung tiến hành thí nghiệm 26 3.5.2.1 Thực phản ứng nested RT_PCR 26 3.5.2.2 Phản ứng RT-PCR 30 3.5.2.3 Quy trình xác định đồng nhiễm 32 3.5.2.4 Phân tích trình tự 32 Chương KẾT QUẢ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết nested RT-PCR khuếch đại khung đọc mở ORF7 35 4.2 Kết RT-PCR chủng vaccine thực địa 36 4.3 Kết khảo sát phản ứng phát đồng nhiễm 37 4.4 Phân tích di truyền mẫu nghiên cứu 38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT AP Accessary Protein BHK-21 Baby Hamster Kidney-21 DIVA Differentiated Infected Vaccinated Animals EAV Equine Arteritis Virus EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein ELISA Enzyme Linked-Immonosorbent Assay FMD Foot and mouth disease GEP Green Fluorescent Protein GP Glycoprotein HA Hemagglutinin HEL Helicase HP-PRRS Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome HV Hypervariable LDV Lactate Dehydrogenase Virus LV Lelystad Virus M Membrane MP Main Protease MSD Mystery Swine Disease N NendoU Nsp Nonstructural protein ORFs Open Reading Frames PCP Papain like Cystein Protease PEARS Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome PRRSV Porcine Reproductive and respiratory Syndrome Virus QN Quảng Nam RdRp RNA dependent RNA polymerase vi RFS Ribosomal Frameshifting Site sgmRNAs Subgenomic mRNAs SHFV Simian Hemorrhagic Fever Virus SIRD Swine Infertility and Respiratory Disease TRS Transcription Regulating Sequence UTR Untranslated region Z Zinc-binding domain vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Sản phẩm dịch mã ORFs Bảng 3.1 Thành phần phản ứng RT-PCR với primer Outer 28 Bảng 3.2 Quy trình nhiệt phản ứng RT-PCR cặp primer OF7 OR7 28 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng nested- PCR với cặp primer inner 29 Bảng 3.4 Chu kì nhiệt cho nested-PCR 29 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen mã hóa Nsp2 31 Bảng 3.6 Qui trình nhiệt phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen mã hóa nsp2 31 Bảng 3.7 Các chủng vi rút mẫu bệnh phẩm giải trình tự 33 Bảng 3.8 Các chủng tham chiếu Việt Nam 33 Bảng 3.9 Các chủng virus tham khảo giới 34 Bảng 4.1 Kết xét nghiệm phương pháp nested RT-PCR 35 viii Chương KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Kết nested RT-PCR khuếch đại khung đọc mở ORF7 Việc tiến hành ly trích RNA thực phản ứng nested RT-PCR với cặp mồi Mardassi ctv, 1994 Pesch, 2003 xác định phân biệt virus PRRS kiểu gen Bắc Mỹ kiểu gen Châu Âu cho kết hình 4.1 Hình 4.1 Kết nested RT_PCR khuếch đại khung đọc mở ORF7.(-U): ký hiệu cho kiểu gen Châu Mỹ, (E): ký hiệu cho kiểu gen Châu Âu Băng có kích thước 241pb : virus PRRS kiểu gen Châu Âu; 337bp virus PRRS kiểu gen Châu Mỹ Bảng 4.1 Kết xét nghiệm nested RT-PCR mẫu bệnh phẩm từ heo có triệu chứng bệnh PRRS TP HCM, Hà Nội Bắc Giang Nguồn Số lượng TP HCM 12 Hà Nội Bắc Giang Kết EU US US + EU 11 2 16 16 EU: kiểu gen Châu Âu, US: kiểu gen Bắc Mỹ; US + EU: nhiễm hai chủng Bảng 4.1 cho ta thấy, số mẫu nhiễm kiểu gen US 11 12 mẫu bệnh phẩm khảo sát mẫu nhiễm lúc hai chủng 100% chủng Hà Nội Bắc Giang nhiễm PRRS kiểu gen US Kết này, cho thấy tỉ lệ mẫu bệnh phẩm nhiễm PRRS cao mẫu bệnh phẩm lấy từ heo có triệu chứng lâm sàng nhiễm bệnh PRRS 34 Các mẫu nhiễm chủng Bắc