BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CẢI TIẾN QUY TRÌNH TỔNG HỢP SỢI ĐÔI DOUBLE STRANDED RNA TRONG GIẢI PHÁP CHUYỂN ĐỔI GIỚI TÍNH TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực :NGUYỄN CHUYÊN THUẬN Niên khóa : 2009 - 2013 Tháng 6/2013 BỘ GIÁ ÁO DỤC VÀ V ĐÀO TẠ ẠO ƯỜNG ĐẠII HỌC NÔ ÔNG LÂM THÀNH P PHỐ HỒ CHÍ C MINH TRƯ B MƠN C BỘ CƠNG NG GHỆ SINH HỌC *** KHÓ K A LU UẬN TỐT T N NGHIỆ ỆP CẢI TIẾ ẾN QUY TRÌNH TỔNG HỢP H SỢII ĐÔI DO OUBLE STRA ANDED RNA TR RONG GIIẢI PHÁ ÁP CHUY YỂN H TÔM CÀNG X XANH ĐỔI GIIỚI TÍNH (M Macrobracchium ro osenbergiii) Hư ướng dẫn khoa k học Sinh viên thực h ThS BÙI THỊỊ LIÊN HÀ À UYỄN CHU UYÊN THU UẬN NGU Tháng 6/22013 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Nơng Lâm tận tình dạy dỗ, truyền đạt cho em kiến thức cho em Xin gửi lời tri ân sâu sắc tới Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà cất công hướng dẫn, bảo, truyền đạt lại cho em nhiều kiến thức, kĩ năng, thao tác thực hành người tạo điều kiện tốt giúp em hoàn thành tốt đề tài Xin chân thành cám ơn thầy, cô, anh chị làm việc Trung Tâm Quan TrắcCảnh Báo Môi Trường Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực phía Nam, anh chị trại thực nghiệm Thủ Đức bảo tận tình, giúp đỡ em để em sớm hồn thành đề tài Con xin chân thành ghi tạc công ơn sinh thành, dạy dỗ ba mẹ cho hình hài hoàn chỉnh cho học hành để có thành ngày hơm Xin Cám ơn bạn bên cạnh tôi! Sau thời gian thực tập phòng Sinh học thực nghiệm trại thực nghiệm Thủ Đức, em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Do kinh nghiệm phòng thí nghiệm non yếu, kiến thức khoa học hạn hẹp hạn chế thời gian thực tập nên khơng thể tránh khỏi sai sót luận văn Kính mong nhận góp ý chân thành từ phía thầy cơ, Hội đồng tốt nghiệp bạn! Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Nguyễn Chun Thuận i TĨM TẮT Tơm xanh (Macrobrachium rosenbergii) đối tượngthủy sảnnước có giá trị kinh tế cao Việt Nam nhiều nơi giới Trọng lượng tôm lớn lợi nhuận cao Khi tơm bước vào giai đoạn trưởng thành tơm đực thường có khối lượng lớn tơm giai đoạn tập trung dinh dưỡng cho trình sinh sản Do đó, q trình ni, đàn tồn đực cho suất cao hẳn so với đàn tồn đàn có lẫn đực Nhằm đem lại lợi nhuận cao cho người nuôi đối tượng này, có nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm tăng chất lượng tơm, cải thiện quy trình ương ni, chế độ dinh dưỡng, tôm bố mẹ, chọn giống,… Trong đó, nghiên cứu sản xuất đàn tơm giống tồn đực hướng nghiên cứu lạ có ưu vượt trội so với biện pháp khác nhằm đem lại lợi nhuận cao cho người nuôi tơm Khơng ngồi mục đích trên, nghiên cứu ứng dụng giải pháp công nghệ chuyển giới tôm xanh công nghệ RNA can thiệp nhằm tạo đàn tôm toàn đực Kết nghiên cứu khả quan sợi đôi RNA tổng hợp thành công Sau tổng hợp sợi đơi dsRNA, giải trình tự kết có trình tự tương đồng 99% so với trình tự mRNA mã hóa cho hormone tuyến đực Sagi Ventura công bố NCBI năm 2009 ii SUMMARY Thesis: “Optimization of dsRNA synthesis protocol to aly to make neo – female Macrobrachium rosenbergii” Freshwater Prawn (Macrobrachium rosenbergii) is an importantcomponent of shrimp exports and an earner foreign exachange Males of the giant freshwater prawn M rosenbergiigrow faster and reachhigher weight at harvest than females since females use considerable energy in egg production This is a fact which makes the culture of all - male populations desirable Up to now, there are many works to improve raising proceed, freshsprawn parents’s qualify, increase nutrions content, select good gender