BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA Agrobacterium rhizogenes ĐẾN SỰ GIA TĂNG HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL VÀ MENTHONE Ở HAI GIỐNG BẠC HÀ Mentha arvensis Linn VÀ Mentha piperita Linn TRỒNG CHẬU ĐẤT Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN TRẦN LÂM THANH Niên khóa : 2006 – 2010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA Agrobacterium rhizogenes ĐẾN SỰ GIA TĂNG HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL VÀ MENTHONE Ở HAI GIỐNG BẠC HÀ Mentha arvensis Linn VÀ Mentha piperita Linn TRỒNG CHẬU ĐẤT Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: TS TRẦN THỊ LỆ MINH NGUYỄN TRẦN LÂM THANH KS CAO THỊ THANH LOAN Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành với quan tâm giúp đỡ nhiều Thầy, Cô anh chị bạn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: − Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập − Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, tất q Thầy Cơ ln tận tình hướng dẫn, giảng dạy giúp đỡ − TS Trần Thị Lệ Minh KS Cao Thị Thanh Loan tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp − Th.S Nguyễn Vũ Phong giúp đỡ tơi q trình thực tập − KS Trịnh Thị Phi Ly tận tâm giúp đỡ trình tiến hành khóa luận − Các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nơng Lâm giúp đỡ suốt thời gian qua − Anh Nguyễn Sĩ Tuấn, bạn Đinh Cát Điềm nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình hồn thành khóa luận − Chị Hân, chị Tú thuộc phòng Vi sinh trường Đại học Nơng Lâm Tp HCM tồn thể bạn lớp DH06SH hỗ trợ, động viên suốt thời gian làm đề tài Con thành kính ghi ơn Ba Mẹ tận tụy chăm sóc, dạy bảo suốt 23 năm người thân gia đình ln tin tưởng, khích lệ lúc khó khăn để vững bước đường chọn Chân thành cảm ơn! Tháng năm 2010 Nguyễn Trần Lâm Thanh i TÓM TẮT Các hợp chất thứ cấp thường đặc trưng cho loài trồng đóng vai trò quan trọng sống sinh sản thực vật Với tiến khoa học, chúng tổng hợp nhân tạo nhằm phục vụ cho nhiều mục đích Tuy nhiên việc tổng hợp nhân tạo gặp số khó khăn với số chất taxol, artemisine… quy trình tổng hợp chưa rõ ràng Đã có vài báo cáo thành cơng sử dụng Agrobacterium rhizogenes kích thích gia tăng số chất cà độc dược, bạc hà Châu Âu trồng thủy canh Trên sở đó, đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng Agrobacterium rhizogenes đến gia tăng hàm lượng tinh dầu, menthol menthone hai giống bạc hà Mentha arvensis Linn Mentha piperita Linn trồng chậu đất” tiến hành trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Tháng 7/2010 Hai giống bạc hà trồng chậu đất bổ sung vi khuẩn (Agrobacterium rhizogenes ATCC11325) với mật độ vi khuẩn khác nhau, tiến hành theo dõi tiêu: chiều cao thân, số lá, số cành, trọng lượng thân, trọng lượng rễ sau thu hoạch Định lượng tương đối hàm lượng menthol, menthone tinh dầu sắc ký lớp mỏng nhằm tìm mật độ vi khuẩn thích hợp nhất, kích thích gia tăng cao hàm lượng tinh dầu chất có tinh dầu Mẫu tinh dầu có gia tăng hàm lượng chất hiệu đem xác định hàm lượng menthol menthone so với mẫu không bổ sung vi khuẩn phương pháp sắc ký khí khối phổ Cả hai giống bạc hà trồng chậu đất bổ sung mật độ vi khuẩn khác cho khả sinh trưởng chiều cao thân, số lá, số cành, trọng lượng thân, trọng lượng rễ cao không bổ sung vi khuẩn Hàm lượng tinh dầu, menthol menthone tinh dầu bổ sung vi khuẩn cao Cây bổ sung với 0,6 ml vi khuẩn cho hiệu xử lý cao hai giống Thành phần chất có tinh dầu bạc hà Châu Âu nhiều so với bạc hà Châu Á ii SUMMARY Thesis: “ STUDY THE INFLUENCE OF BACTERIA Agrobacterium rhizogenes TO STIMULATE THE YIELD OF ESSENTIAL OIL, MENTHOL AND MENTHONE IN MINT (Mentha arvensis Linn