Mỹ, tiến hành khuếch đại vùng gen mã hóa nsp2 4.2 Kết RT-PCR chủng vaccine thực địa Việc ly trích RNA tiến hành phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng trình tự mã hóa protein nsp2 khơng gặp nhiều khó khăn từ vaccine BSL-PS100 Besta – Singapore (vaccine khuyến cáo sử dụng Việt Nam, chưa cơng bố trình tự chủng vi rút dùng sản xuất vaccine) vaccine Ingelvac PRRS MLV (Hình 4.1) Hình 4.2 Kết RT-PCR vùng trình tự mã hóa Nsp2 AmerVac: vaccine chủng PRRS châu Âu, ingelVac: vaccine chủng bắc Mỹ, BSL-PS: vaccine BSLPS100, PL3: mẫu lấy từ thực địa Ở hình 4.1, có sản phẩm RT-PCR vùng gen mã hóa protein Nsp2 virus vaccine BSL-PS100 xuất ngang hàng với virus thực địa (PL3) mà tơi lấy mẫu, băng có kích thước khoảng 666 pb Điều chứng tỏ virus vaccine BSL-PS100 có vùng gen mã hóa protein Nsp2 gen Vaccine IngelVac PRRS MLV sau phản ứng RT-PCR vùng gen mã hóa protein nsp2 xuất băng cao so với băng đối chứng dương chủng vi rút thực địa khoảng gần 100bp, băng có kích thước khoảng 750 pb Điều phù hợp với kết align cặp mồi Youjun Feng cộng sự, (2007) thiết kế, kết align (Hình 2.1) cho thấy với cặp primer bắt khuếch đại vùng mã hóa protein Nsp2 hai chủng Bắc Mỹ cổ điển Trung Quốc độc lực cao Tuy nhiên, chủng PRRSV Trung Quốc độc lực cao có 35 số đột biến aa protein nsp2, tiêu biểu có hai đột biến đặc trưng: đột biến luecine vị trí 482aa đột biến liên tục 29 aa từ vị trí từ aa 534 – aa 562, đột biến làm cho vùng trình tự mã hóa Nsp2 chủng Trung Quốc ngắn so với chủng Bắc Mỹ khoảng gần 100 Nucleotide Do đó, cặp primer dùng để phát chủng PRRS chủng Trung Quốc Kết cho thấy cặp primer khuếch đại vùng gen mã hóa nsp2 PRRSV chủng Bắc Mỹ cổ điển chủng độc lực cao từ Trung Quốc 4.3 Kết phát đồng nhiễm Từ kết chạy single chủng ingelVac, BSL mẫu thực địa dương tính với Trung Quốc, làm sở cho bước đầu thực quy trình chẩn đốn đồng nhiễm hai chủng vi rút Bắc Mỹ cổ điển Trung Quốc Hình 4.3 Sản phẩm RT-PCR mẫu trộn chủng TQ vaccine ingelVac với cặp mồi Youjun Feng cộng sự, (2007) thiết kế Tr: trộn 1p6 với IngelVac Hình 4.3 cho thấy sản phẩm RT- PCR mẫu trộn hai chủng Trung Quốc (10P6) chủng Bắc Mỹ (IngelVac) cho hai băng với kích thước tương ứng với chủng chạy single, kích thước 750 pb 666 pb Tuy nhiên, nồng độ sản phẩm RT-PCR chủng có chệnh lệch Vì ban đầu cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho chủng Trung Quốc (Youjun Feng ctv.,2007) Hình 3.1 kết align 36 mồi cho thấy cặp mồi đặc hiệu với chủng Trung Quốc Trên chủng Bắc Mỹ có sai khác số nucleotide Do đó, trộn hai chủng xảy tính cạnh tranh bắt cặp với mồi Theo sản phẩm chủng Trung Quốc sau RT-PCR nhiều (cho băng đậm hơn), sản phẩm chủng Bắc Mỹ (cho băng nhạt hơn) Vấn đề đặt ra, phải khảo sát nồng độ primer nhiệt độ bắt cặp phản ứng RTPCR để hạn chế việc bắt cặp ưu chủng Trung Quốc Đồng thời, xác định giới hạn mật độ nhiễm hai chủng mà phương pháp chẩn đốn áp dụng Trong thời gian tiến hành nghiên cứu đề tài này, điều kiện thực thí nghiệm khơng cho phép, nên việc trộn với tỉ lệ khác hai chủng chưa thực 4.4 Phân tích di truyền mẫu nghiên cứu Sản phẩm RT - PCR vaccine chủng phân lập giải trình tự cơng ty Nam Khoa Tp HCM Sau giải trình tự vùng gen (Hình 4.3) tơi nhận thấy, vùng gen mã hóa nsp2 (ORF1a) : Hình 