BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP VÀ LACTOBACILLUS SPP ĐỐI VỚI MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1515100007 : LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG Lớp: 15HSH01 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực PhẩmMôi Trường trường Đại Học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác với hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin chịu tồn trách nhiệm đồ án TP.HCM, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên thực Lê Ngô Vũ Phượng i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người ni nấng dạy dỗ khuyến khích tạo điều kiện cho học tập để có thành ngày hơm Trong suốt khoảng thời gian học trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em thây, cô khoa Cơng Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Mơi Trường hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trình học tập trường trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn đến q Thầy, Cơ nhờ có thầy, trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Hương, tận tình hướng dẫn, bảo em suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương thực hiện, hoàn thành đồ án Em xin cám ơn Thầy, Cơ phòng thí nghiệm bạn bè quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn Thầy, Cô Hội Đồng Phản Biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe TP HCM, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên thực Lê Ngô Vũ Phượng ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TÔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm: 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Độc tố .4 nấm tiết 1.1.3 Tác hại nấm 1.1.3.1 Tác hại nấm gây cho người động vật 1.1.3.2 Tác hại 1.1.4 Một số chủng nấm nấm gây gây cho hại thực thực vật phẩm 1.2 Tổng quan hợp chất kháng nấm: 1.2.1 Hợp chất kháng 10 nấm hóa học 1.2.2 Tác hại hợp chất kháng nấm hóa học .10 1.2.3 Hợp chất kháng nấm sinh học .13 1.2.3.1 Hợp chất kháng nấm từ thực vật: 13 1.2.3.2 Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: 17 a Khả kháng nấm mốc Bacillus spp 17 b Khả kháng nấm mốc Lactobacillus spp 19 1.3 Các phương pháp sàng lọc chủngVSV kháng nấm mốc: 21 1.3.1 Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy đường vi khuẩn) 21 1.3.2 Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) .23 1.3.3 Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa lớp): 25 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Địa điểm nghiên cứu: 26 2.2 Thời gian nghiên cứu: .26 2.3 Vật liệu nghiên cứu: 26 2.3.1 Giống vi sinh vật: 26 2.3.1 Hóa chất mơi trường sử dụng 26 2.3.1.1 Hóa chất: .26 2.3.1.2 Môi trường nuôi cấy: 26 2.4 Thiết bị dụng cụ: 27 2.4.1 Thiết bị: 27 2.4.2 Dụng cụ: 28 2.5 Phương pháp luận: 28 2.6 Phương pháp nghiên cứu: 29 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 2.6.2 Khảo sát tăng trường nấm mốc: 30 2.6.3 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp ria đường vi khuẩn chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: 30 2.6.4 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp đặt thạch khuếch tán chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc: 35 2.6.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa lớp chủng vi khuẩn Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: 39 2.6.6 Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa số chủng vi khuẩn 43 2.6.6.1 Nhuộm gram 43 2.6.6.2 Nhuộm bào tử 44 2.6.6.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: .44 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 3.1 Định danh sơ khảo sát sinh lý - sinh hóa số chủng vi khuẩn 45 3.1.1 Nhuộm Gram: 45 3.1.2 Nhuộm bào tử: 46 3.1.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 47 3.2 Khảo sát tăng trưởng nấm mốc: 48 3.3 Khảo sát khả đối kháng trực phương pháp ria đường vi khuẩn chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc: 50 3.4 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp đặt thạch khuếch tán chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc: 66 3.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa lớp chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc 81 3.6 So sánh khả đối kháng nấm mốc 20 chủng vi khuẩn thông qua cách chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) 90 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 PHỤ LỤC Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactobacillus spp NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth MT Môi trường PDA Potato dextrose agar VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học sử dụng để bảo quản hạt giống Bảng 1.2.Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) 18 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng Bacillus spp 45 Bảng 3.2 Một số phản ứng sinh hóa chủng Bacillus spp .47 Bảng 3.3 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp cấy đường vi khuẩn 53 Bảng 3.4 So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 54 Bảng 3.5 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp cấy đường vi khuẩn 62 Bảng 3.6 So sánh số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp cấy đường vi khuẩn .63 Bảng 3.7 Thống kê số liệu vòng ức chế chủng nấm mốccủa chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán 68 Bảng 3.8 So sánh sô liệu vòng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 69 Bảng 3.9 Thống kê số liệu vòng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán 76 vii Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán .77 Bảng 3.11 Thống kê số liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp đỗ dĩa lớp 84 Bảng 3.12 Sắp xếp sơ liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus spp nhóm theo phương pháp đõ dĩa lớp 85 Bảng 3.13 Sắp xếp số liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp đỗ dĩa lớp 89 Bảng 3.14 Sắp xếp sơ liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp nhóm theo phương pháp đỗ dĩa lớp .90 Bảng 3.15 Thống kê điểm chủng vi khuẩn Bacillus spp theo phương pháp dựa theo xếp hạng 91 LSD Bảng 3.16 Thống kê điểm chủng vi khuẩn Lactobacillus spp theo phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 92 HCP2: TI LE UC CHE NAM HCP2 21:09 Thursday, July 23, 2016 24 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels HCP2 Values 11 10 DCNYSTAT Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 TI LE UC CHE NAM HCP2 21:09 Thursday, July 23, 2016 25 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of Source 10 DF Squares 6163.394539 Error 22 Mean Square 616.339454 292.956067 Corrected Total 32 DF 6163.394539 TI LE UC CHE NAM HCP2 F Model 6456.350606 R-Square Source F Value Anova SS Root MSE 10.30976 3.649135 Mean Square 616.339454 46.28 TILEKHANG Mean F Value 29.64424 Pr > F HCP2 F Model F CDP1 F Model 0.0088 260.7134500 R-Square DF F Value 35.7641567 Corrected Total 17 Source Mean Square Coeff Var Root MSE 0.685890 10.69751 Anova SS Mean Square VONGUCCHE Mean 2.612353 F Value 13.97167 Pr > F DN3 178.8207833 VONG UC CHE NAM DN3 35.7641567 5.24 0.0088 21:52 Thursday, July 29, 2016 23 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 12 6.824389 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 4.6474 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N DN3 A 20.723 1(L5) B 14.500 3(LN2-5) 12.723 4(LN2-7) 12.110 6(LN3-7) 11.997 2(L6) 11.777 5(LN3-5) B B B B B B B B DN2: VONG UC CHE NAM DN2 21:52 Thursday, July 29, 2016 25 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values DN2 ONG UC CHE NAM DN2 123456 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 21:52 Thursday, July 29, 2016 26 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Source DF 122.1141611 Error Squares Mean Square 24.4228322 12 Corrected Total 2.59 Coeff Var 0.518683 DF 122.1141611 9.4431000 235.4313611 R-Square Source Pr > F Model 0.0824 113.3172000 17 F Value Anova SS 24.4228322 Root MSE 10.00231 Mean Square 2.59 VONGUCCHE Mean 3.072963 F Value 12.80278 Pr > F DN2 0.0824 VONG UC CHE NAM DN2 21:52 Thursday, July 29, 2016 27 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 12 9.4431 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 5.4668 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N DN2 A 18.223 1(L5) 13.557 3(LN2-5) 12.110 5(LN3-5) 11.390 6(LN3-7) 10.777 2(L6) 10.760 4(LN2-7) A B A B B B B B B B B CDP1: VONG UC CHE NAM CDP1 21:52 Thursday, July 29, 2016 33 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CDP1 123456 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 VONG UC CHE NAM CDP1 21:52 Thursday, July 29, 2016 34 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Source DF 292.3496444 Error 12 Corrected Total Squares 58.4699289 18.24 38.4626667 17 DF 292.3496444 F Value Pr > F Model F CDP1 F Model 271.7622444 R-Square Source F Value Anova SS Root MSE VONGUCCHE Mean 10.88958 4.134398 Mean Square F Value 13.32864889 0.78 VONG UC CHE NAM CDP2 13.38444 Pr > F CDP2 0.5830 21:52 Thursday, July 29, 2016 39 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t 12 17.09325 2.17881 Least Significant Difference 7.355 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean A N CDP2 17.277 1(L5) 13.943 3(LN2-5) 13.090 6(LN3-7) 12.720 4(LN2-7) 11.890 5(LN3-5) 11.387 2(L6) A A A A A A A A A A HCP2: VONG UC CHE NAM HCP2 22:53 Thursday, July 29, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels HCP2 Values 123456 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 VONG UC CHE NAM HCP2 22:53 Thursday, July 29, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Source DF Squares 40.53496111 Error 12 Mean Square 8.10699222 44.08193333 Corrected Total 17 DF 40.53496111 Pr > F Model 0.1213 3.67349444 84.61689444 R-Square Source 2.21 F Value Coeff Var Root MSE 0.479041 10.49861 Anova SS Mean Square 8.10699222 2.21 VONG UC CHE NAM HCP2 VONGUCCHE Mean 1.916636 13.21944 F Value Pr > F HCP2 0.1213 22:53 Thursday, July 29, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t 12 3.673494 2.17881 Least Significant Difference 3.409 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N HCP2 15.947 1(L5) 13.613 4(LN2-7) 13.590 3(LN2-5) 13.113 5(LN3-5) 11.667 2(L6) 11.387 6(LN3-7) A B A B A B A B A B A B B B B  Chạy tương tự với nhóm cơm mẻ cảu chủng Lactobacillus spp nhóm Bacillus spp với nấm khác ... Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: 35 2.6.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa lớp chủng vi khuẩn Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: ... tìm phương pháp thích hợp hiệu với phòng thí nghiệm trường Chính vậy, em xin thực đề tài Thử nghiệm phương pháp đánh giá khả đối kháng chủng vi khuẩn Bacillus spp Lactobacillus spp số nấm mốc Aspergillus. .. nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa lớp chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc 81 3.6 So sánh khả đối kháng nấm mốc 20 chủng vi khuẩn