ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR (SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH LIÊN KẾT GEN DMD

68 65 0
  • Loading ...
1/68 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 27/02/2019, 12:08

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR (SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH LIÊN KẾT GEN DMD Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN DUY LAN Niên khoá : 2006 – 2010 Tháng 07/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR (SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH LIÊN KẾT GEN DMD Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS.BS NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN NGUYỄN DUY LAN ThS.BS QUÁCH THỊ HOÀNG OANH Tháng 07/2010 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến: Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học Thầy Cô trực tiếp giảng dạy suốt bốn năm học vừa qua trường ThS.BS Nguyễn Khắc Hân Hoan ThS.BS Qch Thị Hồng Oanh tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý giá động viên suốt q trình thực Khóa luận tốt nghiệp Tập thể Y – Bác sĩ, Thầy Cô Anh Chị - Phòng Di truyền tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Xin cảm ơn bạn học khóa động viên, giúp đỡ suốt bốn năm học qua Lời cảm ơn chân thành sâu sắc xin gửi tới bố mẹ yêu thương, chăm sóc, dạy bảo dành cho điều tốt đẹp Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2010 Sinh viên Nguyễn Duy Lan i TÓM TẮT Loạn dưỡng Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) bệnh thần kinh – di truyền phổ biến với tỷ lệ mắc 1/3500 trẻ trai đẻ sống Bệnh DMD xảy đột biến gen dystrophin nhiễm sắc thể giới tính X Hơn 65% trường hợp đột biến lặp đoạn gen Kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification - Lai nhiều probe khuếch đại) gần cho chẩn đoán đoạn gen hiệu Tuy nhiên số trường hợp bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng MLPA không phát đột biến Lúc này, cần phải triển khai phương pháp khác nhằm chẩn đoán nguồn gốc gen đột biến, khảo sát STR phân tích liên kết gen dystrophin Đề tài nghiên cứu sử dụng kỹ thuật khảo sát STR với ba cặp mồi đặc hiệu DYS6, DXS992 STR49 Đối tượng phương pháp nghiên cứu: ba mươi mẫu DNA mười gia đình gồm hai mươi mẫu từ bố mẹ mười mẫu ối Xác định giới tính mười mẫu ối multiplex PCR Sau tất ba mươi mẫu khảo sát STR – PCR, điện di mao quản CEQTM 8000, phân tích chương trình Fragment Analysis Trong nghiên cứu tơi tiến hành phản ứng multiplex PCR xác định xác giới tính thai nhi xác định thơng số tối ưu cho việc khảo sát STR kỹ thuật PCR sử dụng ba cặp mồi đặc hiệu ii SUMMARY Topic title: “Using STR (Short tandem repeat) for analysing linkage of Duchenne muscular dystrophy gene” Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common genetic neromuscular disorders affecting 1/3500 male births DMD is caused by mutation in the X – linked dystrophin gene More than 65% of cases are deletion or duplication mutation Recently, MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification) is described as an effective method to detect these mutations However, in some cases, mutation cannot be identified by this method although patient has clinical symptom Original mutaion need to be identified by a different method, it’s linkage analysis base on Short tandem repeats (STR) In this