4.4 Kết giải trình tự virus PRRS vaccine BSL-PS100 37 Chủng vi rút vaccine BSL-PS100 (được kí hiệu BSL) nằm nhóm Bắc Mỹ, phân nhóm 2.2, nằm phân nhóm với chủng vi rút thực địa phân lập Tp.HCM chủng vi rút thực địa phân lập phía Bắc (Hà Nội Bắc Giang) Độ tương đồng chủng BSL so với chủng Trung Quốc (07HEBTJ, 07BJ) chủng Quảng Nam (07QN) 95,5 – 96,2 % trình tự nucleotide So với chủng gốc Bắc Mỹ (nhóm 2.1) 73,1 – 87,8 % So với chủng Châu Âu (Nhóm 1) 41,6 – 42,9 % So với chủng vi rút thực địa phân lập TP.HCM 96,2- 100%, giống 100% với chủng T3, T4 So với chủng phân lập phía Bắc 93,2 - 93,4% Tuy nhiên, nghiên cứu Nguyễn Ngọc Hải (2009) khung đọc mở ORF5 ORF7, vaccine BSL-PS100 thuộc nhóm Bắc Mỹ, phân nhóm 2.1 Trên khung đọc mở ORF5, độ tương đồng vi rút vaccine BSL-PS100 so với chủng gốc châu Mỹ, VR2332, 99,3% mặt nucleotide so với vaccine RespPRRSV MLV chủng S1 99,7% Trên khung đọc mở ORF7, tương đồng 99,7% so với VR 2332, tương đồng so với hai chủng vi rút PRRS 1BRVT/VN, 6/BRVT/VN 91,1% (dẫn liệu Võ Khánh Hưng, 2009) Như vậy, chủng vi rút vaccine BSL-PS100 chủng vi rút tái tổ hợp hai chủng PRRSV Bắc Mỹ cổ điển PRRSV Trung Quốc độc lực cao Kết phân tích trình tự sản phẩm RT-PCR chủng vi rút vaccine IngelVac, vi rút chủng vi rút thuộc nhóm Bắc Mỹ, phân nhóm 2.1 Điều chứng tỏ cho giả thiết ban đầu chúng tơi đúng, có nghĩa cặp mồi Youjun Feng cộng sự, (2007) thiết kế bắt hai chủng Bắc Mỹ cổ điển Trung Quốc Nhưng chủng Bắc Mỹ cổ điển cho kích thước băng dài khoảng gần 100 Nucleotide (hình 4.1) Điều phù hợp với nghiên cứu trước Gao ctv (2004), Tian ctv (2007), chủng vi rút Trung Quốc độc lực cao có hai đột biến protein nsp2 (ORF1): đột biến thứ đột biến leucine aa 482 đột biến thứ hai đoạn liên tục 29 aa từ 534 – aa 562 (Hình4.3A) số vùng vài aa khác (Hình 4.3B) Kết align trình tự chủng vaccine BSL, vaccine IngelVac chủng vi rút thực địa phân lập Tp.HCM phía Bắc nước ta: 38 A B Hình 4.5 Kết trình tự align chủng vaccine BSL, IngelVac chủng vi rút thực địa phân lập Tp HCM phía Bắc nước ta Hộp mầu đỏ: chủng thực địa TP.HCM; hơp xanh nhạc: chủng thực địa phía Bắc Việt Nam; hộp xanh đậm: vaccine ingelVac Cây di truyền virus PRRS dựa vùng gen mã hóa protein Nsp2 xây dựng theo chương trình phân tích trình tự DNAstar (Hình 4.5) Cây di truyền thiết lập từ chủng vi rút thực địa phân lập trại khác Tp HCM (Các chủng ký hiệu: T3, T4, T5, PL6) , chủng vi rút thực địa phân lập vùng khác phía Bắc nước ta, chủng Bắc Giang (Các chủng ký hiệu 1P6, 1P1, 5P5, 10P1) chủng Hà Nội (Chủng ký hiệu 12P5), chủng virus PRRS tham khảo từ Quảng Nam, Việt Nam năm 2007, 07QN/VN (Chủng có ký hiệu cuối QN/VN), hai chủng vaccine, chủng vaccine chưa biết nguồn gốc chủng vi rút BSL-PS100, chủng vaccine dòng châu Mỹ Ingelvac PRRSV MLV (Ingelvac PRRS) 15 chủng tham khảo từ ngân hàng gen (Bảng 3.9) Theo Nelsen ctv (1999) PRRSV chia làm hai kiểu gen Châu Âu Bắc Mỹ (Nelsen ctv, 1999) Trong kiểu gen Bắc Mỹ gồm có Bắc Mỹ cổ điển Trung Quốc độc lực cao (Gao ctv, 2004) Đặc trưng chủng Trung Quốc độc lực cao xuất đột biến 30 aa vùng gen mã hóa protein Nsp2 Đã có nhiều nghiên cứu 39 vùng gen mã hóa Nsp2, đặc biệt sau xảy đại dịch gây thiệt hại nặng cho ngành công nghiệp lợn Trung Quốc năm 2006, cơng trình nghiên cứu gao ctv 2004; Chen ctv, 2006; An ctv, 2007; Tian ctv, 2007 Cho thấy chủng biến PRRS độc lực cao Trung Quốc, chủng biến thể dòng Bắc Mỹ Hình 4.6 Cây di truyền PRRSV vẽ phần mền DNAstar dựa vùng gen mã hóa Nsp2 dạng Hình 4.5 di truyền xây dựng dựa vùng gen mã hóa protein Nsp2 (Vùng ORF1a) vi rút PRRS phần mền DNAstar Qua di truyền ta chia chủng PRRSV làm nhóm chính: nhóm (Dòng Châu Âu) với diện chủa chủng LV chủng đại diện cho vi rút PRRS dòng Châu Âu, nhóm (Dòng Châu Mỹ) với diện chủng VR2332 chủng đại diện cho vi rút PRRS dòng Châu Mỹ Độ tương đồng hai nhóm dựa vùng trình tự mã hóa Nsp2 40,5 43,5% (Phụ lục 1) mặt nucleotide Bên nhóm (chủng Châu Mỹ) ta chia thành phân nhóm: phân nhóm 2.1 gồm số vi rút gần với chủng gốc châu Mỹ VR2332 chủng vaccine 40 sống bị làm yếu RespPRRS MLV (tương đồng mặt nucleotide 81 - 81,3%) (Phụ lục1); Phân nhóm 2.2, gồm chủng vi rút Trung Quốc độc lực cao phân lập vào năm 1997 (CH1a) 2007 (07HBBTJ, 07BJ), chủng vi rút phân lập Việt Nam năm 2007 (07QN), chủng vi rút thực địa phân lập Tp.HCM phía Bắc Việt Nam, chủng phân nhóm tương đồng so với chủng Bắc Mỹ cổ điển gốc VR2332 74,4 - 79,8% trình tự nucleotide (Phụ lục1) Trong nhóm 2, phân nhóm 2.2 vaccine BSL-PS100 mà tơi tiến hành ly trích giải trình tự Độ tương đồng vi rút vaccine so với chủng Trung Quốc phân lập năm 1997 (CH1a) chủng động lực cao 2007 (7HBBTJ, 07BJ) 87,8 - 95,7% (Phụ lục 1) So với chủng châu Mỹ, VR2332, 74,6% mặt nucleotide Qua hình chúng tơi nhận thấy: nhóm vi rút PRRS phân lập Tp.HCM (T3, T4, T5, PL6), nhóm vi rút PRRS phân lập phía Bắc nước ta (12P5, 1P6, 5P5, 10P1) chủng vi rút tham khảo Quảng Nam năm 2007 nằm nhóm 2, phân nhóm 2.2 nằm nhóm với chủng vi rút Trung Quốc độc lực cao 1997, 2007 Các chủng phân lập Tp.HCM (T3, T4, T5, PL6) có độ tương đồng so với chủng vi rút phân lập trung Quốc phân lập năm 2007 (07HBBTJ, 07BJ) 93,9 95,7%, so với chủng vi rút phân lập Quảng Nam (2007) 94,6 - 96,2%, so với nhóm vi rút phân lập phía Bắc gồm Hà Nội (12P5) Bắc Giang (1P1, 1P6, 5P5, 10P1) 91,4 - 93,4% 91,6 - 93,2% Các chủng vi rút phân lập Tp.HCM có độ tương đồng thấp so với chủng Bắc Mỹ 72,4 - 74,6%, so với nhóm (Châu Âu) 41,2 - 42,9% Đối với chủng vi rút phân lập Hà Nội (12P5) Bắc Giang (1P1, 1P6, 5P5, 10P1) có độ tương đồng so với chủng Trung Quốc phân lập 2007 95,5-95,9% Điều chứng tỏ chủng vi rút PRRS nước ta có giao lưu lẫn có liên hệ chặt chẽ với chủng vi rút độc lực cao Trung Quốc phân lập năm 2007 Nhìn chung, dựa vào mối quan hệ di truyền mà di truyền xây dựng từ vùng trình tự mã hóa protein nsp2, nhận thấy vi rút PRRS TP.HCM mà tiến hành nghiên cứu so sánh với chủng vi rút phân lập từ tỉnh phía Bắc nước ta thuộc nhóm 2, phân nhóm 2.2 với chủng độc lực cao phân lập từ Trung Quốc năm gần Trên vùng trình tự mã hóa Nsp2, nhóm chưa có biến đổi di truyền cao so với chủng Trung Quốc, biến đổi chủng phía Bắc Tp.HCM, chủng vi rút mà tơi tiến hành nghiên cứu Tp.HCM 41 chủng từ phía Bắc Việt Nam có giao lưu có nguồn gốc từ Trung Quốc Đặc biệt, độ tương đồng chủng Tp.HCM phía Bắc có độ tương đồng cao với chủng vaccine BSL-PS100 93,2-100% (Phụ lục 1) so với chủng vaccine IngelVac 74,2-74,9% (Phụ lục 1) Chính độ tương đồng này, ảnh hưởng đến hiệu sử dụng