to make the highest income for farmer and using double – stranded RNA to make neo-female from male is one of the best and newest method bring us same aim.Cause of this reason, we carry out a research into this method to make neo - female Macrobrachium rosenbergii After a long time, we have gotten some satisfactory results We had dsRNA with the same sequence with mRNA encode Androgenic Gland Hormone publicized in NCBI by Sagi et al in 2009 with 99% ofidentities Key words: Macrobrachium rosenbergii, neo – female, dsRNA, RNAi iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i  Tóm tắt ii  Summary iii  Mục lục iv  Danh sách chữ viết tắt vii  Danh sách bảng biểu đồ viii  Danh sách hình ix  Chương MỞ ĐẦU 1  1.1. Đặt vấn đề 1  1.2. Yêu cầu đề tài .2  1.3. Nội dung đề tài 2  Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3  2.1. Tôm xanh 3  2.1.1.  Phân loại 3  2.1.2.  Phân bố 3  2.1.3.  Vòng đời tôm xanh 4  2.2. Tuyến đực tôm xanh 5  2.2.1.  Phụ đực tôm xanh 5  2.2.2.  Tuyến đực tôm xanh 5  2.2.3.  Hormone tuyến đực 8  2.3. Tác động tuyến đực lên phân hóa giới tính tôm xanh 8  2.4. Công nghệ chuyển giới tôm xanh 9  2.4.1.  Cơ sở lý thuyết tạo dòng tơm xanh tồn đực 9  2.4.2.  Các phương pháp tạo tôm giả 10  2.4.2.1  Dùng hormone 10  2.4.2.2  Cắt bỏ tuyến Androgenic tạo tôm giả ZZ 10  2.4.2.3  Cấy tuyến đực vào tôm .11  iv 2.4.3.  Các cơng trình nghiên cứu chuyển giới tôm 11  2.5. RNAi, chế tác động ứng dụng RNAi tạo tôm xanh giả 12  2.5.1.  Tổng quan RNAi 12  2.5.2.  Các cơng trình nghiên cứu RNAi giáp xác 13  2.5.3.  Cơ chế tác động 13  2.5.4.  Ứng dụng việc tạo tôm xanh chuyển 14  Chương 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15  3.1. Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 15  3.2. Vật liệu 15  3.2.1.  Vật liệu chuẩn bị cho DNA mạch khuôn 15  3.2.1.1  Tăng sinh dòng vi khuẩn E coli JM109 mang vector tái tổ hợp .15  3.2.1.2  PCR để có lượng lớn DNA mạch khuôn 16  3.2.1.3  Tinh vector pGEMT - Mr - IAG 16  3.2.1.4  Giải trình tự 16  3.2.2.  Vật liệu cho kiểm tra chất lượng DNA mạch khuôn trước tổng hợp sợi đôi 16  3.2.2.1.  Kiểm tra phản ứng PCR với mồi đặc hiệu .16  3.2.2.2.  Dùng enzyme cắt giới hạn xử lý vector 16  3.2.2.3.  Giải trình tự 16  3.2.3.  Vật liệu cho tổng hợp sợi đôi dsRNA 16  3.2.4.  Vật liệu kiểm tra sợi đôi dsRNA sau tổng hợp 16  3.2.5.  Vật liệu cho tiêm thử nghiệm sợi đôi dsRNA tôm PL17 PL25 17  3.3. Dụng cụ thí nghiệm: 17  3.4. Phương pháp nghiên cứu 18  3.4.1.  Kiểm tra diện tế bào E.coli JM109 mang vector tái tổ hợp 18  3.4.2.  Tăng sinh khối tế bào E coli JM 109 mang vector tái tổ hợp 18  3.4.3.  Giải trình tự hai chiều 19  3.4.4.  Tổng hợp Mr - IAG ds RNA theo kit Promega 19  3.4.5.  Tiêm thử nghiệm tôm để khảo sát tần suất tiêm tạo tôm giả 20  3.4.6.  Kiểm tra kết tiêm thử nghiệm tôm 21  Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22  v 4.1.  Kiểm tra chất lượng DNA mạch khuôn trước tổng hợp sợi đôi dsRNA 22  4.1.1.  Khuếch đại môi trường vi khuẩn E coli mang vector tái tổ hợp pGEMT – Mr IAGđã tinh với cặp mồi đặc hiệu 22  4.1.2.  Dùng enzyme cắt giới hạn xử lý vector tái tổ hợp pGEMT - Mr IAG 23  4.1.3.  