study, we used three specific pairs of primer DYS6, DXS992 and STR49 for STR - PCR Method: DNA samples from thirty families included twenty samples from ten couples and ten samples from amniotic fluid Sex of ten samples from amniotic fluid was determined by multiplex PCR Then all samples were carried out STR - PCR, capillary electrophoresis with CEQTM 8000, and analyzed by Fragment Analysis program The sex of fetals were determined accurately by using multiplex PCR and the protocol STR – PCR was optimized successfully with three specific pair of primers in this study iii MỤC LỤC TÓM TẮT ii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .vii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lược sử bệnh loạn dưỡng Duchenne 2.2 Tổng quan bệnh loạn dưỡng Duchenne 2.2.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh loạn dưỡng Duchenne 2.2.2 Cơ chế di truyền bệnh loạn dưỡng Duchenne 2.3 Nguyên nhân gây bệnh 2.3.1 Cấu trúc gen dystrophin 2.3.2 Cấu trúc chức protein dystrophin 10 2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh loạn dưỡng Duchenne 13 2.4.1 Phương pháp chẩn đoán điện 13 2.4.1.1 Đo tốc độ dẫn truyền vận động 13 2.4.1.2 Điện 13 2.4.2 Kiểm tra creatine kinase 14 2.4.3 Sinh thiết 14 2.4.4 Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch 15 2.4.5 Kỹ thuật Western blot 15 2.4.6 Chẩn đoán di truyền phân tử 16 2.4.6.1 Kỹ thuật Multiplex PCR 16 2.4.6.2 Kỹ thuật Southern blot 16 iv 2.4.6.3 Kỹ thuật điện di gel biến tính 17 2.4.6.4 Kỹ thuật PCR phiên mã ngược 18 2.4.6.5 Kỹ thuật kiểm tra cắt ngắn protein 18 2.4.6.6 Kỹ thuật lai chỗ có gắn huỳnh quang 18 2.4.6.7 Kỹ thuật lai nhiều probe khuếch đại 19 2.4.6.8 Kỹ thuật khuếch đại nhiều probe phụ thuộc trình nối 20 2.4.6.9 Phân tích liên kết gen 21 (1) Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn 21 (2) Trình tự lặp lại ngắn (Short Tandem Repeats, STR) 22 2.5 Tổng quan nghiên cứu bệnh loạn dưỡng Duchenne giới 22 2.6 Tổng quan nghiên cứu bệnh loạn dưỡng Duchenne Việt Nam 23 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 3.2 Nội dung nghiên cứu 26 3.3 Vật liệu 26 3.3.1 Xác định giới tính multiplex PCR 26 3.3.2 Hóa chất cho tách chiết DNA 27 3.3.3 Hóa chất cho phản ứng STR – PCR 27 3.3.4 Hóa chất cho điện di gel agarose 28 3.3.5 Hóa chất cho điện di mao quản máy Beckman Coulter CEQTM 8000 29 3.3.6 Các thiết bị, dụng cụ khác 29 3.4 Phương pháp nghiên cứu 31 3.4.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 31 3.4.1.1 Phương pháp thu mẫu 31 3.4.1.2 Phương pháp tách chiết DNA 31 3.4.2 Thực xác định giới tính multiplex PCR 32 3.4.2.1 Phương pháp multiplex PCR xác định giới tính thai nhi 32 3.4.2.2 Đảm bảo chất lượng phản ứng 34 3.4.2.3 Phương pháp điện di gel agarose 34 v 3.4.3 Phương pháp khảo sát STR – PCR 35 3.4.4 Phân tích liên kết gen dystrophin dựa kết khảo sát STR 38 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 4.1 Kết 40 4.1.1 Xác định giới tính phương pháp mutiplex PCR 40 4.1.2 Phương pháp khảo sát STR dựa kỹ thuật PCR 43 4.2 Thảo luận 48 4.2.1 Xác định giới tính thai nhi multiplex PCR 48 4.2.2 Phân tích liên kết gen dystrophin dựa vào khảo sát STR – PCR 49 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Array-cGH Array comparative genomic hybridization BMD Becker muscular dystrophy bp base pair cDNA complementary deoxyribonucleic acid