vaccine Vì để nâng cao hiệu sử dụng vaccine ta cần xây dựng cho đồ dịch tễ virus PRRS cho vùng bệnh nói riêng nước nói chung 42 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trên di truyền dựa vào vùng gen mã hóa protein nsp2 (xây dựng DNAstar): • Nhóm vi rút phân lập TP HCM tỉnh phía Bắc Việt Nam thuộc nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.2 với chủng vi rút PRRS độc lực cao Trung Quốc ( 93,9 - 95,7%) • Chủng vaccine BSL-PS100 thuộc nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.2, tương đồng so với chủng TP.HCM 96,2 - 100%, 100% với chủng T3, T4, chủng phân lập phía Bắc 93,2 - 93,4% chủng vaccine ingelVac 74,4% • Cặp mồi Youjun Feng cộng sự, (2007) thiết kế xác định đồng nhiễm hai chủng Bắc Mỹ cổ điển Trung Quốc độc lực cao 5.2 Đề nghị • Tiếp tục khuếch đại phân tích trình tự vùng mã hóa nsp2 khu vực khác đất nước, để xem biến đổi chủng vùng mã hóa nsp2 nhằm có độ tin cậy cao đồ dịch tễ virus PRRS Việt Nam • Tiến hành phân tích khác biệt trình tự amino acid nsp2 chủng virus PRRS (Ở Tp.HCM, vaccine, Trung Quốc) để có sở phân tích khía cạnh kháng ngun nsp2, ứng dụng sử dụng vaccine phòng bệnh • Hồn thiện quy trình xác định đồng nhiễm chủng Bắc Mỹ cổ điển Trung Quốc để áp dụng chẩn đoán vi rút PRRS 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Cục Chăn nuôi 2008 Báo cáo sản xuất chăn nuôi vùng Đông Nam Bộ Đặng Thùy Dương 2009 Chẩn đoán phân biệt virus chủng vaccine nhược độc hoang dại gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) Luận văn thạc sĩ, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Trần Thị Bích Liên Trần Thị Dân 2007 Xác định tỷ lệ nhiễm chủng vi rút PRRS số sở chăn nuôi heo miền Đông Nam Bộ Tạp chí KHKT Thú y tập XIV - số 6, 5-9 Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên, Trần Thị Dân Nguyễn Ngọc Tuân 2007 Chẩn đoán virut gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) kỹ thuật RT – PCR Tạp chí KHKT tập XIV, Số 5, 5-12 Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học Thú Y Nhà xuất Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh Võ Khánh Hưng 2009 Phân tích trình tự gen ORF5 ORF7 vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRSV) số tỉnh miền Nam Việt Nam Khóa luận tốt nghiêp, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Lê Văn Năm 2007 Khảo sát bước đầu biểu lâm sàng bệnh tích đại thể bệnh tai xanh heo (PRRS) số địa phương vùng đồng Bắc Bộ Tạp chí KHKT Thú y tập XIV - số 6, 13-18 Phòng Dịch Tễ - Cục Thú y 2007 Hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn Trung Tâm Chẩn đốn thú y TW, 2008 Kết nghiên cứu vi rút gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản http://lhhkhktbinhduong org.vn/index.php?mod=readn&id=273&cid=89&n=7 Tiếng anh 10 Allende R., T L Lewis, Z Lu, D L Rock, G F Kutish, A Ali, A R Doster, and F A Osorio 1999 North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome viruses differ in non-structural protein coding regions J Gen Virol 80:307–315 11 An TQ ctv 2007 Genetic diversity and phylogenetic analysis of glycoprotein of PRRSV isolates in mainland China from 1996 to 2006: coexistence of two NAsubgenotypes with great diversity Vet Microbiol 123:43–52 12 Andreyev, V G., Wesley, R D., Mengeling, W