BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỰC NGHIỆM CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP DOUBLE STRANDED RNA VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI GIỚI TÍNH TƠM CÀNG XANH Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán hướng dẫn : Th.S BÙI THỊ LIÊN HÀ Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM HỒNG MSSV: 0851110091 Lớp: 08DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) loài giáp xác thương mại quan trọng, đánh bắt nuôi trồng rộng rãi phân bố tự nhiên ruộng lúa (New, 2005) Năm 1987, sản lượng M rosenbergii tồn cầu ước tính đạt khoảng 27000 năm (New, 1990) Một số lượng lớn sản xuất Trung Quốc mở rộng nhanh chóng Ấn Độ Bangladesh (New, 2005) Ngày nay, nuôi rộng rãi nước giới Trong thập kỷ qua, sản lượng trung bình năm M rosenbergii tăng 9-35,5% giá trị Năm 1993, tổng sản lượng 17,164 tấn, trị giá 116,799,000 USD năm 2005 đạt 205,033 với trị giá 896,263,000 USD Việc ni trồng tơm xanh đóng góp lớn vào ngành ni trồng thủy sản tồn cầu, số lượng giá trị M rosenbergii nuôi nhiều Châu Á số khu vực khác Châu Phi, Israel, Trung Nam Mỹ (Nhan, 2009) Tại Việt Nam, tôm xanh đối tượng nuôi địa nơng dân ưa thích, nhiều địa phương xác định đối tượng ni có giá trị kinh tế cao, đặc biệt khu vực nuôi tôm thương mại lưu vực sơng Mê Kơng Do nhu cầu giống cho việc nuôi đại trà lớn Tuy nhiên, trình tăng trưởng, đực thường lớn nhanh Khi chiều dài thể đạt trung bình 8-14 cm trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển đực tương đương Nhưng chiều dài thể vượt 14 cm, đực thường lớn nhanh (Lê Quang Khôi, 2009) Do giai đoạn ngưng phát triển tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản (Ra`anan Cohen, 1984) Tơm đực lớn đạt 110 g, tôm lớn đạt 50 g sau tháng nuôi (Lê Quang Khôi, 2009) Đây vấn đề gây trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm xanh thương phẩm có kích thước lớn giá thành cao sản lượng thu hoạch tăng cao Nghiên cứu Sagi Ra`anan năm 1988 chứng minh việc nuôi tơm xanh tồn đực đạt sản lượng cao việc ni tồn hay đực quần thể Khối lượng trung bình quần thể 473 Đồ án tốt nghiệp g/m2, 248 g/m2 260 g/m2 Những nhà khoa học Ả Rập Xê Út báo cáo kết tương tự tiến hành thí nghiệm ni tơm tồn đực, toàn hỗn hợp đực (Siddiqui, 1997) Điều thể việc nuôi tôm xanh toàn đực làm tăng sản lượng cách đáng kể mang lại lợi nhuận cao việc ni tồn hay hỗn hợp đực Do đó, phát triển kỹ thuật cho việc sản xuất quần thể toàn đực nhu cầu cần thiết cho việc nuôi tôm xanh Các nghiên cứu gần chứng minh chức làm bất hoạt gene iRNA tế bào tôm (Estrada ctv, 2007) Và cơng cụ có tiềm đáp ứng cho việc sản xuất tôm xanh toàn đực Kỹ thuật bất hoạt RNA (Guo Kempheus, 1995) sử dụng công cụ hiệu để làm bất hoạt sản phẩm gene cách tiêm RNA mạch đôi vào thể nhiều loài giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008) Ý tưởng tạo giả cách làm bất hoạt RNA thơng tin mã hóa gene tuyến đực insuline-like tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii insuline-like androgenic gland, Mr-IAG) RNA mạch đôi (dsRNA) thực thành cơng quy mơ phòng thí nghiệm (Ventura ctv, 2009) Kể từ đó, kỹ thuật bất hoạt RNA hứa hẹn hướng tiếp cận để tạo quần thể tơm tồn đực cho việc ni tôm xanh thương mại Xuất phát từ nhu cầu giống tôm xanh đực từ thị trường đề tài “Thực nghiệm cơng nghệ tổng hợp double stranded RNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)” cần thiết nhiều mong đợi Mục tiêu đề tài ứng dụng dsRNA để tạo tôm xanh giả, từ giả sản xuất tơm xanh tồn đực để đáp ứng nhu cầu cho việc nuôi tôm xanh thương phẩm Những nội dung cần thực là: + Tổng hợp Mr-IAG RNA mạch đôi cho kỹ thuật bất hoạt RNA + Kiểm tra hiệu Mr-IAG RNA mạch đôi việc chuyển đổi giới tính tơm xanh với nồng độ tần suất tiêm khác Đồ án tốt nghiệp + Kiểm tra ảnh hưởng thời gian tiêm Mr-IAG RNA mạch đôi lên tạo thành tôm xanh giả Phương pháp nghiên cứu đề tài thu thập thông tin từ báo khoa học công bố, nghiên cứu nước, thu thập số liệu thực nghiệm xử lý phần mềm excel Các kết đạt đề tài: + Tổng hợp thành công dsRNA kit Promega + Khảo sát nồng độ tiêm dsRNA 1,25 µg/g, tần suất tiêm lần/tuần làm bất hoạt gene mã hóa cho hormone tuyến đực tơm PL25 để tạo tôm xanh giả + Thời gian tiêm dsRNA phải kéo dài đến giả thành thục sinh sản Kết cấu