CK creatine kinase DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis DMD Duchenne muscular dystrophy DMSO dimethyl sulfoxide DNA deoxyribonucleic acid DSCP Double strand conformation polymorphism dNTP 2’- deoxynucleotide – 5’ - triphosphate dATP 2’- deoxyadenosine - 5’ - triphosphate dCTP 2’- deoxycytidine - 5’ - triphosphate dGTP 2’- deoxyguanosin - 5’ - triphosphate dTTP 2’- deoxythymidine - 5’ – triphosphate EDTA ethylene diamine tetraacetid acid FISH Flourescent in situ hybridization HDA Heteroduplex analysis Kb kilobase MAPH Multiplex amplifiable probe hybridization, MAPH MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification MK marker mRNA messenger ribonucleic acid NIL nihil, nothing hay zero NST nhiễm sắc thể nt nucleotide OD optical density PCR Polymerase chain reaction PTT Protein Truncation test vii RFLP Restriction fragment length polymorphism RNA ribonucleic acid RT – PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction SNP Single nucleotide polymorphism SRY Sex-determining Region Y STR Short tandem repeats SSCP Single strand conformation polymorphism tt UV ultraviolet viii Hình 4.2 Kết điện di mao quản mẫu ối xác định giới tính phân tích phần mềm Gene Marker 42 4.1.2 Phương pháp khảo sát STR dựa kỹ thuật PCR Để đảm bảo chất lượng cho phản ứng multiplex PCR, thực kèm theo chứng không chứa DNA (chứng Nil) Bảng 4.3 Danh sách mẫu 10 gia đình thực khảo sát STR – PCR Gia đình 10 STT Mã nhập viện 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 10029A 10029B 10029C 09026A 09026B 09026C 10034A 10034B 10034C 10035A 10035B 10035C 09072A 09072B 09072C 09078A 09078B 09078C 09106A 09106B 09106C 09073A 09073B 09073C 09107A 09107B 09107C 09108A 09108B 09108C Ký hiệu 29A 29B 29C 26A 26B 26C 34A 34B 34C 35A 35B 35C 72A 72B 72C 78A 78B 78C 106A 106B 106C 73A 73B 73C 107A 107B 107C 108A 108B 108C Giới tính Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam C (ng/µl) A260/280 47,9 194,5 81,2 55,0 60,6 60,6 67,2 39,5 17,7 103,5 69,8 45,6 37,2 63,6 40,9 73,9 107,4 43,4 18,6 29,0 23,6 32,7 46,5 23,0 37,5 35,4 15,4 31,3 22,7 24,0 1,83 1,87 1,86 1,70 1,71 1,80 1,78 1,84 1,70 1,85 1,85 1,69 1,92 1,87 1,83 1,84 1,87 1,71 1,96 1,70 1,73 1,85 1,83 1,92 1,78 1,77 1,70 1,72 1,79 1,76 Các mẫu có số: thuộc gia đình A: mẫu DNA bố, B: mẫu DNA mẹ, C: mẫu DNA thai nhi 43 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm STR – PCR với cặp mồi DYS6, DXS992, STR49 10 gia đình A: mẫu DNA bố, B: mẫu DNA mẹ, C: mẫu DNA thai nhi NIL: chứng không chứa DNA MK: thang chuẩn 100bp Bằng phương pháp điện di mao quản hệ thống máy CEQTM 8000 phân tích tự động chương trình phân tích đoạn (fragment analysis), xác định alen STR mẫu trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4 Bảng tổng kết alen 30 mẫu thuộc 10 gia đình khảo sát Locus 26A 26B 26C 29A 29B 29C 34A 34B 34C DYS6 110 106 114 106 116 106 110 106 116 114 118 114 118 205 205 205 208 200 208 208 208 205 205 208 249 242 252 252 256 245 245 256 246 242 246 246 DXS992 STR49 44 Bảng 4.4 (tt) Bảng tổng kết alen 30 mẫu thuộc 10 gia đình khảo sát Locus 35A 35B 35C 72A 72B 72C 73A 73B 73C 78A 78B DYS6 112 110 110 112 114 110 110 114 108 114 114 106 116 205 201 207 201 205 201 201 206 201 205 205 205 212 205 230 230 247 230 247 249 228 248 228 249 245 226 245 245 250 250 DXS992 STR49 Locus 