L., Vorwald, A C., and Lager, 1997 Genetic variation and phylogenetic relationships of 22 porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) field strains based on sequence analysis of open reading frame Arch Virol 142:993–1001 13 Bosch, B J., C A M de Haan, and P J M Rottier 2004 Coronavirus spike glycoprotein, extended at the carboxy terminus with green fluorescent protein, is assembly competent J Virol 78:7369–7378 44 14 Chen J., Liu T., Zhu C.G., Jin Y.F., Zhang Y.Z., 2006 Genetic Variation of Chinese PRRSV Strains Based on ORF5 Sequence Biochem Genet 44: 421–431 15 Chengmin Wang, Bin Wu, Said Amer, Jing Luo, Hongmei Zhang, Yunhai Guo, Guoying Dong, Baohua Zhao and Hongxuan He., 2010 Phylogenetic analysis and molecular characteristics of seven variant Chinese field isolates of PRRSV BMC Microbiology 2010, 10:146 16 Collins JE, Benfield DA, Christianson WT, Harris L, Hennings JC, Shaw DP, Goyal SM, McCullough S, Morrison RB, Joo HS Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs J Vet Diagn Invest 1992 Apr;4(2):117-26 17 Dal Young Kim., 2000 The Appication of a PRRSV reverse genetic system for the study of nonstructural protein (NSP) function D.V.M., Chungbuk National University, 2000 18 Den Boon,J A, Snijder, E J., Chirnside, E D., DE Wries F., Horzinek, M C and Sraan, W J M (1991) Equine arteritis virus is not a togavirus but belongs to the coronavirus superfamily Journal of Virology 65, 2910-2920 19 Den Boon, J A., K S Faaberg, J J M Meulenberg, A L M Wassenaar, P G W Plagemann, A E Gorbalenya, and E J Snijder 1995 Processing and evolution of the N-terminal region of the arterivirus replicase ORF1a protein: identification of two papainlike cysteine proteases J Virol 69:4500–4505 20 Elizabeth Brown, Steven Lawson, Craig Welbon ctv., 2009 Antibody Response to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Nonstructural Proteins and Implications for Diagnostic Detection and Differentiation of PRRSV Types I and II Clinical and Vaccine immunology, may 2009, p 628-635 21 Fang Y, Kim DY, Ropp S, Steen P, Christopher-Hennings J, Nelson EA and Rowland RR 2004 Heterogeneity in Nsp2 of European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated in the United States Virus Research 100: 229–235 22 Gall A Le, O Legeay , Bourhy H., Arnauld C., Albina E., and Jestin A 1998 Molecular variation in the nucleoprotein gene (ORF7) of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Virus Research 54 (1998) 9–21 23 Gao ZQ, Guo X and Yang HC (2004) Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus Archives of Virology 149: 1341–1351 24 Godeny EK, Chen L, Kumar SN, Methven SL, Koonin EV and Brinton MA Complete genomic sequence and phylogenetic analysis of the lactate dehydrogenase- elevating virus (LDV) Virology 1993 Jun;194(2):585-96 25 Han J, Wang Y and Faaberg KS (2006) Complete genome analysis of RFLP 184 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virus Research 122: 175– 182 26 Jun Han, Gongping Liu,† Yue Wang, and Kay S Faaberg 2007 Identification of Nonessential Regions of the nsp2 Replicase Protein of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Strain VR-2332 for Replication in Cell Culture J Virol doi:10.1128/JVI.00562-07 