AND Mentha piperita Linn.) PLANTED IN SOIL.” was carried out at Derpartment of Biotechnology, Nong Lam University, Ho Chi Minh city, from / 2010 to / 2010 The goal of experiment: Two spieces of mint are grown in soil adding bacteria (A rhizogenes ATCC11325) with different densities Studyng growth and development of plants through criteria are body height, leaf number, branche number, stem weight, weight of roots of mints Semi quantitative levels of menthol, menthone in the essential oil by thin layer chromatography - TLC in order to find the appropriate density of bacteria for increasing the highest oil content, menthol and menthone in oil From that we choose one sample which gets highest the yield of the essential oil for quantifying menthol and menthone concentration with plants non adding bacteria by gas chromatography / mass spectrometry - GC/MS Two mint spieces in soil were added different density of bacteria promote growth for body height, leaf number, branche number, stem weight and weight of roots more than control plants Essential oil, menthol and menthone in plant of bacteria - added plants is also higher than control plants Plants were supplemented with 0,6 ml of bacteria obtaining the most effective treatment in both spieces iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2.Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung bạc hà 2.2 Bạc hà Á Mentha arvensis Linn 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Đặc điểm thực vật học 2.2.3 Đặc điểm sinh trưởng phát triển 2.2.4 Phân bố sinh thái 2.2.5 Kỹ thuật trồng bạc hà Á 2.2.6 Thời điểm, cách thu hoạch sinh khối 2.2.7 Thành phần hóa học tinh dầu bạc hà Mentha arvensis Linn 2.2.7.1 Menthol 2.2.7.2 Menthone 11 2.2.8 Tác dụng dược lý 12 2.2.9 Công dụng 12 2.3 Bạc hà Âu Mentha piperita Linn 13 2.3.1 Phân loại 13 iv 2.3.2 Đặc điểm thực vật học 14 2.3.3 Phân bố sinh thái 14 2.3.4 Kỹ thuật trồng bạc hà Âu 15 2.3.5 Thành phần hóa học tinh dầu bạc hà Mentha piperita Linn 15 2.3.6 Tác dụng dược lý công dụng 16 2.4 Giới thiệu chung Agrobacterium 16 2.5 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 18 2.5.1 Phân loại 18 2.5.2 Đặc điểm chung vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 18 2.5.3 Ri-plasmid - Root inducing plasmid 19 2.5.4 Chức T-DNA 19 2.5.5 Chức gene vir 20 2.5.6 Cơ chế chuyển T-DNA vào gen tế bào chủ 20 2.6 Phương pháp ly trích tinh dầu 22 2.6.1 Xử lý sinh khối để thu tinh dầu 22 2.6.2 Phương pháp chưng cất nước 22 2.6.2.1 Chưng cất nước 22 2.6.2.2 Chưng cất nước nước 22 2.6.2.3 Chưng cất nước 23 2.7 Giới thiệu sắc ký lớp mỏng (TLC) sắc ký khí (GC) 23 2.7.1 Sắc ký lớp mỏng 23 2.7.2 Sắc ký khí (GC) 24 2.7.3 Sắc ký khí khối phổ (GC/MS) 24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 25 3.2 Đối tượng thí nghiệm 25 3.3 Hóa chất thiết bị 25 3.4 Nội dung nghiên cứu 26 3.4.1 Nuôi cấy vi khuẩn 26 v 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng vi khuẩn A rhizogenes 26 3.4.2.1 Bạc hà châu Á 26 3.4.2.2 Bạc hà châu Âu 27 3.4.3 Xác định hàm lượng tinh dầu giống bạc hà 28 3.4.4 So sánh hàm lượng menthol, menthone tinh dầu 30 3.4.5 Xác định hàm lượng menthol, menthone tinh dầu GC/MS 31 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 32 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Khảo sát ảnh hưởng vi khuẩn A rhizogenes 33 4.1.1 Bạc hà châu Á 33 4.1.2 Bạc hà châu Âu 38 4.2 Xác định hàm lượng tinh dầu giống bạc hà 42 4.3 So sánh hàm lượng menthol, menthone tinh dầu 43 4.4 Xác định hàm lượng menthol, menthone tinh dầu GC/MS 49 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A rhizogenes : Agrobacterium rhizogenes