ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bùi Cao Tiến NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI LẦN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bùi Cao Tiến NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI LẦN Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: PGS TS Lê Thị Hồng Hảo Hướng dẫn 2: TS Trần Cao Sơn Hà Nội – 2018 LỜI CẢM ƠN Đề tài thực hoàn thành Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Thị Hồng Hảo, TS Trần Cao Sơn giao đề tài, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy mơn Hóa phân tích, trường Đại học Khoa học tự nhiên nhiệt tình dạy dỗ, cung cấp cho em kiến thức cần thiết, quan trọng bổ ích Đồng thời, xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, đồng nghiệp Viện tạo điều kiện, giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình người thân bên quan tâm, động viên suốt thời gian qua Trong trình thực đề tài, trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên đề tài khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận góp ý q thầy bạn đồng nghiệp Xin chân thành cảm ơn ! Mục lục MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 Giới thiệu nitrosamin 1.1.1 Công thức cấu tạo nitrosamin 1.1.2 Sự tạo thành nitrosamin 1.1.3 Tính chất hóa lý nitrosamin .3 1.1.4 Độc tính 1.1.5 Nguồn nitrosamin từ thực phẩm .4 1.1.6 Quy định hành nitrosamin 1.2 Phương pháp xác định nitrosamin thực phẩm 1.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu .6 Error! Bookmark not defined 1.2.1.1 Chưng cất 1.2.1.2 Chiết lỏng - lỏng 1.2.1.3 Vi chiết pha rắn 1.2.1.4 Chiết pha rắn 1.2.1.5 Kỹ thuật QuEChERS 1.2.1.6 Các kỹ thuật chiết khác 1.2.2 Phương pháp phân tích .9 1.2.2.1 Sắc ký lỏng khối phổ 1.2.2.2 Sắc ký khí 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.2.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số nitrosamin sản phẩm thịt nướng 13 2.2.1.1 Khảo sát điều kiện xác định nitrosamin GC-MS/MS 13 2.2.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 13 2.2.2 Thẩm định phương pháp xác định đồng thời số nitrosamin sản phẩm thịt nướng 14 2.2.3 Sơ đánh giá hàm lượng nitrosamin số sản phẩm thịt nướng địa bàn Hà Nội 14 2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .14 2.3.1 Thiết bị 14 2.3.2 Dụng cụ 14 2.3.3 Hóa chất, chất chuẩn .15 2.3.4 Pha dung dịch chuẩn .15 2.3.4.1 Dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrosamin 10 µg/mL µg/mL 15 2.3.4.2 Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL 15 2.3.4.3 Dung dịch nội chuẩn 10 µg/mL µg/mL 16 2.3.4.4 Dung dịch chuẩn làm việc 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu .16 2.4.1 Quy trình xử lý mẫu .16 2.4.2 Phương pháp phân tích GC-MS/MS 17 2.4.3 Phương pháp thẩm định 17 2.4.3.1 Tính chọn lọc 17 2.4.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 18 2.4.3.3 Khoảng làm việc đường chuẩn 18 2.4.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 18 2.4.4 Phương pháp xử lý kết .19 2.4.5 Phương pháp lấy mẫu .19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .20 3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số nitrosamin thịt nướng 20 3.1.1 Khảo sát điều kiện GC-MS/MS 20 3.1.1.1 Điều kiện MS/MS 20 3.1.1.2 Điều kiện GC 21 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 23 3.1.2.1 Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu 23 3.1.2.2 Khảo sát muối chiết 25 3.1.2.3 Khảo sát phương pháp chiết 26 3.1.2.4 Khảo sát thời gian chiết 27 3.1.2.5 Khảo sát bột làm 29 3.1.2.6 Khảo sát lượng C18 sử dụng 30 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng 32 3.2 Thẩm định phương pháp 33 3.2.1 Độ đặc hiệu .33 3.2.1.1 Tính số điểm IP 33 3.2.1.2 Tỷ lệ ion 33 3.2.1.3 Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn 35 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) .35 3.2.3 Khoảng làm việc .36 3.2.4 Độ lặp lại độ thu hồi 38 3.2.5 Độ lặp lại khác ngày .40 3.3 Ứng dụng phương pháp để sơ xác định hàm lượng nitrosamin thịt nướng lấy địa bàn Hà Nội 41 3.3.1 Kết xác định hàm lượng nitrosamin mẫu thực tế 41 3.3.2 So sánh cách chế biến khác ảnh hưởng đến lượng nitrosamin tạo thành 42 KẾT LUẬN .43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Giải nghĩa ACN Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội cộng đồng phân tích thức) CE Collision energy (Năng lượng va chạm) CI Chemical ionization (Ion hóa hóa học) DCM Dichloromethan d-SPE Dispersive solid phase extraction (Chiết pha rắn phân tán) EI Electron impact (va chạm electron) ESI Electrospray inonization (ion hóa nguồn phun điện tử) GC-MS/MS LC-MS/MS Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký khí khối phổ hai lần) Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ hai lần) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Qualification (Giới hạn định lượng) ME Matrix effect (Ảnh hưởng nền) NDBA N-Nitroso di-n-butyl amine NDEA N-Nitroso diethyl amine NDMA N-Nitroso dimethyl amine NDPA N-Nitroso dipropyl amine NDPhA N-nitroso diphenyl amine NPYR N-Nitroso pyrollidine NPD Nitrogen-phosphorus detector (detector nitơ –photpho) IP Identification point (Điểm nhận dạng) PSA Primary secondary amine (amin bậc 2) QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe (Nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, ổn định, an toàn) SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn) SPME Solid phase microextraction (Vi chiết pha rắn) TEA Thermal energy analyser (Bộ phân tích lượng nhiệt) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số nitrosamin thường gặp Bảng 1.2 Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin Bảng 1.3 Quy định hàm lượng nitrosamin nước uống Bảng 1.4 So sánh số nghiên cứu chiết nitrosamin kỹ thuật QuEChERS Bảng 1.5 Tóm tắt số nghiên cứu xác định nitrosamin GC-MS/MS 11 Bảng 2.1 Các nitrosamin sử dụng nghiên cứu .13 Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn làm việc 16 Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích nitrosamin .20 Bảng 3.2 Chương trình nhiệt độ xác định nitrosamin 22 Bảng 3.3 Tỷ lệ ion sai số cho phép .34 Bảng 3.4 Khoảng làm việc độ chệch 38 Bảng 3.5 Độ lặp lại độ thu hồi NDMA 38 Bảng 3.6 Độ lặp lại độ thu hồi NDPA 39 Bảng 3.7 Độ lặp lại độ thu hồi NDPhA 40 Bảng 3.8 Độ lặp lại khác ngày nitrosamin nghiên cứu .41 Bảng 3.9 Kết phân tích mẫu thực tế 41 Bảng 3.10 So sánh cách chế biến khác .42 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung nitrosamin Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích nitrosamin với cột DB5-MS cột DB1701 21 Hình 3.2 Sắc ký đồ tổng ion (TIC) nitrosamin nghiên cứu 22 Hình 3.3 Sắc ký đồ nitrosamin dung môi ACN ACN:DCM (1:1/v:v) 23 Hình 3.4 Tóm tắt quy trình xử lý mẫu dự kiến 24 Hình 3.5 Sắc ký đồ ảnh hưởng muối chiết 26 Hình 3.6 Sắc ký đồ ảnh hưởng phương pháp chiết 27 Hình 3.7 Sắc ký đồ ảnh hưởng thời gian chiết 28 Hình 3.8 Sắc ký đồ ảnh hưởng bột làm .29 Hình 3.9 Sắc ký đồ ảnh hưởng lượng bột làm 30 Hình 3.10 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 31 Hình 3.11 Ảnh hưởng mẫu 33 Hình 3.12 Tỷ lệ ion nitrosamin (mẫu thêm chuẩn mẫu chuẩn) 34 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn 35 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn mức nồng độ LOQ = 0,5 ng/g 36 Hình 3.15 Đường chuẩn nitrosamin nghiên cứu 37 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN KẾT LUẬN Sau trình thực đề tài, số kết thu sau: Tối ưu hóa điều kiện phân tích xây dựng