Giải trình tự để so sánh với trình tự Mr – IAG Sagi ctv công bố NCBI năm 2009 23  4.2. PCR để có lượng lớn DNA mạch khn 25  4.3. PCR sợi đơn cDNA sense antisense tinh kit 25  4.4. Tổng hợp sợi đơn RNA sense antisense 26  4.5. Kiểm tra phản ứng tổng hợp sợi đôi dsRNA loại enzyme .27  4.6. Kết khảo sát tần suất tiêm thí nghiệm PL17 PL25 .29  Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35  5.1. Kết luận 35  5.2. Đề nghị 35  TÀI LIỆU THAM KHẢO .36  PHỤ LỤC 40  vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µl : Microlitre AG : Androgenic Gland AGH : Androgenic Gland Hormone ATP : Adenosine Triphosphate bp : base pair cdna : Complementary deoxyribonucleic acid ctv : cộng tác viên DEPC : Diethyl Pyrocarbonate DNA : Deoxyribonucleic acid DNase : Deoxyribonuclease dsRNA : double - stranded Ribonucleotide Acid ĐBSCL : Đồng song Cửu Long FAO : Food and Agriculture Organization RNAi : interference Ribonucleotide Acid LB : Luria - Bertani Mr – IAG : Macrobrachium rosenbergii Androgenic Gland specific insulin-like NCBI : National Center for Biotechnology Information NST : Nhiễm sắc thể PCR : Polymerase Chain Reaction PL : post larvare PTGS : post - transcriptional gene silencing RISC : Ribonucleotide induced silencing complex RNA : Ribonucleotide Acid Rnase : Ribonuclease enzyme sRNAi : small interfering Ribonucleotide Acid TBE : Tris bonic acid UV : Ultra Violet - tia cực tím vii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 3.1 Trình tự mồi hỗn hợp phản ứng 20 Bảng 3.2 Thí nghiệm thức tiêm thử nghiệm tôm đợt 21 Bảng 3.3Thí nghiệm thức tiêm thử nghiệm tơm đợt 21 Bảng 4.1 Tỉ lệ tơm sống sau tháng thí nghiệm đợt 29 Bảng 4.2 Tỉ lệ tơm sống sau tháng thí nghiệm đợt 29 Bảng 4.3 Tỉ lệ tôm chuyển sau tiêm dsRNA tháng đợt 30 Bảng 4.4 Tỉ lệ tôm chuyển sau tháng tiêm dsRNA đợt 31 Biểu đồ 4.1Sự thay đổi số lượng tơm ương số lượng tơm sống sau 1, tháng 29 Biểu đồ 4.2 Số lượng tôm ươm so với tôm sống 1; tháng đợt tiêm thí nghiệm thứ 30 viii Sau lai sợi đơn RNA sense antisense 70oC 10 phút, xử lý sản phẩm thu với enzyme Dnase, Rnase, Rnase III, Dnase + Rnase, tiến hành điện di kiểm tra kết Ở bước này, nghiên cứu kiểm chứng lại lần trình tự gene đích có tổng hợp thành cơng để chuyển thành sợi đơi dsRNA hay khơng Các mẫu pha lỗng 50 lần để thực bước kiểm tra chất lượng Các giếng bên trái thang DNA giếng thể phản ứng kiểm tra sợi đơn Giếng S sợi đơn RNA sense, giếng D sợi đơn RNA sense xử lý với DNase, giếng R sợi đơn RNA sense xử lý với RNase, giếng D + R sợi sense xử lý với hai loại enzyme DNase Rnase Bên phải thang DNA giếng thể phản ứng kiểm tra sợi đôi dsRNA Giếng DS sợi đôi dsRNA sau lai hai mạch sense antisense, giếng D sợi đôi dsRNA xử lý với DNase, giếng R sợi đôi dsRNA xử lý với RNase, giếng D + R sợi đôi dsRNA xử lý với hai enzyme DNase RNase, giếng RIII sợi đôi dsRNA xử lý với RNase III, giếng C Positive control Khi kiểm tra xử lý sợi single-strandedRNA (sense antisense) với RNase, sợi bị phân hủy enzyme nên điện di không cho vạch xuất gel Nhưng xử lý với DNase khơng bị phân giải có băng hình xuất gel với kích thước khoảng 520 bp Khi xử lý với hỗn hợp hai enzyme DNase RNase có diện RNase nên kết sau điện di không cho băng hình gel Khi xử ký kiểm tra sợi double-stranded RNA sợi đơi nên khơng bị phân giải RNase Tuy sợi đơi chất khơng phải DNA nên không bị phân giải DNase Khi xử lý hỗn hợp hai enzyme DNase RNase không bị phân giải Cho nên tất giếng cho băng hình kích thước khoảng 520 bp agrose 1,5% Tuy nhiên xử lý RNase IIImột loại enzyme có khả phân giải RNA sợi đơi gel điện di khơng cho băng hình sản phẩm double-stranded.Positive control cho kết gel điện di với kích thước khoảng 1000 bp Như vậy, sợi đôi dsRNA tổng hợp thành công tiêm thí nghiệm tơm 28 4.6 Kết khảo sát tần suất tiêm thí nghiệm PL17 PL25 Bảng 4.1 Tỉ lệ tôm sống sau tháng thí nghiệm đợt 1( PL17) Nghiệm Tháng thứ Tháng thứ hai Tháng thứ ba thức Ban đầu Còn lại Ban đầu Còn lại Ban đầu Còn lại Tuần lần 12 10 10 10 10 Tuần lần 12 10 10 9 tuần lần 12 11 11 11 11 Đối chứng 10 10 10 9 Biểu đồ Sự thay đổi số lượng tôm ương số lượng tơm sống sau 1; tháng (PL25) Tỉ lệ sống sót tơm ba nghiệm thức so với số lượng tôm ban đầu đợt tiêm thứ sau tháng tiêm 86,1%, sau tháng tiêm 83,3% sau tháng tiêm 55,6% Trong đó, tỉ lệ sống nghiệm thức đối chứng 90% Nguyên nhân dẫn đến hao hụt số lượng tơm thí nghiệm hao hụt q trình ni bắt tơm để tiêm kiểm tra chuyển 29 Bảng 4.2 Tỉ lệ tơm sống sau tháng thí nghiệm đợt ( PL25) Tháng thứ Nghiệm Tháng thứ hai Tháng thứ ba thức Ban đầu Còn lại Ban đầu Còn lại Ban đầu Còn lại Tuần lần 15 15 15 13 Tuần lần 13 10 10 tuần lần 15 15 15 15 11 10 Đối chứng 13 13 13 10 10 10 Biểu đồ Biểu đồ số lượng tôm ươm so với tơm sống 1; tháng đợt tiêm thí nghiệm thứ (PL25) Tỉ lệ sống sót tơm ba nghiệm thức so với số lượng tôm ban đầu đợt tiêm thứ hai sau tháng tiêm 93%sau tháng tiêm 81,4% sau tháng tiêm 48,8% Trong đó, tỉ lệ sống nghiệm thức đối chứng 100% sau tháng 76,9%sau tháng sau tháng nuôi 76,9% Nguyên nhân dẫn đến hao hụt số lượng tơm thí nghiệm hao hụt q trình ni bắt tơm để tiêm kiểm tra chuyển 30 Bảng 4.3 Tỉ lệ tôm chuyển sau tiêm dsRNA tháng đợt 1: PL17 (7/2/2013) Chỉ tiêu theo dõi Nghiệm thức tuần lần tuần lần tuần lần Số lượng ban đầu 12 12 12 Số lượng lại 7 Số lượng tơm chuyển 7 7 thời điểm ngưng tiêm Số lượng tơm lại sau ngưng tiêm tháng Tỉ lệ tôm chuyển bị “lại đực” đợt 0% cho nghiệm thức 1tuần/ lần tiêm, tuần/1 lần tiêm tuần/ lần tiêm Tức toàn tôm chuyển không bị lại đực Bảng 4.4Tỉ lệ tôm chuyển sau tháng tiêm dsRNA đợt 2: PL25 (15/2/2013) Chỉ tiêu theo dõi Nghiệm thức tuần lần tuần lần tuần lần Số lượng ban đầu 15 13 15 Số lượng lại 10 Số lượng tôm chuyển 10 thời điểm ngưng tiêm Số lượng tơm lại sau ngưng tiêm tháng Tỉ lệ tôm chuyển bị “lại đực” đợt tiêm thứ nghiệm thức tuần/ lần tiêm, tuần/ lần tiêm tuần/ lần tiêm 0%, 75%, 20% cao so với tỉ lệ tôm lại đực sau tiêm đợt tiêm PL17 Đàn tơm thí nghiệm sau loại bỏ chuyển không thành công, chuyển giới thành công tiêm sợi đôi dsRNA đánh dấu phẩm màu flourence Sau hai tháng tiêm thử nghiệm dsRNA tôm chuyển thục sinh dục với chiều dài trung bình khoảng cm, trọng lượng khoảng – g Hiện chúng tiếp tục nuôi giữ theo dõi trại thực nghiệm Thủ Đức 31 Hình 4.8Tơm chuyển đánh dấu thục sinh dục, mang trứng đầu A: tôm chuyển đánh dấu thuốc nhuộm Flourence; B, C: Tôm thành thục mang trứng đầu; D: đo kích thước tơm mang trứng đầu đánh dấu Theo Nguyễn Thanh Phương ctv (2003) tôm đực nhánh phụ đực nằm kế nhánh chân bụng thứ (chỉ có chân bụng thứ có nhánh phụ đực chân khác khơng có), khơng có nhánhnày Có thể quan sát nhánh phụ đực kính hiển vi tơm biệt hóa giới tính Dựa vào đặc điểm tơm thí nghiệm quan sát kính hiển vi để kiểm tra kết chuyển sau tiêm dsRNA Khi kiểm tra tơm thí nghiệm mắt thường khơng nhìn thấy lỗ sinh dục gốc chân bụng số tôm đực chứng tỏ tôm chuyển thành công Quan sát chân bụng số kính hiển vi khơng thấy có hình thành gai sinh dục phụ đực 32 Sau ngưng tiêm tháng, kiểm tra lại tôm chuyển thành công (tại thời điểm ngưng tiêm chăm sóc, theo dõi trại thực nghiệm Thủ Đức) có tượng “lại đực” Nguyên nhân nồng độ dsRNA đưa vào thể chưa đủ để ức chế hoàn toàn mRNA mã hóa cho hormone tuyến đực đó, sau lượng mRNA thể tôm tăng lên theo thời gian tơm trưởng thành hoạt động, mã hóa cho hormone tuyến đực làm cho xuất gai sinh dục phụ đực Chính thế, có “đực bất thường” với nhú sinh dục nhỏ xuất chân ngực số gai sinh dục nhỏ chân