chv : Chromosomal virulence ctv : Cộng tác viên DNA : Deoxyribonucleic acid DC : Đối chứng GC/MS : Gas chromatography/ mass spectrometry – sắc ký khí khối phổ ORF : Open reading Frame PCR : Polymerase chain reaction RB : Right border Ri plasmid : Root inducing plasmid rol : Resistance to osmotic lysis TLC : Thin layer chromatography – sắc ký lớp mỏng TB : Trung bình TL – DNA : Transferred left DNA TR – DNA : Transferred right DNA Vir : Gen vir Vir : Virulence vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 Kết trắc nghiệm thống kê so sánh chiều cao thân, số 33 Bảng 4.2 Kết trắc nghiệm thống kê so sánh trọng lượng thân 35 Bảng 4.3 Kết trắc nghiệm thống kê so sánh chiều cao thân 38 Bảng 4.4 Kết trắc nghiệm thống kê so sánh trọng lượng thân 40 Bảng 4.5 Kết hàm lượng tinh dầu bạc hà Á 42 Bảng 4.6 Kết hàm lượng tinh dầu bạc hà Âu 42 Bảng 4.7 Kết đường chuẩn menthol sắc ký lớp mỏng 44 Bảng 4.8 Kết đường chuẩn menthone sắc ký lớp mỏng 44 Bảng 4.9 Kết hàm lượng (%) menthol, menthone bạc hà Á 46 Bảng 4.10 Kết hàm lượng (%) menthol bạc hà Âu 48 Bảng 4.11 Kết đường chuẩn menthol tinh dầu bạc hà Á 49 Bảng 4.12 Kết đường chuẩn menthone tinh dầu bạc hà Á 49 Bảng 4.13 Kết hàm lượng (%) menthol, menthone tinh dầu bạc hà Á 50 Bảng 4.14 Kết đường chuẩn menthol tinh dầu bạc hà Âu 51 Bảng 4.15 Kết đường chuẩn menthone tinh dầu bạc hà Âu 51 Bảng 4.16 Kết hàm lượng (%) menthol, menthone tinh dầu bạc hà Âu 52 viii Bảng 45 Kết theo dõi tiêu số bạc hà Châu Âu trồng chậu đất sau 45 ngày Nghiệm thức 11325 (0,4 ml) 11325 (0,6 ml) 11325 (0,8 ml) Đối chứng 205,33 289,33 241,33 200,67 Lần lặp lại 240,67 288 303,33 311,33 277,33 284 208 238,33 Chiều cao TB (cm) 244,67 301,33 267,55 215,67 Bảng 46 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 45 Bảng 47 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 45 Bảng 48 Kết theo dõi tiêu số cành bạc hà Châu Âu trồng chậu đất sau 45 ngày Nghiệm thức 11325 (0,4 ml) 11325 (0,6 ml) 11325 (0,8 ml) Đối chứng 48,67 68 60 51,33 Lần lặp lại 64,33 66,67 61,33 57,33 58,67 73,33 65,33 56 Chiều cao TB (cm) 57,22 69,33 62,22 54,87 Bảng 49 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 48 Bảng 50 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 48 Bảng 51 Kết theo dõi tiêu trọng lượng thân bạc hà Châu Âu trồng chậu đất Nghiệm thức 11325 (0,4 ml) 11325 (0,6 ml) 11325 (0,8 ml) Đối chứng 280 330 250 240 Lần lặp lại 240 320 320 260 270 300 300 260 Trọng lượng TB (g) 263,33 316,67 290 253,33 Bảng 52 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 51 Bảng 53 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 51 Bảng 54 Kết theo dõi tiêu trọng lượng rễ bạc hà Châu Âu trồng chậu đất Nghiệm thức 11325 (0,4 ml) 11325 (0,6 ml) 11325 (0,8 ml) Đối chứng 60 100 60 60 Lần lặp lại 80 90 90 60 70 90 80 70 Trọng lượng TB (g) 70 93,333 76,667 63,333 Bảng 55 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 54 Bảng 56 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 54 Bảng 57 Kết hàm lượng tinh dầu bạc hà Á trồng chậu đất bổ sung mật độ vi khuẩn khác Nghiệm thức 11325 (0,4 ml) 11325 (0,6 ml) 11325 (0,8 ml) Đối chứng 2,28 3,03 2,62 1,98 Lần lặp lại 1,87 3,2 2,79 1,91 2,49 3,04 2,75 1,99 Hàm lượng TB (%) Bảng 58 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 57 Bảng 59 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 57 2,21 3,09 2,72 1,96 Bảng 60 Kết hàm lượng tinh dầu bạc hà Âu trồng chậu đất bổ sung mật độ vi khuẩn khác Nghiệm thức 11325 (0,4 ml) 11325 (0,6 ml) 11325 (0,8 ml) Đối chứng 0,51 0,93 0,69 0,48 Lần lặp lại 0,51 0,74 0,59 0,46 0,56 0,85 0,71 0,45 Hàm lượng TB (%) Bảng 61 