thành cơng quy trình phân tích đồng thời ba nitrosamin sản phẩm thịt sắc ký khí khối phổ hai lần Phương pháp thẩm định thông số đạt yêu cầu AOAC Phương pháp áp dụng để phân tích 30 mẫu thịt (nướng, quay, rán) Kết phân tích cho thấy 19/30 mẫu có kết dương tính với hàm lượng tương đối thấp (0,5 – 1,2 ng/g) So sánh cách chế biến thông thường: nướng than, nướng vi sóng, rán cho thấy nướng than có hàm lượng cao nhất, thấp rán thấp nướng vi sóng 43 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1]TCVN 10069:2013, “Đồ dùng trẻ em – phương pháp xác định giải phóng nitrosamin chất có khả chuyển hóa thành N-nitrosamin từ núm ty ty giả làm elastome cao su” [2]TCVN 11602:2016, “Thịt sản phẩm thịt – xác định hàm lượng N-nitrosamin – phương pháp sắc ký khí sử dụng thiết bị lượng nhiệt” Tiếng Anh [3]A R Tricker and R Preussmann (1991), “Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurrence, formation, mechanisms and carcinogenic potential”,Mutation Research/Genetic Toxicology, vol 259, no 3–4, pp 277–289 [4]A Sannino and L Bolzoni (2013), “GC/CI–MS/MS method for the identification and quantification of volatile N-nitrosamines in meat products”,Food chemistry, vol 141, no 4, pp 3925–3930 [5]AOAC International (1984), “AOAC 982.22 - N-Nitrosamines (Volatile in Fried Bacon) - Mineral Oil Vacuum Distillation - Thermal Energy Analyser (TEA) Method Final Action 1984”, AOAC Official Method [6]AOAC International (1988), “AOAC 982.11 - N-Nitrosodimethylamine in Beer Gas Chromatographic Method Final Action 1988”, AOAC Official Method [7]C Crews (2010), “The determination of N-nitrosamines in food”,Quality Assurance and Safety of Crops & Foods, vol 2, no 1, pp 2–12 [8]D Kocak, M Z Ozel, F Gogus, J F Hamilton, and A C Lewis (2012), “Determination of volatile nitrosamines in grilled lamb and vegetables using comprehensive gas chromatography–Nitrogen chemiluminescence detection”,Food chemistry, vol 135, no 4, pp 2215–2220 [9]D M Pérez, G G Alatorre, E B Álvarez, E E Silva, and J F J Alvarado (2008), “Solid-phase microextraction of N-nitrosodimethylamine in beer”,Food Chemistry, vol 107, no 3, pp 1348–1352 [10]EPA (2005), “EPA Method 521: Determination of nitrosamines in drinking water by solid phase extraction and capillary column gas chromatography with large 44 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN volume injection and chemical ionization tandem mass spectrometry (MS/MS)”, Environmental Protection Agency [11]J A McDonald, N B Harden, L D Nghiem, and S J Khan (2012), “Analysis of N-nitrosamines in water by isotope dilution gas chromatography–electron ionisation tandem mass spectrometry”,Talanta, vol 99, pp 146–154 [12]J EGrebel and I M Suffet (2007), “Nitrogen–phosphorus detection and nitrogen chemiluminescence detection of volatile nitrosamines in water matrices: optimization and performance comparison”,Journal of Chromatography A, vol 1175, no 1, pp 141–144 [13]J W Pensabene, W Fiddler, R J Maxwell, A R Lightfield, and J W Hampson (1995), “Supercritical fluid extraction of N-nitrosamines in hams processed in elastic rubber nettings”,Journal of AOAC International, vol 78, no 3, pp 744– 748 [14]J.-P Alseem (1979), “The organic chemistry of N-nitrosamines: A brief review”, ACS Publications [15]M Al-Kaseem, Z Al-Assaf, and F Karabet (2013), “Rapid and Simple Extraction Method for Volatile N-nitrosamines in meat products”,Pharmacology & Pharmacy, vol 4, no 08, p 611 [16]M Krauss and J Hollender (2008), “Analysis of nitrosamines in wastewater: exploring the trace level quantification capabilities of a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer”,Analytical Chemistry, vol 80, no 3, pp 834– 842 [17]M Z Ozel, F Gogus, S Yagci, J F Hamilton, and A C Lewis (2010), “Determination of volatile nitrosamines in various meat products using comprehensive gas chromatography–nitrogen chemiluminescence detection”,Food and Chemical Toxicology, vol 48, no 11, pp 3268–3273 [18]M.