78C 106A DYS6 106 116 114 110 110 114 116 110 114 114 118 114 114 205 212 197 206 197 206 208 206 206 206 208 208 250 228 240 245 228 240 243 241 253 241 252 245 250 250 DXS992 STR49 106B 106C 107A 107B 107C 108A 108B 108C 35A, 35B, … 108C: mẫu DNA 10 gia đình Các mẫu có số: thuộc gia đình A: mẩu DNA bố, B: mẫu DNA mẹ, C: mẫu DNA thai nhi Tại locus, có alen: đồng hợp tử, có alen: dị hợp tử Qua bảng 4.4, nhận thấy mồi DYS6 khuếch đại sản phẩm PCR có kích thước dao động khoảng 106 – 118 bp, mồi DXS992 khuếch đại sản phẩm PCR có kích thước từ 197 – 212 bp sản phẩm khuếch đại mồi STR49 có kích thước từ 226 – 256 bp Bảng 4.5 Tỷ lệ dị hợp tử 10 mẫu mẹ Locus DYS6 DXS992 STR49 Số cá thể dị hợp tử 3 Tỷ lệ dị hợp tử 0,3 0,3 0,8 Qua bảng 4.5 nhận thấy mồi STR49 xuất nhiều alen với tỉ lệ dị hợp tử cao 45 Dưới bảng tần số xuất alen locus cho thấy khả xuất alen sử dụng cặp mồi nghiên cứu đề tài Bảng 4.6 Tần số alen locus DYS6 20 mẫu máu bố mẹ 10 gia đình khảo sát Alen 106 108 110 112 114 116 118 Số lần xuất Tần số 0,1304 0,0435 0,2609 0,0435 0,3043 0,3043 0,0870 Bảng 4.7 Tần số alen locus STR49 20 mẫu máu bố mẹ 10 gia đình khảo sát Alen 226 228 230 240 241 242 243 245 246 247 248 249 250 252 253 256 Số lần xuất 2 1 1 1 46 Tần số 0,0357 0,0714 0,0714 0,0357 0,0357 0,0714 0,0357 0,1786 0,0714 0,0357 0,0357 0,0714 0,1071 0,0714 0,0357 0,0357 Bảng 4.8 Tần số alen locus DXS992 20 mẫu máu bố mẹ 10 gia đình khảo sát Alen 197 200 201 205 206 207 208 212 Số lần xuất 1 Tần số 0,0435 0,0435 0,1304 0,3043 0,1739 0,0435 0,2174 0,0435 Qua bảng 4.6, 4.7, 4.8 quan sát locus DYS6 alen xuất thường alen 114, locus DXS992 alen 205 locus STR49 alen 245 Dù bảng 4.4 thể hết phân bố alen mẫu bố mẹ thai nhi 10 gia đình khảo sát để quan sát cách rõ ràng alen đời nhận từ bố mẹ, rút bảng 4.4 thành bảng 4.9 Bảng 4.9 Các alen di truyền cho đời Locus 26C 29C 34C 35C 72C 73C 78C 106C 107C 108C DYS6 106 106 116 114 118 110 112 110 114 114 106 116 110 114 114 114 205 208 205 208 201 205 201 205 205 212 197 206 206 208 252 245 256 246 230 247 228 249 245 250 228 240 241 250 DXS992 STR49 Mẫu 26C, 29C, …108C: 10 mẫu DNA thai nhi Tại locus, có alen: đồng hợp tử, có alen: dị hợp tử Kết cho thấy locus DYS6 alen di truyền cho đời nhiều alen 114 (6 thai mang alen tổng số 10 thai nhi), locus DXS992 alen 205 206 Riêng locus STR49, alen đời nhận đồng 47 Hình 4.4 Kết phân tích chương trình Fragment Analysis máy CEQ 8000 mẫu ối Hình 4.5 Kết phân tích chương trình Fragment Analysis máy CEQ 8000 mẫu ối 4.2 Thảo luận 4.2.1 Xác định giới tính thai nhi multiplex PCR Chứng khơng có DNA (chứng Nil) khơng cho tín hiệu chứng tỏ phản ứng khơng bị ngoại nhiễm, điều cho thấy chẩn đoán chúng tơi kiểu gen xác, khơng có trường hợp dương tính giả Chứng nam chứng nữ phản ứng xuất băng 48 đặc hiệu cho chứng nội (ATSEA), gen Amelogenin gen SRY, không xuất băng phụ chứng tỏ phản ứng multiplex PCR xác định giới tính thiết lập khơng có trường hợp âm tính giả Vì vậy, phản ứng multiplex PCR hoàn toàn đặc hiệu Kỹ thuật multiplex PCR có độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản, dễ thực Vì ứng dụng phản ứng chẩn đoán thường quy xác định giới tính người 4.2.2 Phân tích liên kết gen dystrophin dựa vào khảo sát STR – PCR Chúng tiến hành khảo sát mẫu 10 gia đình thu thập phòng Di Truyền – Bệnh viện Từ Dũ, lấy ngẫu nhiên mẫu 