BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MƠI TRƯỜNG NI CẤY IN VITRO KHƠNGSỬ DỤNG CHẤT ĐIỀU HỒ SINH TRƯỞNG TRÊN MỘT SỐ TỔ HỢP LAI LAN DENDROBIUM MINI Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG THẾ PHONG Niên khoá: 2011 - 2013 Tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MƠI TRƯỜNG NI CẤY IN VITRO KHƠNG SỬ DỤNG CHẤT ĐIỀU HỒ SINH TRƯỞNG TRÊN MỘT SỐ TỔ HỢP LAI LAN DENDROBIUM MINI Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS BÙI MINH TRÍ TRƯƠNG THẾ PHONG ThS NGUYỄN VĂN VINH Tháng 12 năm 2013 LỜI CẢM ƠN Để trưởng thành đạt kết ngày hôm nay, trước tiên xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình ln ủng hộ, động viên chỗ dựa tinh thần vững cho suốt thời gian học đại học trình thực đề tài Tơi chân thành gửi lời cám ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học tất thầy cô tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tơi thời gian theo học trường Tôi xin chân thành gửi lời biết ơn đến Thầy Bùi Minh Trí quan tâm, tận tình bảo cho tơi ý tưởng, định hướng đề tài, tạo điều kiện tốt cho tơi q trình làm đề tài Tơi xin gửi lời biết ơn đến Thầy Nguyễn Văn Vinh trực tiếp hướng dẫn tận tình truyền đạt cho kiến thức quý báu Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến Sở Khoa Học Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp kinh phí cho đề tài “Nghiên cứu lai tạo, đột biến chọn lọc số dòng lan Dendrobium mini có triển vọng”, chủ nhiệm đề tài Thạc sĩ Nguyễn Văn Vinh Tôi xin chân thành cảm ơn cô, “Trạm huấn luyện thực nghiệm nông nghiệp Văn Thánh” thuộc “Trung tâm khuyến nông thành phố Hồ Chí Minh” tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Xin cảm ơn anh chị thuộc phòng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học thực vật Đại học Nông Lâm Tp.HCM tập thể lớp LT11SH hướng dẫn, giúp đỡ, chia sẻ với suốt thời gian thực đề tài Một lần xin chân thành cảm ơn Tp HồChí Minh, tháng 12 năm 2013 Sinh viên Trương Thế Phong i TÓM TẮT Dendrobium mini thuộc giống Dendrobium có thân thấp, dễ trồng khơng đòi hỏi nhiều diện tích trồng, cho hoa quanh năm lâu tàn Hiện nay, thị trường Việt Nam giống Dendrobium mini chưa có độ đa dạng cao, nhiều giống mang khuyết điểm như: thân yếu, phát hoa ngắn Nên việc tạo giống lan Dendrobium mini để thỏa mãn nhu cầu thị hiếu khách hàng thu lại lợi ích kinh tế việc làm cần thiết Thí nghiệm tiến hành đối tượng ba tổ hợp lai lan Dendrobium mini 24 x 11, 13 x 16A, 13 x 21A sử dụng vào ba môi trường Murasgige Skoog (MS), ½ MS (đa lượng giảm ½ so với MS), Vacind Went (VW) có bổ sung 150 ml/lit nước dừa, 20 g/lit đường, 7g/lit agar 0,5 g/lit than hoạt tính Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên yếu tố, lần lặp lại Môi trường thích hợp cho hạt nảy mầm mơi trường ½ MS + g/lit agar+ 30 g/lit đường môi trường Môi trường nhân nhanh chồi tốt môi trường ½ MS + 150ml/lit nước dừa + 20g/litđường + 7g/lit agar + 0,5 g/lit than hoạt tính mơi trường Mơi trường tạo rễ tốt môi trường MS + 150ml/lit nước dừa + 20g/litđường + 7g/lit agar + 0,5g/lit than hoạt tính mơi trường Từ khóa: Dendrobium, ni cấy mô, nhân giống hoa lan ii SUMMARY Dendrobium mini is genus of Dendrobium with lower trunk, easy to grow not require a lot of acreage, tree to flower all year Currently, Dendrobium mini have not high diversity in Vietnam market, many still carry the same defects such as weak trunk, short inflorescence So creating new Dendrobium mini orchids to satisfy the needs and tastes of customers capture economic benefits is necessary The experiment was conducted on three Dendrobium mini orchid hybrid combinations24 x 11, 13 x 16A, 13 x 21A seeds more sown in three media was Murasgige and Skoog (MS), ½ MS (macro half compared with MS), Vacind and Went (VW) supplemented with 150 ml/ lit of coconut water, 20 g sugar/ lit, g agar/ lit and 0,5 g/ lit activated charcoal The experiment layout was completely randomifed design with repetitions The appropriate medium for seed germination was ½ MS + g agar + 30 g sugar/liter medium The best shoots multiply medium was ½ MS + 150 ml coconut water + 20 g sugar + g agar + 0.5 g activated carbon/liter medium The best medium for rooting was MS + 150 ml coconut water + 20 g sugar + g agar + 0.5 g activated carbon/liter medium Key words: Dendrobium, tissue culture, orchid breeding iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình biểu đồ viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2.Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu giống lan Dendrobium Dendrobium mini 2.1.1 Đặc điểm lan Dendrobium 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Ảnh hưởng điều kiện sinh thái đến sinh trưởng, phát triển lan Dendrobium 2.1.3.1 Yêu cầu nhiệt độ 2.1.3.2 Yêu cầu độ ẩm chế độ tưới nước 2.1.3.3 Yêu cầu ánh sáng 2.1.3.4 Nhu cầu dinh dưỡng 2.1.3.5 Sâu bệnh vấn đề khác 2.2 Tầm quan trọng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3 Những khó khăn lợi ích nhân giống in vitro 10 2.3.1 Những khó khăn nhân giống in vitro 10 2.3.2 Những lợi íchtrong nhân giống in vitro 10 2.4 Các phương pháp nhân giống lan Dendrobium 11 2.4.1 Các phương pháp nhân giống Dendrobiumngoài thiên nhiên 11 iv 2.4.1.1 Nhân giống vơ tính 11 2.4.1.2 Nhân giống hữu tính 11 2.4.2 Nhân giống Dendrobiumtrong phòng thí nghiệm 12 2.5 Sơ lược kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 2.5.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 2.5.2 Kỹ thuật gieo cấy hạt lan phòng thí nghiệm 13 2.5.2.1 Đặc điểm hạt lan 13 2.5.2.2 Khử trùng trái lan 13 2.6 Các cơng trình nghiên cứu môi trường nuôi cấy lan Dendrobium Dendrobium mini 14 2.7 Kỹ thuật lai tạo lanDendrobium 15 2.7.1 Chọn lọc bố mẹ 15 2.7.2 Kỹ thuật thụ phấn 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 3.2 Vật liệu giống nghiên cứu 17 3.3 Hóa chất vật tư 18 3.4 Dụng cụ thiết bị 18 3.5 Nội dung phương pháp nghiên cứu 19 3.5.1 Thí nghiệm 19 3.5.2 Thí nghiệm 20 3.5.3 Thí nghiệm 21 3.6 Xử lý số liệu 22 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Mơi trường gieo hạt thích hợp cho tổ hợp lan laiDendrobium mini 23 4.1.1 Tổ hợp 24(♀) x 11(♂) 23 4.1.2 Tổ hợp 13(♀) x 16A(♂) 25 4.1.3 Tổ hợp 13(♀) x 21A(♂) 27 4.2 Môi trường nhân chồi thích hợp cho tổ hợp lai lan Dendrobium mini 29 4.2.1 Tổ hợp 24(♀) x 11(♂) 29 4.2.2 Tổ hợp 13(♀) x 16A(♂) 31 v 4.2.3 Tổ hợp 13(♀) x 21A(♂) 32 4.3 Mơi trường rễ thích hợp cho tổ hợp lan lai Dendrobium mini 34 4.3.1 Tổ hợp 24(♀) x 11(♂) 35 4.3.2 Tổ hợp 13(♀) x 16A(♂) 36 4.3.3 Tổ hợp 13(♀) x 21A(♂) 38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT NT Nghiệm thức BAP 6-benzyl aminopurine NAA α-naphthaleneacetic acid BA 6-benzyl adenin Murasgige Skoog MS Vacind Went VW vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Thông tin tổ hợp lai sử dụng nhân giống 17 Bảng 3.2 Các nghiệm thức gieo hạt lan lai Dendrobium mini 19 Bảng 3.3 Các nghiệm thức nhân chồi lan lai Dendrobium mini 20 Bảng 3.4 Các nghiệm thức tạo rễ lan lai Dendrobium mini 21 Bảng 4.1 Sự chuyển biến hình thái hạt lan lai tổ hợp 24(♀) x 11(♂) nuôi cấy môi trường khác 23 Bảng 4.2 Sự chuyển biến hình thái hạt lan lai tổ hợp 13(♀) x 16A(♂) nuôi cấy môi trường khác 25 Bảng 4.3 Sự chuyển biến hình thái hạt lan lai tổ hợp 13(♀) x 21A(♂) nuôi cấy môi trường khác 27 Bảng 4.4 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng, phát triển chồi tổ hợp lan lai 24(♀) x 11(♂) 29 Bảng 4.5Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng, phát triển chồi tổ hợp lan lai 13(♀) x 16A(♂) 31 Bảng 4.6 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng, phát triển chồi tổ hợp lan lai 13(♀) x 21A(♂) 33 Bảng 4.7 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến rễ tổ hợp lan lai 24(♀) x 11(♂) 35 Bảng 4.8 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến rễ tổ hợp lan lai 13(♀) x 16A(♂) 37 Bảng 4.9 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến rễ tổ hợp lan lai 13(♀) x 21A(♂) 38 viii 3.00 6.770 2.257 