bụng số kiểm tra kính hiển vi số tơm chuyển thành cơng thời điểm ngưng tiêm Hình 4.9 Tơm đực, tơm kiểm tra chân bơi kính hiển vi A: tôm kiểm tra mắt thường B: chân bụng số kiểm tra kính hiển vi C: tôm đực kiểm tra mắt thường D: chân bụng số kiểm tra kính hiển vi E: chân bụng số tơm có dấu hiệu bất thường kính hiển vi 33 Tỷ lệ tôm chuyển sau tháng tiêm tôm chưa cao tất nghiệm thức hai đợt tiêm Nguyên nhân tiêm tuổi tơm q nhỏ tương đương kích thước tơm nhỏ, đưa dsRNA vào thể, thuốc không vào hết, thao tác lần tiêm không đồng nhất, thuốc vào không đủ liều thuốc vào tôm giãy giụa làm thuốc trào ngồi Tăng trưởng tơm thí nghiệm: Sau tháng tiêm thuốc tơm tăng trưởng khơng đều: kích thước lớn nghiệm thức có tần suất tiêm tuần/ lần kích thước nhỏ nghiệm thức tần suất tiêm lần/ tuần Nguyên nhân nghiệm thức có tần suất tiêm dày tơm nhạy cảm bị thương liên tục, nhạy cảm, yếu, dễ chết Bên cạnh đó, tơm thả ni lưới nhỏ bể xi măng để dễ dàng bắt lên tiêm nên tôm phát triển không tốt nuôi điều kiện tự nhiên Thời gian tiêm tháng dài gây nhiều điểm bất lợi tơm thí nghiệm bị tổn thương nhiều lần, dễ chết, tăng trọng, dễ nhiễm khuẩn Bên cạnh đó, giá thành cho sản phẩm tạo tơm giả cao hóa chất tiêm, nhân cơng thực tiêm nuôi dưỡng tôm 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Thiết lập quy trình ổn định thu nhận gene mục tiêu với độ tương đồng với trình tự cơng bố ngân hàng NCBI năm 2009 99% Tối ưu quy trình tổng hợp sợi đơi dsRNA với nồng độ cao theo khuyến cáo kit Tỉ lệ chuyển không phụ thuộc vào nồng độ dsRNA tiêm vào báo cáo trước mà phụ thuộc nhiều vào độ tuổi tôm bắt đầu tiêm.Độ tuổi tơm nhỏ (< PL20) hội chuyển tiêm dsRNA cao Hiệu dsRNA bước đầu kiểm chứng qua chuyển tơm thí nghiệm thành thục sinh dục vớibiểu có mang trứng đầu 5.2 Đề nghị Tiếp tục theo dõi tôm chuyển tôm thành thục sinh dục ghi nhận lại kết Thực thêm thí nghiệm khảo sát: - Tiêm thử nghiệm đối tượng tôm xanh độ tuổi nhỏ PL< PL10 - Rút ngắn thời gian số lần tiêm dsRNA cho tôm - Đưa hệ thống xử lý nước tuần hồn vào khu vực thí nghiệm để tăng tỉ lệ sống cho tơm thí nghiệm 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Thủy sản 2004 Kết nuôi trồng thủy sản năm 2003, kế hoạch giải pháp thực năm 2004 Chính phủ Việt Nam 1999 Phê duyệt Chương trình phát triển ni trồng thủy sản thời kỳ 1999-2010 Quyết định số 224/1999/QĐ-TTg, Hà Nội Lê Chính 2012 Báo cáo tập Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Tuần, Hoàng Thị Thủy Tiên, Lâm Quyền, Nguyễn Đức Minh, Nguyễn Nhứt Huỳnh Thị Hồng Châu 2004 Kết bước đầu sản xuất giống tơm xanh tồn đực.Tuyển tập nghề cá Đồng Bằng Sông Cửu Long Nhà xuất Nông Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, 159 - 177 Nguyễn Mộng Hùng Bùi Việt Anh 2004.Cắt bỏ tuyến Androgen gây chuyển đực sang tôm macrobrachium nionenese de Haans Tạp chí di truyền học ứng dụng, 31 - 36 Lý Văn Khánh Nguyễn Thanh Phương 2006 Ảnh hưởng kích cỡ giống lên suất tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) nuôi mương vườn Vĩnh Long.Tạp chí khoa học, Đại Học Cần Thơ, 144 - 149 Lê Quang Khôi 2009 Kỹ thuật sản xuất giống nuôi tôm xanh thương phẩm.Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thị Lang 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học.Nhà xuất Nơng nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Thanh Thủy 2002 Kỹ thuật sản xuất giống tôm xanh Macrobrachium rosenbergii.Nhà xuất Nông Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh 10 Chung Quang Trí 2006 Thử nghiệm dùng hormon đực giáp xác thuộc mười chân Decapoda để đực hóa hậu ấu trùng tơm xanh Macrobrachium rosenbergii(de Man) Khóa luận cử nhân khoa học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên (ĐHQG Thành Phố Hồ Chí Minh), Hồ Chí Minh 11 Đỗ Năng Vịnh 2007 Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn.Tạp chí Cơng Nghệ Sinh Học, 5: 265-275 Tài liệu tiếng Anh 12 Sagi A and A£alo E.D 2005 The androgenic gland and monosex culture of freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (De Man): a biotechnological perspective Aquaculture Research, 36: 209- 316 13 Sagi A and Cohen D 1990 Grow, maturation and progeny of sex-reversed Macrobrachium rosenbergii males World Aquaculture, 21: 87 14 Sagi A., Cohen D and Milner Y 1989 Effect of androgen gland ablation on morphotypic differentiation and sexual characteristics of male Freshwater Prawn, Macrobrachium rosenbergii General and comparative endocrinology, 77:15-22 36 15 BaghelD.S., Lakra W.S and Rao G.P.S 2004 Altered sex ratio in giant fresh water prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man) using hormone bioencapsulated live Artemia feed Aquac Res, 35: 943-947 16 Carpenter M.B and De Roos R 1970 Seasonal morphology and histology of the androgenic gland of the crayfish, Orconectesnais.General and Comparative Endocrinology 15: 143-157 17 Charniaux-Cotton H andPayen G 1985 Sex differentiati The biology of Crustacea, 9: 147-215 18 Aflalo E.D., HoangT.T.T., NguyenV.H., LamQ., NguyenD.M., TrinhQ.S., RavivS and SagiA.2006.A novel two-step procedure for mass production of allmale populations of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii Aquaculture,256: 468 - 478 19 FAO 2009 Fisheries and Aquaculture Information and Statistics Service Available from: URL:http://www.fao.org/figis/servlet/SQServlet?xmlfile=webas%2Ffigis%2Ftemp%2 Ffigis_guest53172_res.xml&outtype=ht ml&xp_p1=1 20 Fire A 1998 Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature,391:806-811 21 Yang J and SnellT W 2010 Effects of progesterone, testosterone, and estrogen on sexual reproduction of the rotifer Brachionus calyciflorus International Review of Hydrobiology,95: 441 - 449 22 Hasegawa Y., Okuno A and Nagasawa H.2002.Immunohistochemical study of androgenic gland hormone: localization in the male reproductive system andspecies specificity in the terrestrial isopods Gen Comp Endocrinol,125: 218 - 225 23 Hasegawa, Y., HiroseE., and KatakuraY 1993 Hormonal control of sexualdifferentiation and reproduction in Crustacea.Am Zoo, 33: 403 - 411 24 Hutvagner G and Zatmore P D 2002 A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.Science, 297:2056-2060 25 Katakura Y.1989 Endocrin and genetic control of sex differenciation in the malacostracan Crustacea.Invert Reprod Development, 16:177-182 26 Kim D.H, Behlke M.A, Rose S.D, Chang M.S, Choi S and Rossi J.J.2005 Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy Nat Biotechnol, 23:222-226 27 King D.S 1964 Fine structure of the androgenic gland of the crab, Pachygrapsus crassipes.General and Comparative Endocrinology, 4:533-544 28 Malecha S.R 1983a.Commercial pond production of the freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii in Hawai.CRC Handbook of Mariculture,1: 205 - 230 29 Malecha S.R 1983b Crustacean genetics and breeding: an overview Aquaculture, 33:395-413 30 Malecha S.R., Nevin P.A., Ha P., Barck L.E., Lamadrid-Rose Y., Masuno S and Hedgecock D 1992 Sex ratios and sex determination in progeny from crosses of 37 surgically sex reversed freshwater rosenbergii.Aquaculture,105: 