-C Huang, H.-C Chen, S.-C Fu, and W.-H Ding (2013), “Determination of volatile N-nitrosamines in meat products by microwave-assisted extraction coupled with dispersive micro solid-phase extraction and gas chromatography– 45 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN Chemical ionisation mass spectrometry”,Food chemistry, vol 138, no 1, pp 227–233 [19]N Campillo, P Viñas, N Martínez-Castillo, and M Hernández-Córdoba (2011), “Determination of volatile nitrosamines in meat products by microwave-assisted extraction and dispersive liquid–liquid microextraction coupled to gas chromatography–mass spectrometry”,Journal of Chromatography A, vol 1218, no 14, pp 1815–1821 [20]N P Sen and S Seaman (1981), “Volatile N-nitrosamines in dried foods”,Journal-Association of Official Analytical Chemists, vol 64, no 5, pp 1238–1242 [21]P Jakszyn and C A González (2006), “Nitrosamine and related food intake and gastric and oesophageal cancer risk: a systematic review of the epidemiological evidence”,World journal of gastroenterology: WJG, vol 12, no 27, p 4296 [22]R A Scanlan (1983), “Formation and occurrence of nitrosamines in food”,Cancer Research, vol 43, no Suppl, p 2435s–2440s [23]R Andrade, F G Reyes, and S Rath (2005), “A method for the determination of volatile N-nitrosamines in food by HS-SPME-GC-TEA”,Food Chemistry, vol 91, no 1, pp 173–179 [24]S Eerola, I Otegui, L Saari, and A Rizzo (1998), “Application of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry and tandem mass spectrometry to the determination of volatile nitrosamines in dry sausages”,Food Additives & Contaminants, vol 15, no 3, pp 270–279 [25]S J Lehotay, Y Sapozhnikova, L Han, and J J Johnston (2015), “Analysis of nitrosamines in cooked bacon by QuEChERS sample preparation and gas chromatography–tandem mass spectrometry with backflushing”,Journal of agricultural and food chemistry, vol 63, no 47, pp 10341–10351 [26]S Raoul, E Gremaud, H Biaudet, and R J Turesky (1997), “Rapid solid-phase extraction method for the detection of volatile nitrosamines in food”,Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 45, no 12, pp 4706–4713 46 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN [27]S S Herrmann, L Duedahl-Olesen, and K Granby (2014), “Simultaneous determination of volatile and non-volatile nitrosamines in processed meat products by liquid chromatography tandem mass spectrometry using atmospheric pressure chemical ionisation and electrospray ionisation”,Journal of Chromatography a, vol 1330, pp 20–29 [28]S W Krasner, W A Mitch, D L McCurry, D Hanigan, and P Westerhoff(2013), “Formation, precursors, control, and occurrence of nitrosamines in drinking water: a review”,Water research, vol 47, no 13, pp 4433–4450 [29]S Yurchenko and U Mölder(2006), “Volatile N-nitrosamines in various fish products”,Food chemistry, vol 96, no 2, pp 325–333 [30]S Yurchenko and U Mölder(2007), “The occurrence of volatile N-nitrosamines in Estonian meat products”,Food Chemistry, vol 100, no 4, pp 1713–1721 [31]W Fiddler and J W Pensabene(1996), “Supercritical fluid extraction of volatile N-nitrosamines in fried bacon and its drippings: method comparison”,Journal of AOAC International, vol 79, no 4, pp 895–901 [32]X Zeng, W Bai, Y Xian, H Dong, and D Luo(2016), “Application of QuEChERS-based purification coupled with isotope dilution gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of Nnitrosamines in soy sauce”,Analytical Methods, vol 8, no 26, pp 5248–5254 [33]Y Qiu, J.