10 gia đình gồm bố mẹ thai nhi Nếu thai nhi nam phương pháp có ý nghĩa việc xác định thai có mắc bệnh hay khơng Còn thai nhi nữ phương pháp có ý nghĩa việc xác định tỷ lệ dị hợp tử locus, tần số alen đời nhận từ bố mẹ Vì đột biến gen lặn nên từ kiểu gen người trai mắc bệnh, xác định người nhận gen từ NST người mẹ Qua kết khảo sát STR, quan sát xem thai nhi có nhận phải NST mang gen đột biến khơng, từ dựa vào kết xác định giới tính thai nhi mà có tư vấn di truyền phù hợp Nếu thai nhi nhận NST khơng mang gen đột biến, khơng sàng lọc trường hợp Còn thai nhận phải NST này, đồng thời thai mang giới tính nữ xác định người mang gen Trong trường hợp thai nam nên tiến hành chấm dứt thai kỳ chắn mắc bệnh loạn dưỡng Duchenne Kết nghiên cứu cho thấy mồi DYS6 khuếch đại sản phẩm PCR có kích thước dao động khoảng 106 – 118 bp, mồi DXS992 khuếch đại sản phẩm PCR có kích thước từ 197 – 212 bp sản phẩm khuếch đại mồi STR49 có kích thước từ 226 – 256 bp Tỷ lệ dị hợp tử sản phẩm khuếch đại DYS6, DXS992 STR49 0,3; 0,23 0,33 Theo nghiên cứu Rob cộng (2004), DYS6 khuếch đại đoạn DNA có kích thước từ 96 – 118 bp, DXS992 khuếch đại đoạn DNA có kích thước từ 201 – 211 bp, STR49 khuếch đại đoạn DNA có kích thước từ 227 – 257 bp; phù hợp với nghiên cứu 49 Tuy nhiên, tỷ lệ dị hợp tử sản phẩm khuếch đại cặp mồi theo trang web www.dmd.nl, cao: DYS6 0,76; STR49 0,93 Theo nghiên cứu Rob cộng (2004), tỷ lệ cặp mồi DYS6 0,7; DXS992 0,87; STR49 0,91 Giải thích cho khác tỷ lệ dị hợp tử nghiên cứu nghiên cứu phụ thuộc vào số lượng mẫu thực khảo sát Tuy nhiên, để có kết luận cuối cần thực phân tích với số lượng bệnh nhân nhiều Phương pháp STR - PCR kết hợp với điện di mao quản có độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, tốn thời gian chi phí khoảng 10 lần so với giải trình tự cặp mồi chọn để sử dụng phản ứng STR – PCR cặp mồi có trình tự gen dystrophin, tần số hoán vị gen thấp Tuy nhiên hoán vị gen xảy ảnh hưởng đến kết chẩn đốn nguồn gốc gen đột biến Ngồi kết khơng xác trường hợp mẫu ối thai nhi trình chọc hút nước ối bị lẫn máu mẹ Để hạn chế trường hợp mẫu ối thai bị lẫn máu mẹ, kỹ thuật chọc hút nước ối thích hợp sử dụng: tránh xuyên qua nhau, loại bỏ ml nước ối đầu, … 50 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Bước đầu xây dựng thành cơng quy trình khảo sát STR – PCR phân tích liên kết gen dystrophin Các thông số thiết lập cho khảo sát STR – PCR cho kết điện di mao quản tốt, phản ứng khơng bị ngoại nhiễm Vì vậy, khảo sát STR kỹ thuật hiệu quả, giúp tiết kiệm thời gian chi phí việc xác định người lành mang gen bệnh Sản phẩm khuếch đại phản ứng STR – PCR có kích thước phù hợp với kết công bố giới Trong ba cặp mồi nghiên cứu cặp mồi STR49 cho tỷ lệ dị hợp tử cao, phù hợp nghiên cứu người Việt Nam 5.2 Đề nghị Do số việc chưa thực được, chúng tơi có đề nghị sau: - Thực phân tích với lượng mẫu lớn để xác định tỷ lệ dị hợp tử sản phẩm khuếch đại xác - Nên tiếp tục nghiên cứu thêm với cặp mồi khác để tăng tính hiệu xác phương pháp, hỗ trợ cho việc chẩn đoán - Tiếp tục xây dựng lưu đồ tư vấn tầm soát trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne giúp cho công tác chẩn đoán bệnh tương lai sớm triển khai hiệu quả, giúp ích cho người mắc bệnh 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Hữu Công 2006 Bệnh Trong: Thần kinh học Nhà xuất Đại học