đồ án tốt nghiệp gồm chương: + Chương Tổng quan: giới thiệu sơ lược tôm xanh Macrobrachium rosenbergii, tổng quan tuyến đực, chế làm bất hoạt gene iRNA + Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu: vật liệu sinh học tôm PL25, phương pháp tổng hợp dsRNA theo kit Promega, thí nghiệm tiêm thực với nồng độ tiêm µg/g; 2,5 µg/g 1,25 µg/g tần suất tiêm lần/ tuần, lần/tuần lần/tuần Thí nghiệm thời gian tiêm thực vào tháng với nồng độ tiêm 1,25 µg/g tần suất tiêm lần/tuần + Chương Kết thảo luận: nêu lên kết đạt tổng hợp dsRNA, nồng độ tần suất tiêm dsRNA tốt nhất, tạo giả đến tháng thứ thí nghiệm + Chương Kết luận đề nghị: số kết mà đề tài đạt đưa số kiến nghị để làm hướng nghiên cứu tương lai Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Phân loại (New, 2002) Tôm xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1897), loài biết đến giống Macrobrachium công nhận lần vào năm 1705 Q trình đặt tên cho tơm xanh giống lồi gặp nhiều khó khăn lịch sử Trong khứ tên giống bao gồm Cancer (Astacus) Palaemon Trước kia, tên M rosenbergii bao gồm Palaemon carcinus, P dacqueti, P rosenbergii đến năm 1959 tên khoa học Macrobracchium rosenbergii xuất chấp nhận phổ biến hầu Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustacea Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda Bộ phụ: Pleocyemata Phân bộ: Caridea Họ: Palaemonidae Họ phụ: Palaemoninae Giống: Macrobrachium Loài: M rosenbergii (De Man, 1879) Tên tiếng anh: Giant freshwater prawn 1.2 Đặc điểm sinh học tôm xanh 1.2.1 Phân bố Tôm xanh M rosenbergii phân bố tự nhiên Đơng Nam Á, nước Nam Thái Bình Dương, phía Bắc châu Đại Dương phía Tây đảo Thái Bình Dương (New Singholka, 1982; New, 2002) Tôm xanh phân bố tất thủy vực nước thủy vực nước lợ nhiều vùng giới (Nguyễn Việt Thắng, 2003) Môi trường sống Đồ án tốt nghiệp tôm xanh đa dạng thủy vực nước nước đục Ở Việt Nam, tôm xanh phân bố chủ yếu tỉnh Nam Bộ đặc biệt vùng đồng sông Cửu Long (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002) 1.2.2 Vòng đời tập tính sống Vòng đời tôm xanh chia làm giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu ấu trùng tôm trưởng thành Khi tôm trưởng thành, chúng thường sống môi trường nước như: sơng, rạch, ao, hồ.…Cũng nơi xảy trình thành thục, phát dục giao vĩ đẻ trứng Nhưng ơm trứng chúng có xu bơi vùng nước lợ từ 6-18 0/00, ấu trùng nở sống trơi theo kiểu phù du Sau 11 lần lột xác với 12 giai đoạn biến thái ấu trùng (Nauplii) biến thành hậu ấu trùng (Postlarvae-PL) lúc tôm di cư vùng nước ngọt, sống lớn lên (Ling Omerica, 1962; Nguyễn Thanh Phương, 2003) Ấu trùng có tính hướng quang mạnh, vận động trơi nước Sang thời kỳ hậu ấu trùng giai đoạn trưởng thành, tơm có tập tính sống đáy, bám vào cỏ; giá thể…Tơm trưởng thành hoạt động thường ẩn náo vào ban ngày tích cực hoạt động vào ban đêm Tơm xanh có tập tính ăn thịt lẫn nhau, việc dùng giá thể tăng chổ ẩn nắp, hạn chế tượng ăn thịt lẫn để nâng cao tỷ lệ sống tơm (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008) 1.2.3 Hình thái tăng trưởng Dựa vào hình dạng màu sắc để phân biệt tơm nhóm tơm khác Tơm xanh có thể thon dài, đối xứng bên Con trưởng thành thường có màu xanh dễ nhận, đơi có màu nâu nhạt (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008) Tơm xanh nước ta có trọng lượng cá thể lớn, đực đạt tới 450 g/cá thể, thân tương đối tròn, cá thể trưởng thành có màu xanh dương đậm Chủy phát triển nhọn cong lên ½ bề dài tận chủy, phía mắt chủy có 1115 3-4 sau hốc mắt Mặt thường có 12-15 Chiều dài chủy trưởng thành thường ngắn vỏ đầu ngực, chủy đực dài chiều dài đầu ngực (Lê Quang Khơi, 2009) Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Tơm xanh M rosenbergii Chân thứ phát triển chân khác, đực trưởng thành, đơi chân bò thứ có hình dạng kích thước giống phía (trái phải); (Lê Quang Khơi, 2009) Đặc điểm kích cỡ, hình dạng, màu sắc gai đôi thay đổi theo giai đoạn thành thục tôm, tơm đực Khi tơm nhỏ, đơi có màu trong, sau chuyển thành vàng cam (còn gọi lửa), chưa có gai hay có gai mịn càng, chưa có hay lơng tơ Khi tơm lớn, đơi có màu xanh đậm, xuất nhiều gai nhọn lơng tơ Q trình thay đổi thể qua giai đoạn như: tôm nhỏ, tôm lửa nhạt, tôm lửa đậm, tôm lửa đậm chuyển tiếp xanh, tôm xanh nhạt, tôm xanh đậm tôm già (Nguyễn Thanh Phương