-H Chen, W Yu, P Wang, M Rong, and H Deng(2017), “Contamination of Chinese salted fish with volatile N-nitrosamines as determined by QuEChERS and gas chromatography–tandem mass spectrometry”,Food Chemistry, vol 232, pp 763–769 [34]Z Zhao, Y Xu, X Liu, X Shi, and Y Lu(2017), “Rapid determination of 10 volatile N-nitrosamines in sour meats by modified QuEChERS and gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry”,Se pu = Chinese journal of chromatography, vol 35, no 10, pp 1086–1093 47 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN PHỤ LỤC I VIỆN KIỂM NGHIỆM AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM QUỐC GIA QUY TRÌNH THAO TÁC CHUẨN XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI LẦN GS-MS/MS Mã số: H.HD.QT.476 Lần ban hành: 01 Ngày ban hành: Ngày hiệu lực: Người biên soạn Người thẩm xét Người phê duyệt Bùi Cao Tiến Trần Cao Sơn Lê Thị Hồng Hảo Nội dung sửa đổi Ngày sửa đổi Họ Tên Ký tên Ngày Theo dõi soát xét, sửa đổi Lần Mục Nguyên lý Nitrosamin mẫu chiết kỹ thuật QuEChERS sử dụng muối NH4Cl, làm loại béo n-hexan C18, sau phân tích GC-MS/MS Phạm vi áp dụng Phương pháp áp đụng để xác định hàm lượng nitrosamin mẫu thịt sản phẩm thịt Tài liệu viện dẫn -S J Lehotay, Y Sapozhnikova, L Han, and J J Johnston (2015), “Analysis of nitrosamines in cooked bacon by QuEChERS sample preparation and gas 48 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN chromatography–tandem mass spectrometry with backflushing”, Journal of agricultural and food chemistry, vol 63, no 47, pp 10341–10351 -Z Zhao, Y Xu, X Liu, X Shi, and Y Lu (2017), “Rapid determination of 10 volatile N-nitrosamines in sour meats by modified QuEChERS and gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry”, Se pu = Chinese journal of chromatography, vol 35, no 10, pp 1086–1093 Định nghĩa Không Thiết bị, dụng cụ 5.1 Thiết bị 5.1.1 Máy sắc ký khí khối phổ hai lần GC-MS/MS (kiểu ba tứ cực) 5.1.2 Cột sắc ký DB-1701 5.1.3 Bể rung siêu âm 5.1.4 Cân phân tích, có độ xác đến 0,1 mg 5.1.5 Máy đồng mẫu 5.1.6 Máy lắc vortex 5.1.7 Máy ly tâm đạt 6000 rpm 13000 rpm phút 5.1.8 Máy 5.2 Dụng cụ 5.2.1 Micropipet 10 – 100 μL, 100-1000 μL, 500 – 5000 μL đầu côn tương ứng 5.2.2 Ống ly tâm 50 mL 5.2.3 Vial 1,8 mL 5.2.4 Bình định mức loại Hóa chất, thuốc thử Tất hóa chất loại tinh khiết phân tích 6.1 Chuẩn mix nitrosamin (NDMA, NDPA, NDPhA) 2000 µg/mL methanol (Dr Ehrenstorfer).Nội chuẩn NDMA-d6 (Dr Ehrenstorfer) 6.2 Nội chuẩn NDMA-d6 (Dr Ehrenstorfer) 6.3 BSTFA (N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) (Sigma tương đương) 6.4 Acetonitril (Merck) 49 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN 6.5 Dichloromethan (Merck) 6.6 PSA (Agilent) 6.7 C18 (Agilent) 6.8 Hexan (Merck) 6.9 NH4Cl (Merck) 6.10 MgSO4 (Merck) Các bước tiến hành 7.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Dùng pipet (5.2.1) hút xác 100 µL dung dịch chuẩn gốc (6.1) vào bình định mức (5.2.4) 20 mL, định mức ACN (6.4), thu dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL Bảo quản nhiệt độ -18oC, sử dụng tháng Dùng pipet hút xác 100 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL vào vial (5.2.3), thêm 900 µL ACN, lắc đều, thu dung dịch chuẩn hỗn hợp µg/mL Pha sử dụng 7.2 Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn 7.2.1 Dung dịch nội chuẩn gốc Cân xác 10 mg nội chuẩn NDMA-d6 (6.2) cân phân tích (5.1.4) vào bình định mức 100 mL (5.2.4), định mức ACN (6.4) thu dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ 100 µg/mL Bảo quản -18oC, sử dụng năm Chú ý: Nồng độ dung dịch nội chuẩn tính