201-218 prawn, Macrobrachium 31 Malecha S R., Masuno S and Onizuka D.1984 The feasibility of measuring the heritability of growth pattern variation in juvenile freshwater prawns, Macrobrachium rosenbergii (de Man).Aquaculture, 38: 347-363 32 MartinG.,SorokineO.,MoniatteM.,BuletP., Hetru C and Van Dorsselaer A 1999 The structure of a glycosylated protein hormone responsible for sex determination in the isopod, Armadillidiumvulgare.European Journal of Biochemistry, 262:727736 33 Nagamine C., Knight A.W., Maggenti A and Paxman G 1980a Effect of androgenic gland ablation on male primary and secondary sexual characteristics in the Macrobrachium rosenbergii (de Man).General and Comparative Endocrinology, 41:423-441 34 Nagamine C., Knight A.W., Maggenti A and Paxman G 1980b Masculinization of female Macrobrachium rosenbergii (de Man) (Decapoda, Palaemonidae) byandrogenic gland implantation.General and Comparative Endocrinology, 41: 442-457 35 Hung N.M., Anh B.V., Trung C.V and Quang P.N 2004 The study of sex reverse from male to female after the Androgenic gland ablation in Macrobrachium nipponens de Haans & the beginning of stem cell research in Viet Nam Proceedings of the first workshop of the asian reproductive biothechnology society 36 Ohs C.L., D`abramo L.R and Kelly A.M 2006 Effect of dietary administration of 17α-methyltestosterone on the sex ratio of postlarval freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, during the nursery stage of culture Journal of the World Aquaculture Society, 37: 34-46 37 Ohs C.L., D`abramo L.R., Hanson L.P and Kelly A.M 2006 Aarent control of sexual differentiation of freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, through dietary administration of dopamine hydrochloride.Journal of Alied Aquaculture,18: 19-32 38 Okumura T 2004.Perspectives on hormonal reproduction.Jpn Agr Res Q, 38:49-54 manipulation of shrimp 39 OkumuraT and Hara M 2004 Androgenic gland cell structure and spematogenesis during the molt cycle and correlation morphotypic differentiation in the giant fresshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii Zoological science,21: 621 - 628 40 Ra’anan Z and Sagi A 1985.Alternative mating strategies in male morphotypes of the freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (de Man).Biological Bulletin, 169: 592-601 41 Ra’anan Z and D Cohen 1984 Ontogeny of social structure and population dynamics in the fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii (de Man), 277-311 38 42 Sagi A., Khalaila I., Barki I., Hulata G and Karplus I 1996 Intersex red claw crayfish, Cherax quadricarinatu (Von martens): functional males with pre viellogeneic ovaries Biol.Bull,190: 16 - 23 43 Taketomi Y 1986 Ultrastructure of the androgenic gland of the crayfish, Procambarus clarkii.Cell Biology International Reports, 10:131-136 44 Taketomi Y and NishikawaS.1996.Implantation of androgenic glands into immature female crayfish, Procambarus clarkii, with masculinization of sexual characteristics.J Crust Biol,16: 232-239 45 Taketomi Y., Murata M and Miyawaki M 1990 Androgenic gland and secondary sexual characteristic in the crayfish Procambarus clarkii.Journal of Crustacean Biology, 10:492-497 46 Taketomi Y., Nishikwa S and Koga S 1996 Testis and androgenic gland during development of the external sexual characteristics of the crayfish Procambarus clarkii.Journal of Crustacean Biology, 16:24-34 47 Uno Y and KwonS.1969 Larval development of Macrobrachium rosenbergii reared