Trần Ngọc Hải, 2009) Trong trình tăng trưởng, đực thường lớn nhanh Khi chiều dài thể đạt trung bình 8-14 cm trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển Đồ án tốt nghiệp đực tương đương Nhưng chiều dài thể vượt 14 cm, đực thường lớn nhanh (Lê Quang Khôi, 2009) 1.3 Đặc điểm sinh sản tôm xanh 1.3.1 Phân biệt tôm đực tôm Tôm xanh trưởng thành dễ dàng phân biệt đực qua đôi chân bò thứ (càng) mà qua quan sinh dục lỗ sinh dục đực nằm gốc chân bò thứ 5, lỗ sinh dục nằm gốc chân bò thứ (Nguyễn Việt Thắng, 1993) Tơm đực có kích cỡ lớn tơm tuổi Đầu ngực tôm đực to khoang bụng hẹp tôm Đôi thứ to, dài thô Cơ quan sinh dục đực gồm đôi tinh sào, đôi ống dẫn tinh đầu mút Đôi tinh sào ngoằn ngèo nằm mặt lưng giáp đầu ngực nối với ống dẫn tinh chạy từ trước tim dọc sang bên viềng sau giáp đầu ngực đổ vào đầu mút nằm đốt gốc chân ngực thứ năm Túi tinh hình thành q trình phóng tinh Túi tinh chứa khối tinh trùng không di động Ở cái, buồng trứng nằm mặt lưng phần đầu ngực, dày gan tụy Khi buồng trứng thành thục có màu vàng nhìn thấy qua giáp đầu ngực, trải dài từ sau mắt đến đốt đầu phần bụng Ống dẫn trứng nối từ buồng trứng trước tim chạy dọc bên phía bụng đổ túi chứa tinh đốt gốc chân ngực thứ ba (Nguyễn Thanh Phương Trần Ngọc Hải, 2009) Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1 Tóm tắt đặc điểm tôm đực tôm Đặc điểm Tôm đực Tơm Kích cỡ Lớn đầu ngực to Nhỏ đầu ngực nhỏ tôm tôm đực Đôi thứ to, ghồ Nhỏ nhẵn ghề, nhiều gai tôm đực Hiện diện gốc Hiện diện gốc chân ngực thứ năm có chân ngực thứ ba, có nắp đậy màng mỏng bao phủ Mặt bụng có đốt thứ Tơm thành thục có có điểm cứng bụng thứ nhất, thứ 2, Càng Lỗ sinh dục Bụng thứ ba dài nở rộng, hình thành buồng ấp trứng Lơng tơ sinh dục Khơng có Xuất nhiều chân ngực chân bụng tôm trưởng thành Tuyến androgenic Dãy tế bào dính vào vùng Khơng có cuối ống dẫn tinh Chiều dài kích cỡ thành Chiều dài 17,5 cm, trọng Chiều dài 15 cm, trọng thục lượng trung bình 35 g lượng trung bình 25 g Phụ giao vĩ Xuất nhánh Khơng có nhánh phụ chân bụng thứ (Nguyễn Thanh Phương Trần Ngọc Hải, 2009) 1.3.2 Thành thục, giao vĩ, đẻ trứng ấp trứng tôm xanh Trong tự nhiên điều kiện nhân tạo, tôm thành thục giao vĩ xảy quanh năm Mùa đẻ rộ tôm xanh đồng Nam Bộ tập trung từ tháng 4-6 từ tháng 8-10 (Nguyễn Việt Thắng, 1993; Nguyễn Thị Thanh Đồ án tốt nghiệp Thủy, 2005) Tôm thành thục lần khoảng 3-3,5 tháng kể từ hậu ấu trùng 10-15 ngày (PL10-15) Kích cở tơm nhỏ đạt thành thục từ 10-13 cm 7,5 g (Nguyễn Việt Thắng, 1993) Quá trình lột xác tiền giao vĩ tôm tiết chất dẫn dụ có tác dụng kích thích tơm đực tìm đến Sau tôm lột xác 1-22 giờ, thường 3-6 giờ, tôm bắt đầu giao vĩ Tồn q trình tiếp xúc giao vĩ xảy vòng 20-35 phút Sau giao vĩ 2-5 giờ, có 6-24 giờ, tơm bắt đầu đẻ trứng (Nguyễn Thanh Phương, 2003) Tôm thường đẻ trứng vào ban đêm Tôm thường di chuyển từ tầng đáy lên tầng hay tầng mặt để đẻ Trong trình đẻ trứng, trứng thụ tinh ngang túi chứa tinh Trứng dính chùm vào lơng tơ đôi chân bụng thứ tư, thứ ba, thứ hai, thứ Thời gian đẻ trứng khoảng 10-60 phút thông thường từ 15-25 phút Những tơm thành thục chín muồi không giao vĩ đẻ trứng vòng 24 sau lột xác Những trứng không thụ tinh nên rụng sau 1-2 ngày (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002) Trong trình ấp trứng, tôm thường dùng chân bụng quạt nước, tạo dòng nước, cung cấp dưỡng khí cho trứng Thời gian ấp trứng đến trứng nở từ 15-23 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ nước (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008) 1.4 Tổng quan tuyến đực Hệ thống nội tiết nhóm giáp xác gồm phần tuyến sinus quan X nằm cuống mắt Cơ quan X sản xuất gonal-inhibiting hormone (GIH) molt-inhibiting hormone giữ tuyến sinus trước lưu thông thể Ở giáp xác quan Y nằm trung tâm phần đầu ngực sản xuất gonal-stimulating hormone (GSH) ecdysone GIH GSH tác động trực tiếp vào buồng trứng gián tiếp vào tinh hồn thơng qua tiết hormone từ tuyến androgenic (AGH) Giáp xác có quan thuộc hàm dưới, quan neurohemal, vị trí tổng hợp tiết methyl farnosoate, loại hormone có vai trò quan trọng trưởng thành sinh dục đực cái, phát triển hệ thống sinh sản rõ Đồ án tốt nghiệp Mũi tên trắng gai sinh dục phụ đực, mũi tên đen khơng có gai sinh dục phụ đực, mũi tên màu đỏ nhú lồi gai sinh dục