Quốc gia TP.HCM Nguyễn Hữu Công 2009 Ứng dụng điện gợi thần kinh học bệnh liên quan ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, TP HCM Hồ Huỳnh Thùy Dương 2003 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục Hứa Thị Ngọc Hà , Huỳnh Ngọc Linh Ứng dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch chẩn đốn giải phẫu bệnh Đại học Y dược TP.HCM Nguyễn Khắc Hân Hoan, Phạm Ngọc Khôi, Nguyễn Thị Phương Mai, Ngô Diễm Ngọc 2009 Phát đột biến đoạn gen gây bệnh loạn dưỡng Duchenne Becker kỹ thuật MLPA Trong Hội nghị “Sinh học phân tử ứng dụng y học” 07-08/04/2009 Trần Vân Khánh 2005 Đột biến vùng rod gen dystrophin gây nên bệnh loạn dưỡng Duchenne Trong: Tạp chí Y Học Việt Nam, Trang 33 – 39 Trần Vân Khánh cộng 2009 Nghiên cứu đột biến đoạn gen dystrophin mức độ mRNA bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne Trong: Tạp chí nghiên cứu Y học Trang 17 – 24 Phạm Ngọc Khôi 2009 Thiết lập kỹ thuật chẩn đoán bệnh loạn dưỡng Duchenne dựa phản ứng PCR Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm TP.HCM Muscular Dystrophy Association of NSW, Locker Bag 1005, Rosebery, NSW 1445 2009 Các kiện chứng loạn dưỡng Duchenne Becker Bài dịch từ tổ chức MDANSW chuyển tác 10 Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc 2007 Chẩn đốn phân tử Trong: Cơng nghệ sinh học người động vật Nhà xuất Giáo dục Trang 517 – 571 11 Trần Nguyễn An Phú 2007 Chẩn đoán đột biến Beta Thalassaemia phương pháp ARMS – PCR (Amplification Refractory Mutation System – Polymerase Chain Reaction) Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM 12 Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn 2009 Phát người lành mang gen bệnh loạn dưỡng DUCHENNE phương pháp PCR định lượng Trong Hội nghị “Sinh học phân tử ứng dụng y học” 0708/04/2009 13 Phạm Hùng Vân 2009 PCR Real Time PCR – Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 14 Andrew H Ahn and Louis M Kunkel 1993 The structural and functional diversity of dystrophin http://www.nature.com/naturegenetics 52 15 Chamberlain JS., Gibbs RA., Ranier JE., Caskey CT., 1990 Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy In: PCR Protocols: A Guide to Method and Applications (Eds; MA Innis, GH Gelfand, JJ Sninsky, TJ White), Academic Press, San Diego (USA).pp: 272 – 281 16 Cristina Bordea, R Vatasescu, Georgiana Stoica, D Miscalencu, Anca Dinischiotu, Marieta Costache, Elena Ionica 2005 Diagnosis of Muscular Dystrophies by Western Blot Conference of Biology 17 Den Dunnen JT, Van Ommen GJ 1999 The protein truncation test: A review Hum Mutat.14., pp:95-102 18 Derek J Blake, Andrew Weir, Sarah E Newey, and Kay E Davies 2002 Function and Genetics of Dystrophin and Dystrophin-Related Proteins in Muscle Physiological Reviews, vol 82., pp: 291-329 19 Henry J Klamut, Suman B Gangopadhyay, Ronald G Worton, and Peter N Ray 1990 Molecular and Functional Analysis of the Muscle-Specific Promoter Region of the Duchenne Muscular Dystrophy Gene Molecular and Cellular Biology,pp: 193 – 205 20 John M.Butler, Amy E.Decker, Peter M.Vallone, Margaret C Kline 2005 Allele frequencies for 27 Y-STR loci with U.S.Caucasian, African merican, and Hispanic samples Forensic Science International 156: 250–260 21 Rob Elles, Roger Mountford 2004 Molecular Diagnosis of Genetic Diseases 22 Schwartz M and Duno M 2004 