tốn theo khối lượng cân thực tế 7.2.2 Dung dịch nội chuẩn trung gian Dùng pipet (5.2.1) hút xác mL dung dịch nội chuẩn gốc (7.2.1) vào bình định mức (5.2.4) 10 mL, định mức ACN (6.4), thu dung dịch nội chuẩn trung gian 10 µg/mL Bảo quản nhiệt độ -18oC, sử dụng tháng 7.3 Chuẩn bị mẫu 7.3.1 Chuẩn bị mẫu sơ Mẫu thịt đồng máy đồng mẫu, tối thiểu kg 7.3.2 Mẫu thử • Cân xác khoảng g mẫu vào ống ly tâm 50 mL • Thêm 50 µL dung dịch nội chuẩn 10 µg/mL để yên khoảng 15 phút 50 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN • Thêm vào mẫu 10 mL acetonitril : nước (1:1), lắc phút • Thêm 5,5 g NH4Cl, lắc phút, siêu âm 30 phút • Ly tâm 6000 vòng/phút phút • Hút mL pha hữu phía sang ống ly tâm 15 mL có chứa hỗn hợp muối gồm 300 mg MgSO4 + 100 mg C18 mL n-hexan bão hòa ACN • Lắc ly tâm 6000 vòng/phút phút Dùng pipet pasteur loại bỏ lớp nhexan • Hút 0,5 mL lớp ACN vào vial, thêm 0,5 mL DCM, lắc • Phân tích GC-MS/MS 7.3.3 Mẫu trắng Sử dụng mẫu thịt xác định không chứa nitrosamin Tiến hành tương tự với mẫu thử 7.3.4 Mẫu kiểm soát Sử dụng mẫu trắng, thêm 10 µL dung dịch chuẩn µg/mL để yên 15 phút Tiến hành tương tự với mẫu thử Nồng độ thêm chuẩn mẫu 20 ng/g 7.4 Điều kiện sắc ký 7.4.1 Điều kiện GC • Cột sắc ký DB-1701 • Khí mang: Helium, tốc độ mL/min • Injector: 250oC, splitless Thể tích bơm µL • Transferline: 260oC • Chương trình nhiệt độ Tốc độ o C/min (Ban đầu) Nhiệt độ Thời gian giữ Tổng thời gian C (min) (min) 50 1 o Tăng nhiệt 10 160 12 Tăng nhiệt 30 250 16 7.4.2 Điều kiện MS • Detector MS/MS 51 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN • Chế độ theo dõi MRM Chất phân Ion mẹ tích (m/z) Định lượng Xác nhận Ion CE Ion CE (m/z) (eV) (m/z) (eV) NDMA 74 44 42 NDMA-d6 80 50 48 NDPA 130 113 43 10 NDPhA 169 168 20 66 10 Tính tốn kết Từ kết thực nghiệm, hàm lượng nitrosamin tính theo cơng thức sau: X (µg/kg) = Cx.V /m Trong đó: Cx: Là nồng độ nitrosamin dịch chiết tính theo đường chuẩn (ng/mL) V : Thể tích dịch chiết cuối (10 mL) m: Khối lượng mẫu cân ban đầu (~ g) Kiểm soát chất lượng Độ thu hồi mẫu kiểm soát phải nằm khoảng từ 80-110% 10 Biểu mẫu kèm theo H.BM.QT.476: Xác định đồng thời số nitrosamin sản phẩm thịt sắc ký khí khối phổ hai lần GC-MS/MS 52 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN PHỤ LỤC II Bảng kết phân tích mẫu thực tế (NDMA) STT Thịt bò Thịt gia cầm Thịt lợn KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 0.69 KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 0.52 0.58 KPH 0.56 10 KPH KPH KPH 53 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN Bảng kết phân tích mẫu thực tế (NDPhA) STT Thịt bò Thịt gia cầm Thịt lợn KPH KPH 0.89 0.87 KPH 1.05 KPH 0.64 0.93 KPH KPH 0.56 KPH KPH 0.50 KPH 0.93 0.62 0.51 KPH 0.58 KPH 0.61 KPH 0.68 0.77 0.74 10 0.81 1.19 KPH 54 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN PHỤ LỤC III Sắc đồ mẫu lặp lại NDMA Sắc đồ mẫu lặp lại NDPA 55 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN Sắc đồ mẫu lặp lại NDPhA Sắc đồ mẫu nướng than, nướng vi sóng, rán (NDMA) 56 Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN Sắc đồ mẫu thực (dương tính với NDMA) Sắc đồ mẫu thực (dương tính với NDPhA) 57 ... - Bùi Cao Tiến NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI LẦN Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC... hơi, sắc ký khí kỹ thuật sử dụng phổ biến để xác định nitrosamin Ngoài ra, sắc ký lỏng kết nối với khối phổ hai lần sử dụng ưu điểm độ nhạy tính chọn lọc 1.2.2.1 Sắc ký lỏng khối phổ Sắc ký lỏng... phẩm Tuy nhiên, Việt Nam lĩnh vực quan tâm thời gian gần Đặc biệt chưa có phương pháp tiêu chuẩn áp dụng Do đó, đề tài Nghiên cứu xác định hàm lượng số nitrosamin sản phẩm thịt phương pháp sắc