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 60 Bảng 62 Bảng trắc nghiệm phân bảng 60 0,53 0,84 0,66 0,46 Bảng 63 Kết hàm lượng (%) menthol bạc hà Á trồng chậu đất bổ sung mật độ vi khuẩn khác sắc ký lớp mỏng Nghiệm thức 11325 (0,4 ml) 11325 (0,6 ml) 11325 (0,8 ml) Đối chứng 14 26 22,67 12,13 Lần lặp lại 17,33 30,67 20 15,2 13,87 29,33 16,93 16,13 Hàm lượng TB (%) Bảng 64 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 63 Bảng 65 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 63 15,07 28,67 19,87 14,49 Bảng 66 Kết hàm lượng (%) menthone bạc hà Á trồng chậu đất bổ sung mật độ vi khuẩn khác sắc ký lớp mỏng Nghiệm thức 11325 (0,4 ml) 11325 (0,6 ml) 11325 (0,8 ml) Đối chứng 6,19 13,61 10,83 4,64 Lần lặp lại 5,57 11,13 10,51 4,64 6,49 11,75 9,28 6,19 Hàm lượng TB (%) Bảng 67 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 66 Bảng 68 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 66 6,08 12,17 10,21 5,15 Bảng 69 Kết hàm lượng (%) menthol bạc hà Âu trồng chậu đất bổ sung mật độ vi khuẩn khác sắc ký lớp mỏng Nghiệm thức 11325 (0,4 ml) 11325 (0,6 ml) 11325 (0,8 ml) Đối chứng 0,021 0,045 0,021 0,014 Lần lặp lại 0,025 0,035 0,03 0,01 0,018 0,034 0,025 0,018 Hàm lượng TB (%) Bảng 70 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 69 Bảng 71 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 69 0,021 0,038 0,025 0,014 Bảng 72 Kết hàm lượng (%) menthol tinh dầu bạc hà Á trồng chậu đất sắc ký khí khối phổ GC/MS Nghiệm thức 11325 (0,6 ml) Đối chứng Lần lặp lại 35,85 35,50 33,89 35,21 36,36 33,76 Menthol TB (%) 35,91 34,29 Bảng 73 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 72 Bảng 74 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 72 Bảng 75 Kết hàm lượng (%) menthone tinh dầu bạc hà Á trồng chậu đất sắc ký khí khối phổ GC/MS Nghiệm thức 11325 (0,6 ml) Đối chứng Lần lặp lại 4,49 4,14 3,54 3,61 4,55 4,06 Menthone TB (%) 4,39 3,74 Bảng 76 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 75 Bảng 77 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 75 Bảng 78 Kết hàm lượng (%) menthol tinh dầu bạc hà Âu trồng chậu đất sắc ký khí khối phổ GC/MS Nghiệm thức 11325 (0,6 ml) Đối chứng 2,28 1,978 Lần lặp lại 2,24 2,07 2,33 1,87 Bảng 79 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 78 Menthol TB (%) 2,28 1,97 Bảng 80 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 78 Bảng 81 Kết hàm lượng (%) menthone tinh dầu bạc hà Âu trồng chậu đất sắc ký khí khối phổ GC/MS Nghiệm thức 11325 (0,6 ml) Đối chứng 1,29 1,02 Lần lặp lại 1,12 1,06 1,27 1,01 Menthone TB (%) Bảng 82 Bảng trắc nghiệm ANOVA bảng số liệu 81 Bảng 83 Bảng trắc nghiệm phân hạng bảng 81 1,22 1,03 Phụ lục 4: SẮC KÝ ĐỒ GC/MS Hình Sắc ký đồ menthol, menthone chuẩn ( 150 – 15 mg/l) Hình Sắc ký đồ mẫu tinh dầu Châu Á đối chứng Hình Sắc ký đồ mẫu tinh dầu Châu Á bổ sung 0,6 ml vi khuẩn Hình Sắc ký đồ mẫu tinh dầu Châu Âu đối chứng Hình Sắc ký đồ mẫu tinh dầu Châu Âu bổ sung 0,6 ml vi khuẩn ... TRỒNG CHẬU ĐẤT Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: TS TRẦN THỊ LỆ MINH NGUYỄN TRẦN LÂM THANH KS CAO THỊ THANH LOAN Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Khóa luận hoàn thành với quan tâm giúp đỡ nhiều Thầy,... lysis TLC : Thin layer chromatography – sắc ký lớp mỏng TB : Trung bình TL – DNA : Transferred left DNA TR – DNA : Transferred right DNA Vir : Gen vir Vir : Virulence vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng... arvensis Linn 2.2.1 Phân loại Giới: Plantae Phân nhóm: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Lamiales Họ: Lamiaceae Giống: Mentha Loài: Mentha arvensis Hình 2.1 Mentha arvensis Linn (Hình tác giả