0.60 0.49 3.00 7.820 2.607 0.72 0.49 -Total 9.00 23.150 2.572 Within 0.79 0.26 0.86 Bartlett's test Chi-square = 0.764 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.683 Chiều dài rễ 15 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.095 0.048 Within 5.530 0.922 0.052 Total 5.625 Coefficient of Variation = 41.26% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 6.930 2.310 1.06 0.55 3.00 6.630 2.210 0.89 0.55 3.00 7.380 2.460 0.92 0.55 Total 9.00 20.940 2.327 Within 0.84 0.28 0.96 Bartlett's test Chi-square = 0.052 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.974 Chiều cao chồi 15 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.026 0.013 Within 2.527 0.421 0.031 Total 2.553 Coefficient of Variation = 36.10% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 5.570 1.857 0.63 0.37 3.00 5.180 1.727 0.74 0.37 3.00 5.430 1.810 0.57 0.37 -Total Within 9.00 16.180 1.798 0.56 0.65 0.19 Bartlett's test Chi-square = 0.115 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.944 Số 15 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.089 0.044 Within 5.621 0.937 0.047 Total 5.709 Coefficient of Variation = 33.53% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 9.070 3.023 0.78 0.56 3.00 8.540 2.847 1.18 0.56 3.00 8.370 2.790 0.91 0.56 -Total 9.00 Within Bartlett's test - 25.980 2.887 0.84 0.97 0.28 Chi-square = 0.292 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.864 Số rễ 30 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 7.097 3.549 Within 10.903 1.817 1.953 0.2222 Total 18.000 Coefficient of Variation = 27.31% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 18.570 6.190 1.38 0.78 3.00 13.080 4.360 1.24 0.78 3.00 12.770 4.257 1.42 0.78 -Total 9.00 44.420 Within Bartlett's test Chi-square = 0.030 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.985 4.936 1.50 1.35 0.50 Chiều dài rễ 30 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1.103 0.552 Within 5.417 0.903 0.611 Total 6.520 Coefficient of Variation = 29.72% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 10.990 3.663 0.88 0.55 3.00 9.320 3.107 0.57 0.55 3.00 8.460 2.820 1.27 0.55 -Total 9.00 28.770 3.197 Within 0.95 Bartlett's test Chi-square = 0.986 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.611 Chiều cao chồi 30 ngày A N A L Y S I S 0.90 O F Degrees of V A R I A N C E Sum of T A B L E Mean 0.30 Freedom Squares Square F-value Prob Between 1.215 0.607 Within 2.673 0.446 1.363 0.3251 Total 3.888 Coefficient of Variation = 24.45% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 9.640 3.213 0.90 0.39 3.00 7.960 2.653 0.57 0.39 3.00 6.970 2.323 0.46 0.39 -Total 9.00 24.570 2.730 Within 0.70 0.23 0.67 Bartlett's test Chi-square = 0.820 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.664 Số chồi 30 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.103 0.052 0.028 Within 11.137 1.856 Total 11.241 Coefficient of Variation = 35.16% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 11.880 3.960 0.25 0.79 3.00 11.820 3.940 2.12 0.79 3.00 11.170 3.723 1.01 0.79 -Total 9.00 34.870 3.874 Within 1.19 0.40 1.36 Bartlett's test Chi-square = 5.130 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.077 Số rễ 45 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 28.976 14.488 Within 13.071 2.179 6.650 0.0300 Total 42.047 Coefficient of Variation = 19.45% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 30.070 10.023 1.45 0.85 3.00 20.990 6.997 1.48 0.85 3.00 17.250 5.750 1.49 0.85 -Total 9.00 68.310 7.590 2.29 Within 1.48 Bartlett's test Chi-square = 0.001 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.999 Trắc nghiệm phân hạng số rễ 45 ngày Error Mean Square = 2.179 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 2.949 at alpha = 0.050 _ Original Order Mean = 10.02 Mean = 7.000 Ranked Order A B Mean = 10.02 Mean = 7.000 A B 0.76 Mean = 5.750 B Mean = 5.750 B Chiều dài rễ 45 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1.407 0.703 Within 10.226 1.704 0.413 Total 11.633 Coefficient of Variation = 32.61% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 13.560 4.520 1.31 0.75 3.00 11.790 3.930 1.10 0.75 3.00 10.680 3.560 1.48 0.75 -Total 9.00 36.030 4.003 Within 1.31 Bartlett's test Chi-square = 0.137 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.934 Chiều cao chồi 45 ngày A N A L Y S I S 1.21 O F V A R I A N C E T A B L E 0.40 Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 4.359 2.180 Within 8.641 1.440 1.514 0.2936 Total 13.000 Coefficient of Variation = 29.98% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 14.450 4.817 1.46 0.69 3.00 12.230 4.077 1.19 0.69 3.00 9.350 3.117 0.88 0.69 -Total 9.00 36.030 4.003 Within 1.27 0.42 1.20 Bartlett's test Chi-square = 0.411 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.814 Số chồi 45 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob - Between 1.633 0.817 Within 9.798 1.633 0.500 Total 11.431 Coefficient of Variation = 27.35% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 15.600 5.200 1.05 0.74 3.00 13.980 4.660 1.69 0.74 3.00 12.470 4.157 0.98 0.74 -Total 9.00 42.050 4.672 Within 1.20 0.40 1.28 Bartlett's test Chi-square = 0.617 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.735 Số rễ 60 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 79.218 39.609 Within 15.178 2.530 15.657 0.0042 Total 94.396 Coefficient of Variation = 15.74% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 42.660 14.220 1.22 0.92 3.00 26.280 8.760 1.61 0.92 3.00 22.010 7.337 1.88 0.92 -Total 9.00 90.950 10.106 Within 1.59 Bartlett's test Chi-square = 0.296 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.862 Trắc nghiệm phân hạng số rễ 60 ngày Error Mean Square = 2.530 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 4.815 at alpha = 0.010 _ Original Order 3.44 Ranked Order 1.15 Mean = 14.22 Mean = 8.760 Mean = 7.340 A Mean = 14.22 A B Mean = 8.760 B B Mean = 7.340 B Chiều dài rễ 60 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 3.869 1.934 Within 9.423 1.571 1.232 0.3563 Total 13.292 Coefficient of Variation = 25.86% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 17.220 5.740 1.44 0.72 3.00 13.830 4.610 1.08 0.72 3.00 12.560 4.187 1.21 0.72 -Total 9.00 43.610 Within Bartlett's test Chi-square = 0.133 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.935 4.846 1.29 1.25 0.43 Chiều cao chồi 60 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 6.571 3.286 Within 8.919 1.486 2.210 0.1909 Total 15.490 Coefficient of Variation = 26.36% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 17.250 5.750 1.56 0.70 3.00 13.340 4.447 1.13 0.70 3.00 11.040 3.680 0.86 0.70 -Total 9.00 41.630 4.626 Within 1.22 Bartlett's test Chi-square = 0.578 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.749 Số chồi 60 ngày A N A L Y S I S 1.39 O F Degrees of V A R I A N C E Sum of T A B L E Mean 0.46 Freedom Squares Square F-value Prob Between 10.392 5.196 Within 11.146 1.858 2.797 0.1386 Total 21.539 Coefficient of Variation = 24.14% Var V A R I A B L E Number No Sum Average SD SE -1 3.00 21.350 7.117 0.99 0.79 3.00 15.720 5.240 1.83 0.79 3.00 13.740 4.580 1.11 0.79 -Total 9.00 50.810 Within Bartlett's test Chi-square = 0.745 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.689 5.646 1.64 1.36 0.55 ... sử dụng chất điều hoà sinh trưởng số tổ hợp lai lan Dendrobium mini 1.2 Yêu cầu Xác định mơi trường ni cấy thích hợp cho ba tổ hợp lai lan Dendrobium mini 1.3Nội dung thực - Ảnh hưởng môi trường. .. hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng, phát triển chồi tổ hợp lan lai 13(♀) x 16A(♂) 31 Bảng 4.6 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng, phát triển chồi tổ hợp lan lai 13(♀)... TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MƠI TRƯỜNG NI CẤY IN VITRO KHƠNG SỬ DỤNG CHẤT ĐIỀU HỒ SINH TRƯỞNG TRÊN MỘT SỐ TỔ HỢP LAI