in the laboratory Journal of the Tokyo University of Fisheries, 55:179-190 48 Veith W J andMalecha S R 1983 Histochemical study of the distribution of lipids, alpha-and beta-hydrosteroid dehydrogenase in the androgenic gland of the cultured prawn,Macrobrachium rosenbergii(de Man) (Crustacea; Decapoda) S Afri J Sci, 79:84-85 49 Ventura T., Manor R., Aflalo E.D., Weil S., Raviv S., Glazer L and Sagi A.2009 Temporal silencing of an androgeneic gland - specific insulin - like gene affecting phenotypical geneder differences and spermatogenesis Department of Life General Endocrinology,150: 1278 - 1286 50 Narksen W.2008 Purifiaction and characterization of Androgenic Gland Hormone from Giant Freshwater Prawn, Mactobrachium rosenbergii de Man Master of science thesis of Kasetsart university 51 Wickins J.F., Beard T.W 1974 Observations on the breeding and growth of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (de Man) in the laboratory Aquaculture, 3:159-174 52 ChenYH., JiaXT., Zhao L., LiCZ., ZhangS., ChenYG., WengSP and HeJG 2011 Identification and functional characterization of Dicer2 and five single VWC domain proteins of Litopenaeus vannamei.Developmental & Comparative Immunology, 35:661 - 671 Tài liệu từ internet Phạm Hằng Sản xuất nông nghiệp năm 2011: Đại thắng gian khó.2011 http://www.dangcongsan.vn/cpv/Modules/News/NewsDetail.aspx?co_id=30066 &cn_id=498245 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/212726128 39 PHỤ LỤC Bảng 1.Tóm tắt đặc điểm tơm đực tơm Đặc điểm Kích cỡ Càng Lỗ sinh dục Tôm đực Tôm Lớn đầu ngực to Nhỏ đầu ngực nhỏ tôm tôm đực Đôi thứ to, ghồ Nhỏ nhẵn ghề, nhiều gai tôm đực Hiện diện gốc Hiện diện gốc chân ngực thứ năm có chân ngực thứ ba, có màng nắp đậy mỏng bao phủ Tơm thành thục có Bụng Mặt bụng có đốt thứ bụng thứ nhất, thứ 2, thứ có điểm cứng ba dài nở rộng, hình thành buồng ấp trứng Xuất nhiều chân Lông tơ sinh dục Khơng có ngực chân bụng tơm trưởng thành Tuyến androgeneic Dãy tế bào dính vào vùng cuối ống dẫn tinh Khơng có Chiều dài kích cở thành Chiều dài 17,5cm, trọng Chiều dài 15cm, trọng thục lượng trung bình 35g lượng trung bình 25g Xuất nhánh Phụ giao vĩ nhánh phụ chân bụng thứ (Nguyễn Thanh Phương Trần Ngọc Hải, 2009) Khơng có Hình Các phương pháp tạo tơm tồn được nghiên cứu (Amir Sagi Eliahu D Aflalo, 2005) Tổng hợp cDNA mạch khuôn cho geneMacrobrachium rosenbergii insulin–like androgen gland (Mr–IAG) Tôm xanh đực trưởng thành (18–30) g Tách chiết RNA tổng số Kiểm tra sản phẩm có kích thước 163 bp cDNA mạch khn Dòng hóa giải trình tự cDNA Dòng hóa sản phẩm PCR Giải trình tự chiều Tổng hợp Mr–IAG dsRNA phương pháp in vitro Phương pháp bước Phương pháp bước Thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA vào tơm PL25 Nồng độ 5µg Mr–IAG dsRNA/g Hình Sơ đồ nghiên cứu tổng hợp sợi đôi dsRNA ứng dụng giải pháp công nghệ chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii ( Lê Chính, 2012) ... cứu Cải tiến quy trình tổng hợp sợi đôi double stranded RNA giải pháp chuyển đổi giới tính tơm xanh (Macrobrachium rosenbergii) ”là cần thiết 1.2 Yêu cầu đề tài Mục tiêu đề tài cải tiến ổn định quy. .. từ mRNA không tổng hợp Quá trình dịch mã gene bị bất hoạt 2.5.4 Ứng dụng việc tạo tôm xanhchuyển Kỹ thuật RNAi sử dụng cho giải pháp chuyển đổi giới tínhtơm xanh dựa ngun tắc thiết kế đoạn trình. .. quy trình thử nghiệm tạo sợi đôi dsRNA nhằm ứng dụng việc chuyển giới tơm xanhcho mục đích sản xuất quần thểtơm tồn đực 1.3 Nội dung đề tài - Tối ưu lại quy trình tổng hợp Mr-IAG RNA mạch đôi (sợi