phụ đực Kiểm tra tơm thấy hầu hết tơm thí nghiệm chuyển có chiếm 7,7 % nồng độ 2,5 µg/g đực Ngun nhân lúc chọn tơm PL25 cho thí nghiệm có lẫn vào tơm q ngày tuổi, lúc tơm biệt hóa giới tính nên Mr-IAG dsRNA khơng tác dụng ức chế Mr-IAG chúng Ở lơ đối chứng 100 % tơm đực Theo thí nghiệm Ventura ctv (năm 2009), nồng độ µg Mr-IAG dsRNA/g trọng lượng tơm có tác dụng ức chế hình thành gai sinh dục phụ đực Nhưng theo kết thí nghiệm cho thấy nồng độ Mr-IAG dsRNA 1,25 µg/g khối lượng thể làm bất hoạt gene Mr-IAG ngăn chặn việc mọc lại gai sinh dục phụ đực Từ kết cho thấy nồng độ 1,25 µg MrIAG dsRNA/g đủ để kích hoạt q trình iRNA xảy thể tơm PL Và nồng độ sử dụng để thực thí nghiệm Do nồng độ thấp làm giảm chi phí tổng hợp dsRNA thí nghiệm sử dụng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng tần suất tiêm lên tạo thành tôm giả Bảng 3.2 Số lượng tôm sống chuyển sau tháng thí nghiệm tiêm dsRNA với tần suất tiêm lần/tuần, lần/tuần, lần/tuần Lơ thí nghiệm Đối chứng Số lượng (con) 20 20 20 60 Tần suất 3 lần; lần; lần tiêm(lần/tuần) Số lượng tôm 17 19 16 57 17 19 16 sống (con) Số lượng tôm chuyển (con) 38 Đồ án tốt nghiệp Tỷ lê sống chuyển (%) 120 100 80 Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chuyển (%) 60 40 20 lần/tuần lần/tuần lần/tuần Đối chứng Hình 3.6 Tỷ lệ sống chuyển tôm sau tháng tiêm dsRNA với tần suất tiêm lần/tuần, lần/tuần, lần/tuần Sau 30 ngày thí nghiệm, tỷ lệ tơm sống cao, cao thí nghiệm Ở tần suất tiêm lần/tuần 85 %, lần/tuần 95 %, lần/tuần 80 %, đối chứng 95 %, tỷ lệ sống tôm tương đối ổn định cao thí nghiệm có kinh nghiệm q trình ni, theo dõi tơm hàng ngày có lột xác vớt ni riêng nên hạn chế số tôm chết lột xác Thêm vật ẩn nấp vào thùng để tôm ẩn náo không ăn thịt lẫn nhau, kiểm tra lượng thức ăn để không cho ăn thiếu thừa nhằm không làm ô nhiễm nước thiếu thức ăn Ánh sáng ý thấy q sáng đóng bớt cửa sổ lại thấy thiếu ánh sáng bật đèn Nhờ có kinh nghiệm lần thí nghiệm nên tơm đợt thí nghiệm số lượng sống tương đối cao 39 Đồ án tốt nghiệp Thực tiêm tơm với kết có thí nghiệm tiêm với nồng độ 1,25 µg/g với tần suất tiêm tiêm lần/tuần, lần/tuần, lần/tuần Sau thời gian thí nghiệm tiến hành cắt chân bơi thứ kiểm tra gai sinh dục phụ đực Kết kiểm tra cho thấy 100 % tơm thí nghiệm chuyển cái, lơ đối chứng tồn đực Điều chứng tỏ tần suất tiêm lần/tuần lần/tuần lượng Mr-IAG dsRNA đưa vào thể tôm đủ để bất hoạt Mr-IAG mà thẩm chí dư, tần suất tiêm lần/tuần đủ làm tôm chuyển với tỷ lệ 100 % Qua thí nghiệm nồng độ tần suất tiêm cho thấy nồng độ 1,25 µg/g tần suất tiêm lần/tuần đủ làm tơm PL25 chuyển Kết thí nghiệm sử dụng để làm thí nghiệm nhằm xác định thời gian tiêm 3.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian tiêm lên tạo thành tôm giả Bảng 3.3 Số lượng tôm sống chuyển sau tháng thí nghiệm Lơ Thả Đối chứng 20 20 20 20 20 Sống Cái Sống Cái Sống Cái Sống Cái Sống Cái Tháng 18 18 17 16 18 18 19 17 19 Tháng 15 15 15 17 16 16 16 19 15 16 10 14 19 14 13 19 Tháng Tháng Số lượng sống tôm tháng thí nghiệm lơ thí nghiệm lơ đối chứng tương đối đều, tỷ lệ sống có thấp thí nghiệm chênh lệch khơng cao Ngun nhân thời gian thí nghiệm kéo dài lúc tơm lớn ni thùng có diện tích nhỏ nên chúng ăn thịt lẫn dẫn đến lượng tôm sống không cao mong muốn 40 Đồ án tốt nghiệp Tỷ lệ chuyển (%) 120 100 Tháng 80 Tháng Tháng 60 Tháng 40 20 Đối chứng Hình 3.7 Tỷ lệ chuyển sau tháng tiêm Mr-IAG dsRNA Tiến hành tiêm cho tơm với nồng độ 1,25 µg/g, tần suất tiêm lần/tuần Thực thí nghiệm tiêm mơ tả phần 3.3.4.3 Khi kết thúc thí nghiệm thu tỷ lệ chuyển lô thí nghiệm sau: - Lơ thí nghiệm thứ tháng tiêm chuyển 100 % sau ngừng tiêm tháng đến hết tháng thứ kiểm tra chuyển tháng bị lại đực - Ở lô thứ 2, tiêm liên tiếp tháng tháng có 94,1 % tơm chuyển so với số tơm sống, ngun nhân tơm PL25 cung cấp cho thí nghiệm q tuổi sai sót q trình tiêm Đến tháng thứ có 100 % chuyển so với số sống chứng tỏ hiệu tiêm đạt tốt Nhưng sau ngưng khơng tiêm sau tháng tức hết tháng thứ thí nghiệm 100 % trở đực, chứng tỏ tơm giả tạo thành sau tháng tiêm dsRNA chưa thể ngừng tiêm 41 Đồ án tốt nghiệp - Lô thứ 3, tiêm liên tục tháng, tháng thứ cắt chân bơi thứ kiểm tra có 100 % chuyển cái, sang tháng thứ có 94,1 % số chuyển so với số sống, đến tháng thứ có 62,5 % chuyển so với số tôm sống Sau ngưng không tiêm tháng 100 % lại trở đực - Lơ thứ 4, tiêm liên tục tháng, kiểm tra tháng có 89,4 % giả, đến tháng thứ có 100 % chuyển cái, tháng thứ 50 %, tháng thứ có 38,4 % số chuyển cái, phần trăm tôm chuyển so với số tơm sống Đến thời gian khơng cho phép nên thí nghiệm kết thúc - Ở lô đối chứng kiểm tra tháng lơ thí nghiệm, kết kiểm tra tháng 100 % đực Nguyên nhân tỷ lệ tôm chuyển tháng thứ thứ thí nghiệm thấp so với tháng thứ thứ lúc tôm lớn, lượng mRNA thơng tin mã hóa cho tuyến đực lúc tạo nhiều Vì vậy, tiêm dsRNA với hàm lượng lúc tơm nhỏ không đủ làm bất hoạt hormone tuyến đực, nên tôm giả bị trở đực Do đó, tơm lớn lượng dsRNA tiêm vào tơm phải cao Qua kết thí nghiệm cho thấy tơm tiêm với dsRNA sau tháng liên tiếp ngừng tiêm ngừng tiêm tơm trở đực Từ số liệu thu thập kết luận thời gian tiêm dsRNA cho tôm tôm giả đến tôm thành thục sinh sản lượng dsRNA tiêm vào cho tôm phải tăng lên với phát triển tôm 42 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Quy trình tổng hợp dsRNA thực thành công với kit Promega, tạo dsRNA có nồng độ mong muốn (2,5 mg/ml) Kết thực nghiệm cho thấy hiệu việc tiêm dsRNA vào tôm PL25 để tạo tôm giả khả quan, cần nồng độ tiêm 1,25 µg/g tần suất tiêm lần/tuần làm bất hoạt mRNA tổng hợp nên tuyến đực Thời gian tiêm dsRNA để trì tạo tôm giả tôm đến chúng sinh sản thực kết cho thấy thời gian tiêm phải kéo dài đến tơm thành thục mang trứng Tuy thí nghiệm khơng lặp lại có ý nghĩa khoa học lớn khẳng định khả chuyển đổi giới tính tơm xanh M rosenbergii dsRNA Từ kết đạt mở hướng cho cơng nghệ chuyển giới tính tơm xanh dsRNA xem công cụ hiệu kinh tế Vì tạo tơm giả sản suất hàng loạt tôm đực giống phục vụ cho sản xuất đem lại giá trị kinh tế lớn Tuy nhiên, muốn có kết cao áp dụng vào sản xuất thực tế cần phải đầu tư nghiên cứu phát triển phương pháp để tổng hợp dsRNA với hiệu cao Nghiên cứu tổng hợp dsRNA thể vi khuẩn, nghĩa vi khuẩn tự tổng hợp dsRNA dùng kit để tổng hợp Thử nghiệm tiêm tôm với nồng độ dsRNA thấp hơn, thành công có hiệu cao Tìm kiếm đường khác để đưa dsRNA vào tơm ví dụ trộn vào thức ăn Thử nghiệm việc tiêm dsRNA có ảnh hưởng đến sức lớn khả mang trứng giả không 43 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: [1] Tiến sĩ Trần Ngọc Hải, Tiến sĩ Nguyễn Thanh Phương (2009) Giáo trình kỹ thuật sản xuất giống ni giáp xác, Trường Đại học Cần Thơ, Cần Thơ [2] Nguễn Thị Hồng Hạnh (2008) Đặc điểm sinh học, ảnh hưởng nguồn tôm mẹ lên sức sinh sản chất lượng ấu trùng tôm xanh Macrobrachium rosenbergii, Luận văn Thạc sĩ Động vật học, Trường Đại Học Sư Phạm Huế (Đại Học Huế), Huế [3] Nguyễn Văn Hảo (2003) Sổ tay thực hành nuôi tôm xanh luân canh với trồng lúa, NXB Nơng Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh [4] Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Tuần, Hoàng Thị Thủy Tiên, Lâm Quyền, Nguyễn Đức Minh, Nguyễn Nhứt Huỳnh Thị Hồng Châu (2004) Kết bước đầu sản xuất giống tơm xanh tồn đực,Tuyển tập nghề cá Đồng Bằng Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, trang 159 177 [5] Tiến sĩ Lê Quang Khôi (2009) Kỹ thuật sản xuất giống nuôi tôm xanh thương phẩm, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội [6] Nguyễn Thanh Phương, Trần Ngọc Hải, Trần Thị Thanh Hiền Marcy N Wilder (2003), Nguyên lý kỹ thuật sản xuất giống tôm xanh (Macrobrachium rosengbergii) NXB Nông Nghiệp, trang 127 [7] Nguyễn Việt Thắng (1993) Một số đặc điểm sinh học sản xuất giống tôm xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) Luận án Phó Tiến Sĩ [8] Chung Quang Trí (2006) Thử nghiệm dùng hormone đực giáp xác thuộc mười chân Decapoda để đực hóa hậu ấu trùng tơm xanh Macrobrachium rosenbergii de Man Khóa luận cử nhân khoa học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên (ĐHQG Thành Phố Hồ Chí Minh), Hồ Chí Minh 44 Đồ án tốt nghiệp [9] Phạm Anh Tuấn (2002) Nghiên cứu sản xuất tôm xanh tồn đực Tạp chí Thủy Sản, số 1+2/2002 [10] Nguyễn Thị Thanh Thủy (2002) Kỹ thuật sản xuất giống tôm xanh Macrobrachium rosenbergii, NXB Nông Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh [11] Đỗ Năng Vịnh (2007) Cơng nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gene tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Cơng Nghệ Sinh Học, (3), 265-275 Tài liệu nước ngoài: [12] Charniaux-Cotton H (1954) Descouverte chezun crustacen (Orchestia gammarella) d’une glande endocrine responsable de la differenciation des caracteres sexuels primaires et secondaires males C R Acad Sci Paris 239: 780-782 [13] Charniaux-Cotton, H., and G Payen (1985) Sex differentiati In The biology of Crustacea Edited by D E Bliss and L H Mantel, vol 9, pp 147-215 New York: Academic Press [14] Davis ME, et al (2010) Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles Nature 15; 464 (7291): 1067-1070 [15] Dewi R, Ikhsan Khasani, Sularto and Wahyu Pamungkas (2006) Production of female giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) through hormonal induction, Indonesian Aquaculture Jounal, 1(1), pp 35 - 38 [16] Doré-Savard Louis, Geneeviève Roussy, Marc-André Dansereau, Michael A Collingwood, Kim A Lennox, Scott D Rose, Nicolas Beaudet, Mark A Behlke and Philippe Sarret (2008) Central delivery of Dicer-substrate siRNA: A direct application for pain research Molecular Therapy vol 16 no 7, 1331-1339 [17] Estrada P, Juana M Lugo, Jannel Acosta, Yamila Carpio, Ingrid Borroto, Yuliet Morera, Osmany Gonzalez, Tania Rodriguez, Laida Ramos, Alberto Huberman (2007) Effect of RNA interference on genee functions of aquatic organisms Biotecnologia Aplicada, Vol 24, No 45 Đồ án tốt nghiệp [18] Fabioux C , Charlotte Corporeau, Virgile Quillien, Pascal Favrel and Arnaud Huvet (2009) In vivo RNA interference in oyster-vasa silencing inhibits germ cell development FEBS Journal 276, 2566-2573 [19] Fingerman M (1997), Role of neurotransmitters in regulating reproductive hormone release and gonadal maturation in decapods crustaceans, Invertebrate Reproduction and Development, 31, pp 47- 74 [20] Fire, A and Timmons, L (1998) Specific interference by ingested dsRNA Nature 395, 854 [21] Fire A et al (1998) Potent and specific geneetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature, 19:391 (6669):806-11 [22] George L Sen and Helen M Blau (2006) A brief history of RNAi: the silence of the genees The FASEB Journal, vol 20 [23] Grimaldi A, Tettamanti G, Rinaldi L, Brivio MF, Castellani D and de Eguileor M (2004) Muscle differentiation in tentacles of Sepia officinalis (Mollusca) is regulated by muscle regulatory factors (MRF) related proteins Dev Growth Differ 46, 83-95 [24] Guan H., Mak C H and Chan S M (2004) Double-stranded RNA induce genee silencing of CHH/MIH/GIH neuropeptide genee family in sand shirmp, Metapenaeus Abstract Book of the Keystone Symposia on siRNAs and miRNAs, p 108 Keystone, CO, USA [25] Guo S and Kemphues KJ (1995) par-1, a genee required for establishing polarity in C elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed Cell 81, 611-620 [26] Hui JHL, Tobe SS and Chan SM (2008) Characterization of the putative farnesoic acid O-methyltransferase (LvFAMeT) cDNA from white shrimp, Litopenaeus vannamei: evidence for its role in molting Peptides 29: 252260 [27] Hutvagner G and Zamore PD (2002) RNAi: nature abhors a double-strand Curr Opin Geneetics & Development 12: 225-232 46 Đồ án tốt nghiệp [28] Katakura, Y (1989) Endocrin and geneetic control of sex differenciation in the malacostracan Crustacea Invert Reprod Development., 16, 177-182 [29] Kitagishi Y, Satoru Matsuda, Yuri Nishimura, Naoko Okumura, Chika Tateishi, Hitomi Yoshida (2012) Dicer functions in aquatic species, SAGE Hindawi Access to Research, Journal of Amino Acids, Volume 2012 Article ID 782187, pages, doi:10.4061/2012/782187 [30] King D S (1964) Fine structure of the androgeneic gland of the crab, Pachygrapsus crassipes Geneeral and Comparative Endocrinology, vol 4, no 5, pp 533-544 [31] Kuris A M, Z Ra’anan, A Sagi, and D Cohen (1987) Morphotypic differentiation of male Malaysian giant prawn, Macrobrachium rosenbergii Journal of Crustacean Biology, vol 7, pp 219-237 [32] Li Y X, Michael J Farrell, Ruiping Liu, Nita Mohanty, Margaret L Kirby (2000) Double-Stranded RNA injection produces null phenotypes in Zebrafish.DevelopmentalBiology217, 394-405 doi:10.1008/dbio.1999.9540 [33] Ling, S W (1969) The geneeral biology and development of Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) FAO Fisheries Report, S7: 589-606 [34] Ling, S W (1962) Studies on the rearing of larvae and juveniles and culturing of adults of Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) IndoPacific Fisheries Council Current Affairs Bulletin, 35: 1-11 [35] Lu, L et al (2006) Suppression of porcine arterivirus replication by baculovirus delivered shRNA targeting nucleoprotein Biochem Biophys Res Commun 340, 1178-1183 [36] Malecha S R, P A Nevin, P Ha et al (1992) Sex-ratios and sexdetermination in progeney from crosses of surgically sex-reversed freshwater prawns, Macrobrachium rosenbergii Aquaculture, vol 105, no 3-4, pp 201-218 [37] Martin G, O Sorokine, M Moniatte, P Bulet, C Hetru, and A van Dorsselaer (1999) The structure of a glycosylated protein hormone responsible for sex 47 Đồ án tốt nghiệp determination in the isopod, Armadillidium vulgare European journal of Biochemistry, vol 262, no 3, pp 727-736 [38] Napoli C, Lemieux C and Jorgenesen R (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase genee into petunia results in reversible co-suppression of homologous genees in trans Plant Cell 2, 279-289 [39] Nagamine C, Allen W Knight, Armand Maggeneti and Gaylen Paxman (1980) Masculinization of female Macrobrachium rosenbergii(de Man) (Decapoda, Palaemonidae) by androgeneic gland implantation, Geneeral and comparative endrocrinology, 31(4), pp 442-457 [40] Naldini, L et al (1996) Efficient transfer, integration, and sustained longterm expression of the transgenee in adult rat brains injected with a lentiviral vector Proc Natl Acad Sci U S A 93, 11382-11388 [41] New, M B (2002) Farming Freshwater Prawns: A manual for the culture of the giant river prawn (Macrobrachium rosernbergii) FAO Fisheries Technical Paper 212 [42] New, M B (2005) Freshwater Prawn Framing: Global Status, Recent Research and a Glance at the future 36: 210-230 [43] New, M B and Singholka, S (1982) Freshwater prawn farming A manual for the culture of Macrobrachium rosenbergii FAO Fisheries Technical PaperNo 225 Rome, FAO 116 pp [44] Nhan, D.T (2009) Optimization of hatchery protocols for Macrobrachium rosenbergii culture in Vietnam PhD thesis, Ghent University, Belgium, pp.265 [45] Ohs CL, D`abramo LR and Kelly AM (2006) Effect of dietary administration of 17α-methyltestosterone on the sex ratio of postlarval freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, during the nursery stage of culture Journal of the World Aquaculture Society 37: 34-46 [46] Ohs CL, D`abramo LR, Hanson LP and Kelly AM (2006) Apparent control of sexual differentiation of freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, 48 Đồ án tốt nghiệp through dietary administration of dopamine hydrochloride Journal of Applied Aquaculture 18(3) :19-32 [47] Okuno A., Y Hasegawa, T Ohira, Y Katakura, and H Nagasawa (1999) Characterization and cDNA cloning of androgeneic gland hormone of the terrestrial isopod Armadillidium vulgare Biochemical and Biophysical Research Communications, vol 264, no 2, pp 419-423 [48] Okumura T and Motoyuki Hara (2004) Androgeneic gland cell structure and spematogeneesis during the molt cycle and correlation morphotypic differentiation in the giant fresshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii Zoological science 21: 621-628 [49] Ongvarrasopone C, Roshorm Y and Panyim S (2007) A Simple and Cost Effective Method to Geneerate dsRNA for RNAi Studies in Invertebrates ScienceAsia 33: 35-39 [50] Parrish S, Fleenor J, Xu S, Mello C and Fire A (2000) Functional anatomy of a dsRNA trigger: Differential requirements for the two trigger stranded in RNA interference Molec Cell 6, 1077-1087 [51] Ra’anan Z and D Cohen (1984) Ontogeney of social structure and population dynamics in the fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii (de Man), p 277-311 In F.M Schrum and A Wener (eds.) Crustacean issue II: Crustacean growth A.A Balkema, Rotterdam [52] Romano N and Macino G (1992) Quelling: Transient inactivation of genee expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences Mol Microbiol 6, 3343-3353 [53] Rosen O, Rivka Manor, Simy Weil, Ohad Gafni, Assaf Linial, Eliahu D Aflalo, Tomer Ventura, Amir Sagi (2010) A sexual shift induced by silencing of a single insulin-like genee in Crayfish: Ovarian upregulation and testicular degeneeration PLoS ONE, Volume 5, issue 12, e15281 [54] Sagi A, Dan Cohen, and Yoram Milner (1989) Effect of androgene gland ablation on morphotypic differentiation and sexual characteristics of male 49 Đồ án tốt nghiệp Freshwater Prawn, Macrobrachium rosenbergii, Geneeral and comparative endocrinology, 77, pp 15 - 22 [55] Sagi A, Eviatar Snir and Isam Khalaila (1995) Sexual differentiation in decapods crustaceans: role of the androgeneic gland, Invertenrate Reproduction an Development, 31(1-3), pp 55 - 61 [56] Sagi A, Milstein A, Eran Y, Joseph D, K2la I, Abdu U, Harpaz S and Karplis I (1997a) Culture of the Australian redclaw crayfish (Cherax quadricarinatus) in Israel, II Second growout season of overwintered populations Israelli Journal of Aquaculture-Bamidgeh 59:222-229 [57] Sagi A and Afalo ED (2005) The androgeneic gland and monosex culture of freshwater prawn Macrobrachium Rosenbergii (De Man):a biotechnological perspective Aquaculture Research.36: 231-237 [58] Sagi A and Ra`ana Z (1988) Morphotypic differentiation of males of freshwater prawn Macrobrachium rosengergii: changes in the midgut glands and the reproductive system Journal of crustacean biology 8: 43-47 [59] Sagi A and Khalaila I (2001) The crustacean androgene: A Hormone in an Isopod and androgeneic activity in Decapods Amer Zool 41 (3): 477-484 doi: 10.1093/icb/41.3.477 [60] Sarathi M, M C Simon, C Venkatesan, J Thomas, M Ravi, N Madan, S Thiyagarajan and A S Sahul Hameed (2010) Efficacy of bacterially expressed dsRNA specific to different structural genees of white spot syndrome virus (WSSV) in protection of shrimp from WSSV infection Journal of Fish Diseases, 33, 603-607 [61] Siddiqui M.A and Adamek, Z (1997) Reproduction parameters in a natural population of topmouth gudgeon, Pseudorasbora parva, and its condition and food characteristics with respect to sex dissimilarities Polskie Archiwum Hydrobiologii 44(1-2):145-152 [62] Suzuki S (1999) Androgeneic gland hormone is a sex-reversing factor but cannot be a sex-determining factor in the female Crustacean 50 Đồ án tốt nghiệp Isopods Armadillidium vulgare, Geneeral and comparartive endrocrinology, 115(3), pp 370-378 [63] Taketomi Y, M Murata, and M Miyawaki (1990) Androgeneic gland and secondary sexual characters in the crayfish Procambarus clarkii Journal of Crustacean Biology, vol 10, pp 492-497 [64] Teerapong Ho, Pratchayapong Yasri, Sakol Panyim, Apinunt Udomkit (2011) Double-stranded RNA confers both preventive and therapeutic effects against Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) in Litopenaeus vannamei Virus Research 155, 131-136 [65] The Nobel Assembly at Karolinska Institutet (2006) RNA interference Advanced information on The Nobel Prize in Physiology or Medicin [66] Tiu SH and Chan SM (2007) The use of recombinant protein and RNA interference approaches to study the reproductive functions of a gonadstimulating hormone from the shrimp Metapenaeus ensis T FEBS J 274: 4385-4395 [67] Ventura T, Manor R, Aflalo ED, Weil S, Raviv S, Glazer L and Sagi A (2009) Temporal silencing of an androgeneic gland-specific insulin-like genee affecting phenotypical geneder differences and spermatogeneesis Department of Life Geneeral Endocrinology 150: 1278-1286 [68] Ventura T, ED Aflalo, S Weil, K Kashkush and A Sagi (2011) Isolation and characterization of a female-specific DNA marker in the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii Heredity, 1-6 [69] Zamore PD, et al (2000) RNAi: double-stranded RNA directs the ATPdependent cleavage of mRNA at 21-23 nucleotide intervals Cell 31; 101 (1): 25-33 51 Đồ án tốt nghiệp 52 ... việc ni tơm xanh thương mại Xuất phát từ nhu cầu giống tơm xanh đực từ thị trường đề tài Thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded RNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium... pháp nghiên cứu 2.3.1 Quy trình tổng hợp Mr-IAG dsRNA phòng thí nghiệm Mr-IAG dsRNA tổng hợp kit Promega Vector tái tổ hợp pGEM-Mr-IAG sử dụng từ phần nghiên cứu “Phát triển phương pháp tạo tôm xanh. .. đơi có màu xanh đậm, xuất nhiều gai nhọn lơng tơ Q trình thay đổi thể qua giai đoạn như: tôm nhỏ, tôm lửa nhạt, tôm lửa đậm, tôm lửa đậm chuyển tiếp xanh, tôm xanh nhạt, tôm xanh đậm tôm già (Nguyễn