27 Kapur, V., Elam, M R., Pawlovich, T M and Murtaugh, M P (1996) Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus 45 isolates in the midwestern United States Journal of General Virology 77, 1271±1276 28 Lei Zhou, Jialong Zhang, Jingwen Zeng, Shuoyan Yin, Yanhua Li, Linying Zheng,Xin Guo, Xinna Ge, and Hanchun Yang., 2009 The 30-Amino-Acid Deletion in the Nsp2 of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Emerging in China Is Not Related to Its Virulence J Virol doi:10.1128/JVI.02678-08 29 Lei Zhou, Shuxian Chen, Jialong Zhang, Jingwen Zeng, Xin Guo, Xinna Ge, Dabing Zhang and Hanchun Yang., 2009 Molecular variation analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China Virus Res 2009 Oct;145(1):97-105 30 Meng, X J., Paul, P S., Halbur, P G., and Lum,M A (1995) Phylogenetic analyses of the putativeM (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): Implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A and Europe Arch Virol 140:745–755 31 Meulenberg, J J., M M Hulst, E J de Meijer, P L Moonen, A den Besten, E P de Kluyver, G Wensvoort, and R J Moormann 1993 Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV Virology 192:62–72 32 Meulenberg JJ, Petersen-den Besten A, De Kluyver EP, Moormann RJ, Schaaper WM, Wensvoort G Characterization of proteins encoded by ORFs to of Lelystad virus Virology 1995 Jan 10;206(1):155-63 33 Morozov I, Meng XJ and Paul PS (1995) Sequence analysis of open reading frames (ORFs) to of a U.S isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Archives of Virology 140: 1313–1319 34 Murtaugh, M P., Elam, M R., and Kakach, L T (1995) Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus Arch Virol 140:1451– 1460 35 Nelsen, C J., M P Murtaugh, and K S Faaberg., 1999 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents J Virol 73:270–280 36 Nelson, E A., J Christopher-Hennings, T Drew, G Wensvoort, J E Collins, and D A Benfield 1993 Differentiation of U.S and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies J Clin Microbiol 31:3184–3189 37 Oleksiewicz, M B., A Bøtner, P Toft, P Normann, and T Storgaard 2001 Epitope mapping porcine reproductive and respiratory syndrome virus by phage display: the nsp2 fragment of the replicase polyprotein contains a cluster of B-cell epitopes J Virol 75:3277–3290 38 Pedersen, K W., Y van der Meer, N Roos, and E J Snijder 1999 Open reading frame 1a-encoded subunits of the arterivirus replicase induce endoplasmic reticulum-derived double-membrane vesicles which carry the viral replication complex J Virol 73:2016–2026 39 Plagemann & Moennig, 1992 Lactate dehydrogenaseelevating virus, equine arteritis virus and simian hemorrhagic fever virus: a new group of positivestrand RNA viruses Advances in Virus Research 41, 99-192 46 40 Ropp, S L., Wees, C E., Fang, Y., Nelson, E A., Rossow, K D., Bien, M., Arndt, B., Preszler, S., Steen, P & other authors 2004 Characterization of emerging European-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the United States J Virol 78, 3684–3703 41 42 43 44 45 46 47 48 Snijder, E J., A L M Wassenaar, and W J M Spaan 1994 Proteolytic processing of the replicase ORF1a protein of equine arteritis virus J Virol 68:5755–5764 Snijder, E.J., Wassenaar, A.L., Spaan, W.J., Gorbalenya, A.E., 1995 The arterivirus Nsp2 protease An unusual cysteine protease with primary structure similarities to both papain-like and chymotrypsin-like proteases J Biol Chem 270, 16671-16676 Snijder, E J., and J J Meulenberg 1998 The molecular biology of arteriviruses J Gen Virol 79:961–979 Snijder, E J., H van Tol, N Roos, and K W Pedersen 2001 Non-structural proteins and interact to modify host cell membranes during the formation of the arterivirus replication complex J Gen Virol 82:985–994 Tian K, Yu X, Zhao T, Feng Y, Cao Z, Wang C, Hu Y, Chen X, Hu D, Tian X, Liu D, Zhang S, Deng X, Ding Y, Yang L, Zhang Y, Xiao H, Qiao M, Wang B, Hou L, Wang X, Yang X, Kang L, Sun M, Jin P, Wang S, Kitamura Y, Yan J and Gao GF (2007) Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark PLoS ONE 2: e526 van der Meer, Y., H van Tol, J Krijnse Locker, and E J Snijder 1998 ORF1a-encoded replicase subunits are involved in the membrane association of the arterivirus replication complex J Virol 72:6689–6698 van Dinten, L.C., den Boon, J.A., Wassenaar, A.L., Spaan, W.J., Snijder, E.J., 1996 An infectious arterivirus cDNA clone: identification of a replicase point mutation that abolishes discontinuous mRNA transcription Proc Natl Acad Sci U.S.A 94, 991-996 Wensvoort, G., C Terpstra, J M A Pol, E A ter Laak, M Bloemraad, E P de Kluyver, C Kragten, L van Buiten, A den Besten, F Wagenaar, J M Broeckhuijsen, P L J M Moonen, T Zetstra, E A de Boer, H J Tibben, M F de Jong, P van’t Veld, G J R Groenland, J A van Gennep, M Voets, J H M Verheijden, and J Bramskamp 1991 Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus Vet Q 13:121–130 49 Wissink EHJ, Kroese MV, van Wijk HAR, Rijsewijk FAM, Meulenberg JJM, Rottier PJM 2005 Envelope protein requirements for the assembly of infectious virions of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Journal of Virology 79: 12495-506 50 Yang H.C., Huang F.F., Guo X., 2001 Sequence of genome of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate BJ-4 J Agricult Biotechnol 9: 212–218 51 Youjun Feng , Tiezhu Zhao, Tung Nguyen, KenInui et al., 2007 Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Vietnam and China, 2007 Veterinary Services 52 Ziebuhr, J., E J Snijder, and A E Gorbalenya 2000 Virus-encoded proteinases and proteolytic processing in the Nidovirales J Gen Virol 81:853– 879 47 Internet http://www.bacninh gov.vn/Story/ NongNghiepKhuyenNong http://www.huaf.edu.vn/diendan/ viewtopic.php http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles http://journals.cambridge.org/action/displayAbstract http://tusach.thuvienkhoahoc.com http://thiennhien.net 48 ... tiêu huỷ 20.000 Năm 2008, dịch tai xanh thực “cơn bão dữ” Việt Nam mức độ lây lan nhanh thi t hại lớn Số lợn bị bệnh 260.000 con, số lợn bị tiêu huỷ 255.000 Tổng thi t hại 500 tỷ đồng (Theo Hoàng... i TÓM TẮT ii SUMMARY iii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix Chương MỞ ĐẦU 1 Đặt... - PRRS) bệnh vi rút gây ra, bệnh gây thi t hại lớn kinh tế phát Mỹ vào năm 1987, sau lan truyền nước: Canada, Anh, Pháp, Bỉ, Hà Lan, Nhật Bản gây nhiều thi t hại cho chăn nuôi lợn công nghiệp