Improved molecular diagnosis of dystrophin gene mutations using the Mutiplex ligation – dependent probe amplification method Gene Test 8: 361 – 367 23 Van Khanh Tran., Zhujun Zhang., Mariko Yagi., Atsushi Nishiyama., Yasuaki Habara 2005 A novel cryptic exon identified in the 3’ region of intron of the human dystrophin gene J Hum Genet 50: 425 – 433 24 Thomas W Prior and Scoot J.Bridgeman 2005 Experience and Strategy for the molecular testion of Duchenne muscular dystrophy Journal of Molecular Diagnostics, 7: 317 – 326 25 Voskova-Goldman,A., Peier,A., Caskey,C T., Richards,C S., and Shaffer,L G 1997 DMD-specific FISH probes are diagnostically useful in the detection of female carriers of DMD gene deletions Neurology 48: 1633–1638 53 PHỤ LỤC Phụ lục Kiểm tra ngân hàng gen cặp mồi (DYS6, DXS992 STR49) dùng để chạy phản ứng STR – PCR, thông qua trang http://genome.ucsc.edu • DYS6 >chrX:33001608-33001717 110bp TTCAGTTTCTCTCGGTGTTCCTatatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtatttagttctgtacagTTTCATCACATG TGCAGGTGTA • DXS992 >chrX:30750317-30750519 203bp AAGAATGGGACTCCATTTCAaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatatatatata tatatatatatatatatacacacacacacatatacacacatacacacaca catatacatacacacacacacacacatatgtatagtgaaattttttccca cccctttctcccaaatgcctaattatcaaccctTTCTGTCCCAGTGGATA AGC • STR49 >chrX:31840629-31840861 233bp CGTTTACCAGCTCAAAATCTCAACtatcaaaggcaagaaaaatacacaca cacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacccctctgcc tttttctgtatggccaaagccttcagtccagctgaccacttcccactcca gttaccatgttagcctcccaacttgtatctctgcacccttctgataaagc ctccacaatGCAAAACACGAATCGTATCATATG Phụ lục Kiểm tra thông số cặp mồi (DYS6, DXS992 STR49) phần mềm thiết kế mồi Perlprimer v1.1.19 • DYS6 • DXS992 • STR49 Phụ lục Vận hành hệ thống điện di mao quản CEQTM 8000 Khởi động máy Lựa chọn Database Làm Wetting Tray – khay chứa nước cất hai lần dùng để ngâm đầu mao quản Gel sau bơm đầy hệ thống mao quản thường thải Wetting Tray tạo cặn bẩn thế, cần làm Wetting Tray để tránh cặn bẩn bám vào đầu mao quản Chọn optical alignment để kiểm tra đường hai chùm sáng laser có thẳng với tâm mao quản hay không Chạy moniter baseline, thông thường baseline nhỏ 6000, cao phải tháo mao quản làm cửa sổ quang học Cài đặt chương chình chạy, đặt tên cho giếng mục Sample Setup Cho đĩa mẫu đĩa buffer vào máy Fill cappilary: gel bơm lên mao quản Wetting Tray hay Buffer Plate tùy chọn Chọn Run, kiểm tra liệu nhập bấm Start, hệ thống bắt đầu vận hành ... PHÂN TÍCH LIÊN KẾT GEN DMD Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS.BS NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN NGUYỄN DUY LAN ThS.BS QUÁCH THỊ HỒNG OANH Tháng 07/2010 LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành gửi lời cám ơn đến:... thương, chăm sóc, dạy bảo ln dành cho điều tốt đẹp Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2010 Sinh viên Nguyễn Duy Lan i TÓM TẮT Loạn dưỡng Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) bệnh thần kinh – di truyền
- Xem thêm -

Xem thêm: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR (SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH LIÊN KẾT GEN DMD , ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR (SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH LIÊN KẾT GEN DMD

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn