BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM MỸ DUNG NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI, 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM MỸ DUNG NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: (1) PGS TS PHẠM CÔNG HOẠT (2) GS TS LÊ HUY HÀM HÀ NỘI, 2018 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Công Hoạt, Bộ Khoa học Công nghệ GS.TS Lê Huy Hàm, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, người thầy định hướng, truyền dạy kiến thức khoa học, động viên tạo điều kiện giúp đỡ vượt qua khó khăn trở ngại suốt trình thực luận án Tơi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp tơi hồn thành thủ tục cần thiết q trình làm luận án Đặc biệt, Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trường Đại học Vinh, Viện Nông Nghiệp Tài Nguyên tạo điều kiện giúp tơi hồn thành tốt nhiệm vụ cơng tác, học tập nghiên cứu bốn năm qua Tôi xin chân thành cảm ơn đến Khoa Công nghệ sinh học -Viện Đại học Mở Hà Nội, Trại thủy sản mặn lợ - Nghi Xuân Trường Đại học Vinh hỗ trợ, giúp đỡ, hướng dẫn suốt q trình thực luận án Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè người thân bên cạnh chia sẻ, tạo điều kiện cho học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà Nội, ngày…… tháng năm 2018 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Luận án cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác - Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Hà Nội, ngày… tháng năm 2018 Tác giả luận án Phạm Mỹ Dung iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GELATIN 1.1.1 Cấu trúc tính chất gelatin 1.1.2 Gelatin có nguồn gốc từ da cá 1.2 GELATINASE 11 1.2.1 Đặc điểm, chức gelatinase 11 1.2.2 Phân loại gelatinase 13 1.2.3 Cấu trúc chế hoạt động gelatinase 16 1.2.4 Tính chất chung gelatinase 19 1.2.5 Nguồn sản xuất gelatinase 25 1.3 NGHIÊN CỨU VỀ GELATINASE TÁI TỔ HỢP 27 1.3.1 Gen mã hóa gelatinase 27 1.3.2 Sản xuất gelatinase tái tổ hợp 32 1.4 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG GETATINASE TẠI VIỆT NAM 41 1.4.1 Nghiên cứu sản xuất gelatinase 41 1.4.2 Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá 42 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 50 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 50 2.2.1 Hóa chất 50 2.2.2 Thiết bị 51 2.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 52 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 2.4.1 Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase 52 2.4.2 Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp 55 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu rGEL 61 2.4.4 Phương pháp thu hồi, tinh đặc tính rGEL 63 iv 2.4.5 Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da tra 65 2.4.6 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 71 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 72 3.1 SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE 72 3.1.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao 72 3.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa định tên chủng vi khuẩn lựa chọn 74 3.2 TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP 79 3.2.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E faecalis MD4 79 3.2.2 Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase 79 3.2.3 Giải trình tự phân tích gen gelE 81 3.2.4 Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu gen gelE E coli BL21(DE3) 84 3.2.5 Tạo chủng E coli tái tổ hợp mang gen gelE 86 3.3 ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL 87 3.3.1 Ảnh hưởng pH đến biểu rGEL 88 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến biểu rGEL 89 3.3.3 Ảnh hưởng IPTG đến biểu rGEL 93 3.3.4 Động thái trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp 95 3.4 THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL 96 3.4.1 Thu hồi tinh rGEL 96 3.4.2 Đặc tính gelatinase tái tổ hợp 99 3.5 ỨNG DỤNG rGEL THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA 106 3.5.1 Kết xác định điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra rGEL 106 3.5.2 Đánh giá hiệu bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen 111 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 PHỤ LỤC 145 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ ADG : Average daily growth ADN : Acid deoxyribonucleic AMP : Ampicillin ARN : Acid ribonucleic BLAST : Basis Local Aligment Search Tool bp : base pair BSA : Bovine Serum Albumin Dal : Dalton E : Enzym EC : Classification enzyme EDTA : Ethyllene diamine tetraacetic acid EtBr : Ethidium Bromide FCR : Feed change rate IPTG : Isopropyl β-D- thiogalactoside kDa : Kilo Dalton Kb : Kilo base LB : Lubria – Bertani MMP : Matrix metalloprotease MMP : Matrix metalloprotease MMPs : Matrix metalloproteases NST : Nhiễm sắc thể OD : Optical density (mật độ quang) PBS : Phosphate buffer PCR : Polymerase Chain Reactions rGelE : recombinant gelatinase enzyme (enzyme gelatinase tái tổ hợp) vi RE : Restriction enzyme (enzyme giới hạn) S : Cơ chất SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyarcrylamide gel electrophoresis SGR : Special growth rate sprE : serine proteinase TAE : Tris - acetate - EDTA TSVKHK : tổng số vi khuẩn hiếu khí TTHĐ : Trung tâm hoạt động UV : Ultra violet VT TTH : vector tái tổ hợp VSV : vi sinh vật vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần axit amin gelatin từ da cá da trơn (Clarias gariepinus) Bảng 1.2 Các thành phần axít amin chủ yếu gelatin da số loại cá bì lợn (thành phần 1000g) 10 Bảng 1.3 Một số loại enzym thuộc nhóm MMPs 14 Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng thức ăn 68 Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng cơng thức thức ăn thí nghiệm 69 Bảng 2.3 Thành phần axit amin loại thức ăn thí nghiệm 69 Bảng 3.1 Hoạt tính phân giải gelatin dịch lên men 11 chủng vi khuẩn phân lập phân lập từ mẫu cá nước bị bệnh sau 48 nuôi cấy 72 Bảng 3.2 Khả đồng hoá nguồn carbon nitơ đặc điểm sinh trưởng chủng MD4 sau ngày nuôi cấy 37°C 75 Bảng 3.3 Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA vi khuẩn MD4 với trình tự gen tương ứng chủng đăng ký Genbank (NCBI) 77 Bảng 3.4 Mức độ tương đồng trình tự nucleotit gen gelE chủng E faecalis MD4 với gen gelE tương ứng vi khuẩn đăng kí GenBank 81 Bảng 3.5 Mức độ tương đồng trình tự axít amin suy diễn gen gelE chủng E faecalis MD4 với gen gelE tương ứng vi khuẩn đăng kí GenBank 84 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến sinh trưởng biểu GEL 93 Bảng 3.7 Hiệu suất tinh GEL tái tổ hợp 97 Bảng 3.8 Ảnh hưởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính GEL tái tổ hợp 103 Bảng 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ nước khảo sát đến hiệu suất thủy phân 106 Bảng 3.10 Thành phần axít amin sản phẩm thủy phân từ gelatin da cá Tra 110 viii Bảng 3.11 Diễn biến yếu tố môi trường nước trình ương cá Mú chấm đen 111 Bảng 3.12 Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày cá Mú chấm đen theo khối lượng mức bổ sung chế phẩm axit amin khác 113 Bảng 3.13 Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày cá Mú chấm đen theo chiều dài mức bổ sung chế phẩm axit amin khác 114 Bảng 3.14 Hệ số chuyển đổi thức ăn cá Mú mức bổ sung chế phẩm axit amin khác 116 Bảng 3.15 Hệ số biến động cá Mú chấm đen giai đoạn giống 117 ... cứu tạo gelatinase tái tổ hợp ứng dụng thủy phân gelatin da cá Tra Mục tiêu luận án Tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis ứng dụng. .. tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase hiệu ứng dụng gelatinase thủy phân da cá Tra tạo nguồn axít amin bổ sung vào thức ăn nuôi cá Mú giống Ý nghĩa thực tiễn Đưa khảo sát ứng dụng gelatinase tái tổ. .. gelatinase tái tổ hợp 32 1.4 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG GETATINASE TẠI VIỆT NAM 41 1.4.1 Nghiên cứu sản xuất gelatinase 41 1.4.2 Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy