BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân lập tuyển chọn xác định môi trường nhân sinh khối chủng Azotobacter spp đất trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực MSSV: 0851110255 :MAI THỊ QUỲNH TRÂN Lớp: 08DSH1 TP Hồ Chí Minh, Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Song song với phát triển không ngừng ngành công nghiệp nơng nghiệp nước ta đạt nhiều thành tựu đáng kể nhờ tiến khoa học kĩ thuật, làm cho suất chất lượng trồng tăng lên gấp nhiều lần Trong nông nghiệp, đạm xem nguồn dinh dưỡng quan trọng trồng Việc cung cấp đạm cho trồng từ phân bón vơ quan trọng nhằm đáp ứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển phần bù đắp lại lượng đạm mà trồng lấy từ đất qua vụ mùa Khi bón phân đạm vào đất, trồng hấp thu khoảng 40 - 50% lượng phân bón, lượng lại bị nước mưa, nước tưới rửa trơi, bị chuyển hóa bốc dạng NH3, NOx, N2 Bên cạnh đó, lạm dụng nhiều phân bón hóa học để gia tăng suất làm cho đất đai ngày bạc màu, độ phì nhiêu dần, tình trạng nhiễm nguồn nước mặt gây nên tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe môi trường sống người sinh vật khác tự nhiên (Shenoy ctv, 2001; Huỳnh Thu Hòa, 2006) Vì vậy, việc gia tăng bón phân đạm hóa học giải pháp tạm thời, áp dụng lâu dài chúng phát sinh nhiều mối lo ngại Hiện nay, phân vi sinh có nhiều ưu điểm hẳn so với phân hóa học nhờ tác dụng nâng cao suất chất lượng trồng, giảm chi phí sản suất phân vi sinh góp phần quan trọng việc bảo vệ môi trường phát triển nông nghiệp bền vững Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh nước ta chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất nông nghiệp, quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hồn thiện ổn định Do đó, nghiên cứu để hoàn thiện nâng cao chất lượng phân vi sinh việc làm cần thiết Trong đó, việc phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật khâu quan trọng quy trình tạo chế phẩm [7] Thời gian gần việc nghiên cứu sử dụng phân sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật, nhiều nước giới quan tâm nhằm tạo sản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất nông nghiệp bảo vệ môi trường Đồ án tốt nghiệp hướng tới xây dựng nông nghiệp bền vững Và hướng nghiên cứu ý nhiều sản xuất phân sinh bón vi sinh cố định đạm có nguồn gốc từ vi sinh vật với chủng Azotobacter spp chủng quan tâm nhiều nhiều đặc điểm thuận lợi khả cố định đạm tự khơng khí, tổng hợp nhiều chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, GA3… làm hệ thống rễ phát triển vững chắc, hấp thu nước chất dinh dưỡng tốt (Okon, 1985) góp phần nâng cao độ phì nhiêu đất, kích thích tăng trưởng, tăng suất trồng, hạn chế bón phân hóa học phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững [11] Xuất phát từ thực tế đó, tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn xác định môi trường nhân sinh khối chủng Azotobacter spp đất trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh” Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn số chủng Azotobacter cố định đạm cao đất trồng Xây dựng quy trình nhân sinh khối số chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm làm phân sinh học chuyên dụng cho trồng Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học - Xác định số chủng Azotobater spp có khả cố định đạm ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh - Thiết lập quy trình nhân giống, nhân sinh khối Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài sở cho việc lựa chọn chủng Azotobacter spp có hoạt tính cố định đạm để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng suất trồng góp phần phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi sinh vật cố định Nitơ (N) 1.1.1 Chu trình Nitơ tự nhiên Nitơ nguồn dinh dưỡng quan trọng thiếu động vật, thực vật loài vi sinh vật Dự trữ nitơ tự nhiên lớn khơng khí, nitơ chiếm 78,16% thể tích Người ta ước tính rằng, bầu khơng khí bao trùm lên hecta đất đai chứa tới triệu nitơ Lượng nitơ cung cấp cho trồng tới hàng chục triệu năm (nếu trồng có khả đồng hóa nó) Trong thể loại sinh vật trái đất có khoảng 0,4 x 109 nitơ Trong vật trầm tích chứa khoảng x 1015 tỷ nitơ Cây trồng không đồng hóa trực tiếp nitơ hữu cơ, mà phải nhờ loại vi sinh vật phân hủy chuyển hóa nguồn nitơ bền vững thành nitơ dạng dễ tiêu (NH3 NH4+), cung cấp nguồn dinh dưỡng nitơ cho trồng, trình gọi trình amơn hóa Tiếp nối q trình amơn hóa, lồi vi sinh vật lại chuyển hóa tiếp từ NH3 thành NO3- gọi q trình nitrat hóa Tiếp theo q trình nitrat hóa, loại vi sinh vật lại chuyển hóa từ NO3thành N2 để bù trả nitơ cho khơng khí gọi q trình phản nitrat hóa Dưới tác dụng loại vi sinh vật, nitơ khơng khí chuyển vào hợp chất hữu chứa nitơ gọi trình cố định nitơ phân tử Tất trình: cố định – phân hủy - chuyển hóa phản nitrat hóa ln xảy tác dụng lồi vi sinh vật tạo cân nitơ Nhờ mà khép kín vòng tuần hồn nitơ tự nhiên Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Vòng tuần hồn nitơ tự nhiên Hợp chất Nitơ (protein, urea…) Vi sinh vật thủy phân Ammoniac Tạo sinh khối Tế bào Nitơ hữu Tế bào thực vật Phân hủy nội bào NO2Khử nitrat Khí Nitơ NO-3 Chất hữu Carbon Hình 1.2 Tóm tắt qúa trình chuyển hóa nitơ vi sinh vật (theo climategis.com) Đồ án tốt nghiệp 1.1.2 Các vi sinh vật cố định Nitơ phân tử Vi sinh vật cố định N có vai trò quan trọng chu trình tuần hồn N2 cung cấp lượng N đáng kể cho trồng Theo tính tốn nhà khoa học, nhóm vi sinh vật cố định N BNF (Biological nitrogen fixation) cung cấp tới 240 x 106 N/năm hành tinh, gấp lần lượng N mà giới sản xuất đường hóa học Vi sinh vật cố định N nhóm vi sinh vật có khả chuyển hóa khí N2 dồi khí (79%) thành dạng NH4+ cung cấp cho Có nhóm vi sinh vật cố định nitơ :1) nhóm vi sinh vật sống tự hội sinh; 2) nhóm vi sinh sống cộng sinh 1)Nhóm vi sinh vật sống tự hội sinh co số lồi điển hình sau: Vi khuẩn Azotobacter Vi khuẩn Beijerinskii Vi khuẩn Clostridium 2)Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh có số lồi điển hình sau: Rhizobium Azospirillum Một số vi sinh vật cố định đạm khác Ngoài giống vsv cố định nitơ phân tử nói trên, vơ số giống khác có khả cố định nitơ phân tử, chúng có nhiều ý nghĩa sản xuất nông lâm, ngư nghiệp  Vi khuẩn: Pseudomonas Azotomonas insolita, Azotomonas fluorescens, azotogenis,Klebsiella pneumonia,; Aerobacter aerogene, Rhodospirillum rubrum,Chromatium sp,Chlorobium sp, Rhodomicribium spp,Desulfovibrio desulfuricans; Methanobacterium spp…  Xạ khuẩn : Một số loài thuộc giống: Actinomyces, Frankia, Nocardia,  Actinopolyspora,…  Tảo – Vi khuẩn lam: Plectonema, Anabaena azolla,; Anabaena  Ambigua, Anabaena cylindrica, Calothrix elenkii Đồ án tốt nghiệp 1.1.3 Quá trình cố định Nitơ phân tử Trong suốt thời gian dài, chế trình cố định nitơ bí ẩn tự nhiên Trong người sử dụng điều kiện kỹ thuật cao tốn (400- 5000 C, 200-1000atm) để phá vỡ mối liên kết ba phân tử nitơ Phân tử N2 (có lượng 9,4.105J/mol) vi sinh vật cố định đạm lại đồng hóa điều kiện bình thường áp suất nhiệt độ Những nghiên cứu năm gần cho thấy rõ phần chế trình cố định nitơ nhờ enzyme Quá trình cố định nitơ trình khử N2 thành NH3 nhờ enzyme nitrogenase với có mặt ATP (andenozintriphotphat N2+ AH2 + ATP -> NH3 + A + ADP + P (AH2 chất cho e) ADP: adenozin photphat ATP cấu tạo thành nhóm base nitro adenine, đường ribose nhóm phosphate Bằng phương pháp sắc ký ICC ”120” BIP (Pháp) với cột sắc ký poropak, ta nhận xác định cường độ cố định nito phân tử theo hoạt tính nitrogenase Sau thời gian nghiên cứu nhà khoa học dần hoàn thiện chế cố định nito phân tử Theo chế (1992) trình cố định nitơ phân tử chia theo hai hướng bản: đường khử đường oxi hóa Q trình cố định nitơ thể phương trình sau: N2 → HN=NH → H2N - NH2 → NH3→ NH4OH N2 + 8e- +16Mg.ATP + 8H + 16O nitrogenase, 2NH3 + 16Mg.ADP +16P + H 2O Cơ chế trình cố định nitơ phức tạp làm sáng tỏ nhờ cơng trình nghiên cứu nhiều năm gần (Hardy, Bun, 1968; Mortenson, 1966, 1968; Hardetal, 1970; Bulen, Lecomte, 1966; Begersen, 1969; Silop, 1971…) Nitrogenase phức gồm protein chủ yếu: protein MoFe (nitrogense, MW 220000) liêm kết với 1-2 protein Fe (nitrogenase reductase, MW 64000) Fe phân tử có khối lượng phân tử khoảng 6.104 Mo-Fe protein có khối lượng phân tử khoảng 2,2.105 Đồ án tốt nghiệp Mo-Fe protein chứa hai nguyên tử Mo (molipden) 28-32 nguyên tử Fe 25-30 nguyên tử sắt không bề với axit Fe Mo protein Mo-Fe chứa bên cột cofactor gọi FeMo-co khử N2 diễn cofactor Quá trình khử: Trước hết protein Fe khử ferredoxin sau liên kết với ATP làm thay đổi hình thể protein Fe hạ thấp khử protein ( từ 100mV- 400mV) tạo điều kiện cho protein Fe khử protein MoFe ATP bị thủy phân diễn chuyển đổi electron Cuối protein Mo-Fe khử chuyển electron tới nitrogen nguyên tử Electron chất khử (ferredoxin, ditionit) vào trung tâm chứa Fe thành phần II ( protein Fe) tiếp tục chuyển thành phần enzyme (protein Mo-Fe) Electron hoạt hóa theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo, bên “hạt”, Mo bị khử, nhờ có khả phản úng nhanh với N2.Phân tử N2 qua khe có kích thước khoảng 4-5 0A, tức tương đương với chiều dài phân tử N2 vào bên enzyme hoạt hóa Kết q trình nitrogenase hoạt hóa hấp thụ hóa học nitơ làm đứt hai dây nối số dây nối cực phân tử N2 lượng tiêu phí 7,8.105j/mol Dây nối thứ basex bị cắt đứt tiếp xúc với hydro hoạt hóa nhờ enzyme dihydrogenase hệ thống hydrogenase Sau NH3 sản phẩm khử sinh liên kết axit để tạo thành axit amin Con đường oxi hóa: N2 → N2O → (HNO)2 → NH4OH Qua hai hướng người ta thu kết sau: Nếu nồng độ nitơ nhiều ức chế trình tạo nito phân tử Hiệu suất cố định nitơ phân tử vi sinh vật kỵ khí thường cao vi sinh vật hiếu khí.tìm thấy hợp chất loại khử nuôi vi sinh vật cố định nitơ phân tử Qua cho ta thấy đường khử có nhiều khả Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3 Sơ đồ chuyển điện tử trình khử oxi hóa N 1.2 Vi khuẩn Azotobacter 1.2.1 Phân loại Theo Fribram (1938) phân loại khoa học Azotobacter ghi nhận sau: Giới: Vi khuẩn Ngành : Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Azotobacteraceae Chi : Azotobacter Azotobacter vi khuẩn cố định nitơ sống tự đất nhà vi sinh vật Hà Lan Beijerinckphân lập nuôi cấy khiết năm 1901 Theo Becking (1974), Azotobacter spp có lồi đặc trưng sau A.chroococcum  Beijerinckii  A.vinelandii  A.agilis Đồ án tốt nghiệp Theo FAO (1982) Azotobacter sppcó lồi phổ biến sau :  A.chroococcum  A.beijerinekii  A.vinellandii  A.insignis  A.agilis  A.macrocytogenes  A.paspali 1.2.2 Đặc điểm hình thái Azotobacter spp vi khuẩn hiếu khí phát triển điều kiện vi hiếu khí, Gram âm không sinh bào tử Vi khuẩn Azotobacter nuôi cấy môi trường nhân tạo thường biểu đặc tính đa hình Hình dạng tế bào chu kì biến đổi chúng phụ thuộc vào tuổi ống giống điều kiện phát triển Khi non tế bào có dạng que đầu tròn đứng riêng lẻ hay xếp thành đôi chồng chất, chất tế bào nhuộm màu đồng đều, sinh sản cách phân cắt có khả di động nhờ tiên mao Kích thc: 2,0-7,0 ì 10-25 àm Khi gi t bo Azotobacter khả di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng hình cầu Khi già, tế bào thường bao bọc lớp vỏ dày tạo thàng nang xác Khi môi trường sống không thuận lợi thay đổi nồng độ chất dinh dưỡng bổ sung số chất hữu ethanol, butanol-n βhydroxybutyrate Khi gặp điều kiện thuận lợi, nang xác nứt tạo thành tế bào Azotobacter spp hình thành nang mơi trường lỏng Trên mơi trường đặc, khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhày, đàn hồi, lồi, có dạng nhăn nheo Khi già, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng màu nâu đen Màu sắc khuẩn lạc tiêu chuẩn để phân loại loài Azotobacter Trong đất, Azotobacter spp thường phổ biến loài sau: Azotobacter chrococcum (đồng danh: Az.acidum, Az.araxii, Az.nigricans, Az.galophilum, Az.unicapsulare, Az.woodswnii): Kích thước tế bào 2,0 x 3,1µm, có Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh khối chủng Azotobacter spp 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 A5 0.10 A4 0.08 A1 0.06 0.04 0.02 0.00 12H 24H 36H 48H 60H 72H Qua đường cong tăng trưởng tb biểu đồ 3.3 cho thấy trình nhân sinh khối tế bào, chủng A4 nên tiến hành thu nhận tế bào giai đoạn 48h sau nuôi cấy Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận  Đề tài phân lập chủng Azotobacter spp từ mẫu đất trồng bắp, đậu xanh xác định đặc điểm, hình thái chủng Azotobacter phân lập  Đã xác định khả cố định nitơ chủng Azotobacter Trong có chủng A4, A5 có khả có định Nitơ cao tương ứng 1,753mg/ml; 2,08mg/ml; 1,938mg/ml cao hẳn so với chủng nhập nội  Tất chủng Azotobacter spp phân lập có khả kích thích nảy mầm hạt Các chủng A4, A5 có khả kích thích nảy mầm hạt tốt  Chủng A4, A5 vừa có khả cố định nitơ cao vừa có khả kích thích tốt nảy mầm hạt sử dụng chủng đển làm vật liệu sản xuất phân bón vi sinh  Các chủng vi khuẩn Azotobacter spp A4, A5 có khả sinh trưởng phát triển tốt môi trường chọn; pH ~ 7; nhiệt độ 28 0C; tốc độ lắc 150 vòng/phút Trong đó, chủng A4 có khả sinh trưởng mạnh  Thời gian đạt sinh khối lớn chủng A4 môi trường 48h sau nuôi cấy 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu thu thập vi khuẩn cố định đạm Azotobacter hệ đất trồng khác Đề nghị tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp chủng vi khuẩn Azotobacter có khả cố định đạm chủng vi sinh vật có ích khác đến sinh trưởng, phát triến suất giống trồng trước tiến hành sản xuất phân vi sinh Khảo sát thêm môi trường lên men nhân sinh khối từ nguyên liệu phế thải nông nghiệp, công nghiệp bã mía, bã bia, 45 Đồ án tốt nghiệp Khảo sát thêm yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men nhân sinh khối tốc độ lắc, nhiệt độ lên men, thiết bị lên men, Quy trình sản xuất phân bón vi sinh Azotobacterin đề xuất Giống Azotobacter Hoạt hóa Nhân giống Cấy giống (5%) Lên men chìm (28C, pH 7, lắc 150vòng/phút) Chất mang vô trùng Xử lý sinh khối Sản phẩm 46 Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình Giai đoạn chuẩn bị (Upstream processing): Chuẩn bị giống: Tiến hành hoạt hóa Azotobacter từ giống gốc mơi trường Ashby Mơi trường nuôi cấy phân vào đĩa Petri hấp khử trùng Cấy truyền từ giống gốc sang đĩa Petri vừa chuẩn bị, sau đem lắc nhiệt độ phòng ngày Tiếp theo ta tiến hành nhân giống Azotobacter trước lên men nhân sinh khối cách đem lắc bình tam giác vòng 24 Mơi trường nhân giống gồm thành phần: Nguồn C 10g sucrose KH2PO4 0.5 K2HPO4 0.5 MgSO4.7H2O 0.2 NaCl 0.1 Cao nấm men 10 pH 7.0 T0 nuôi cấy 30 0C Thời gian 36h Lắc 150 vòng/phút Chuẩn bị mơi trường lên men: thành phần mơi trường lên men nhân sinh khối Azotobacter gồm:      Thành phần môi trường (g/l) Saccharose Cao nấm men Dung dịch khoáng đa lượng Dung dịch khoáng vi lượng (pha dung dịch mẹ nồng độ x 100 sau sử dụng 10ml dung dịch mẹ cho lít mơi trường) Nước cất Lắc 150 vòng/phút 47 Đồ án tốt nghiệp Tiệt trùng môi trường: môi trường chứa thiết bị lên men, dẫn cách liên tục qua thiết bị tiệt trùng nhiệt ẩm để hạn chế tối đa mầm bệnh cạnh tranh vi sinh vật tạp Xử lý nguồn nguyên liệu dung làm chất mang: có nhiều nguồn nguyên liệu sử dụng làm chất mang như: than bùn, phân trùng quế, đất sét, vermicul, rác thải sinh hoạt, … Trong quy trình nguồn nguyên liệu chọn sử dụng than bùn phân trùng quế: Nguồn nguyên liệu đầu vào có kích thước khơng đồng nên phải tiến hành nghiền râynhỏ kích thước 0,25 mm Điểu chỉnh pH ~ CaCO3, độ ẩm khoảng 20% để đạt hiệu cao trình khử trùng Xử lý nhiệt ẩm nhiệt độ trung bình khoảng 121C với thời gian 90 phút Tiến hành bước trao đổi nhiệt để hạ nhiệt độ nguồn nguyên liệu xuống 40C Cuối tiến hành đem phối trộn với sinh khối Azotobacter sau lên men Giai đoạn lên men (fermentor): Môi trường lên men sau tiệt trùng dẫn đến thiết bị lên men chính, tiến hành cấy giống với tỷ lệ 5% thể tích lên men Các thơng số kỹ thuật giai đoạn này: Nhiệt độ: kiểm soát nhiệt độ tối ưu 28C pH: kiểm soát pH dung dịch NaOH H2SO4 Độ thơng khí: lắc 150vòng/ phút Thời gian lên men: 48 - 60giờ Giai đoạn sau lên men (downsteam processing): Sinh khối sau lên men phối trộn với chất mang xử lý tạo sản phẩm phân vi sinh vật chất mang vô trùng Trong đó, sinh khối Azotobacter thu phối trộn với chất mang theo tỷ lệ thể tích thích hợp điều kiện vơ trùng, sau chuyển đến nơi thoáng mát giữ nhiệt độ 28C Sau thời gian sinh trưởng tuần, sản phẩm sử dụng 48 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Bộ nông nghiệp phát triển nơng thơn, Chương trình hợp tác nơng nghiệp phát triển nông thôn (CARD) (2009), Báo cáo chế phẩm nốt sần chất lượng cao, pp – 25 Châu Ngọc Anh (2012) Đồ án Thiết lập mẫu Azotobacter vùng sinh thái ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh, ĐH Kỹ Thuật Cơng Nghệ TP.HCM, Tp Hồ Chí Minh Đỗ Thu Hà et al., (2008) Phân lập tuyển chọn số chủng VK Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza sinh tổng hợp IAA từ đất thơn Bình Kỳ- Hòa Q- Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng, Tuyển tập báo cáo khoa học, Đại học Đà Nẵng Hồ Thị Kim Anh, Nguyễn Ngọc Dũng, Phạm Thị Hoài Anh (1999) Ảnh hưởng chủng vi khuẩn cố định nitơ rễ lúa lên sinh trưởng mầm lúa CR203, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Lê Hà Phương (2009) Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Phân lập số dòng vi khuẩn có khả tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) từ đất trồng rau thử nghiệm rau muống Tiền Giang, ĐH Cần Thơ, TP Cần Thơ Lê Thị Vu Lan, Phạm Minh Nhựt (2008) Bài giảng thực tập vi sinh đại cương, ĐH Kỹ Thuật Cơng Nghệ TP.HCM Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001) Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Thị Luyện (2011) Đồ án Phân lập tuyển chọn chủng Azotobacter đất phục vụ sản xuất phân bón hữu vi sinh, ĐH Kỹ Thuật Cơng Nghệ TP.HCM, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thu Hà, Vũ Minh Đức, Nguyễn Ngọc Quyên, Ngô Tự Thành (2003) Đặc tinh sinh học số chủng Azotobacter, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, số 49 Đồ án tốt nghiệp 10 Phạm Bích Hiên, Phạm Văn Toản, Báo cáo hội nghị CNSH toàn quốc (2003) Nghiên cứu tuyển chọn số chủng Azotobacter đa hoạt tính sinh học sử dụng cho sản xuất phân bón vi sinh chức 11 Phạm Thị Ngọc Lan, Võ Thị Mai Hương (1999) Góp phần nghiên cứu vi khuẩn cố định Nitơ sồng tự đất hoa màu Thừa Thiên Huế, Đại học Khoa học, Đại học Huế 12 P.T.S Nguyễn Thị Phương Chi, P.T.S Nguyễn Ngọc Dung, Báo cáo tổng kết đề tài chương trình cơng nghệ sinh học giai đoạn 1991 - 1994 (1993) Nghiên cứu công nghệ sản xuất ứng dụng phân vi sinh vật cố định đạm nhằm cao suất lúa trồng cạn, pp 12- 36 13 Thái Văn Nam (2011) Đồ án Sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm, ĐH Kỹ Thuật Cơng Nghệ TP.HCM, Tp Hồ Chí Minh 14 Trần LinhPhước (2003) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, NXB Gíao Dục, TP.Hồ Chí Minh 15 Ts Trần Nguyên Thảo, Báo cáo tổng kết đề tài Bộ cơng thương Viện nghiên cứu có dầu có dầu (2011) Nghiên cứu ứng dụng Polymer để sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho đậu tương lạc, pp 24- 32 16 Ts Nguyễn Hoài Hương (2009) Bài giảng thực hành lên men môi trường, ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM 17 TS Nguyễn Hoài Hương, Bùi Văn Thế Vinh (2008) Bài giảng thực hành hóa sinh, ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM 18 Võ Văn Minh (2008) Giải pháp nông nghiệp sinh thái đô thị, Trường ĐH Sư Phạm – ĐH Đà Nẵng 50 Đồ án tốt nghiệp Tài liệu tiếng Anh: 19 Ahmad Farah, Iqbal Ahmad, Mohd Saghir Khan (2005) Indole Acetic Acid production by the indigenous isolates of Azotobacter and Fluorescent Pseudomonas in the presence and absence of Tryptophan, Turk J Biol 29, pp 29 - 34 20 C.Pairintra and Pakdee Population dynamics of Effective Microorganism under saline soil condition in Thailand, Soil Science Department Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand, pp 1-6 21 Cristiana Felici, Lorenzo Vettori, Enrico Giraldi, Laura Maria Costantina Forino, Annita Toffanin, Anna Maria Tagliasacchi, Marco Nuti (2008) Single and co-inoculation of Bacillus subtilis and Azospirillum brasilense on Lycopersicon esculentum: Effectson plant growth and rhizosphere microbialcommunity, Applied Soil Ecology, Vol 40, pp 260 – 270 22 Elazar Fallik’ and Yaacov Okon (1996) Inoculants of Azospirillum brasilense: biomass production, survival and growth promotion of Setaria italica and Zea mays, Soil Biol Biochem, Vol 28, pp 123-126 23.Islam M.Z., Sharif D.I and Hossain M.A.(2008) A comparative study of Azotobacter spp from different soil sample, J.Soil, Nature 2(3), pp 16 - 19 24 FAO Application of Nitrogen-Fixing Systems in Soil Improvement and Management, Food and Agriculture Organization of the United Nations FAO Soils Bulletin 49, Rome (1982) 25 FAO (2007) Guide to laboratory establishment for plant nutrient analysis, 7, pp 134 - 136 26 Fabricio Cassa´na, Diego Perriga, Vero´nica Sgroya, Oscar Masciarellia, Claudio Pennab, Virginia Lunaa (2009) Azospirillum brasilense Az39 and Bradyrhizobium japonicum E109, inoculated singly or in combination, promote seed germination and early seedling growth in corn (Zea mays L.) and soybean (Glycine max L.), European Journal of Soil Biology, Vol 45, pp 28 – 35 27 L Aquilantia,*, F Favillib, F Clementi (2003) Comparison of different strategies for isolation and preliminary identification of Azotobacter from soil samples, Soil Biology & Biochemistry 36 (2004), pp 1475–1483 51 Đồ án tốt nghiệp 28 Puneet K.; Sohal R.P (1998) Effect of innoculation of Azotobacter and PSN on fertilizer economy, plant growth and yield of winter maize, Nitrogen fixation with non legumes, Kluwer Academic Publisher, pp 271-273 29 Shabave V P., Smolin V Y., Strekozova V I, ( 1991) The effects of Azotobacter brasilense sp7 and Azotobacter chroococcum on nitrogen blance in soil under cropping with oats, Biology and Fertility of Soils, pp 290 - 292 30 Van Lierop, W(1981).Conversion of organic soil pH values measured in water, 0.01 M CaCl2 or 1N KCl, Canadian Journal of Soil Science 6, pp 577–579 52 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: CÁC PHẦN XỬ LÝ SỐ LIỆU Phân tích kết ảnh hưởng dịch ni cấy chủng Azotobacter spp sau 8h, 16h, 24h lên tỷ lệ nảy mầm hạt đậu đen ANALYSIS of VARIANCE for TY LE NAY MAM - Type III Sums of Squares Source MAIN EFFECTS A:CHUNG B:GIO INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Sum of Squares Df Mean Square FRatio PValue 1,10017 1,21006 0,122241 0,605031 24,30 0,0000 120,29 0,0000 0,242455 0,452675 18 90 0,0134697 2,68 0,0050297 3,00536 119 0,0012 Multiple Range Tests for TY LE NAY MAM by CHUNG Method: 95,0 percent LSD CHUN Count LS LS G Mean Sigma DC 12 0,46666 0,02047 A9 12 0,53333 0,02047 3 A6 12 0,6 0,02047 A8 12 0,61083 0,02047 3 A5 12 0,6225 0,02047 A2 12 0,66666 0,02047 A7 12 0,68083 0,02047 3 A1 12 0,71083 0,02047 3 A4 12 0,7775 0,02047 Homogeneous Groups X X X XX XX XX X X X 53 Đồ án tốt nghiệp A3 12 0,78666 0,02047 X Multiple Range Tests for TY LE NAY MAM by GIO Method: 95,0 percent LSD GIO Count LS LS Mean Sigma 8h 40 0,51275 0,01121 35 16h 40 0,6685 0,01121 35 24h 40 0,7555 0,01121 35 Homogeneous Groups X X X Phân tích kết ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh khối chủng Azotobacter spp sau 72h ANOVA table for SINH KHOI by MOI TRUONG Analysis of Variance Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sun of Squares 28,2648 66,3773 Df 94,6421 11 Mean Square 9,42161 8,29716 F-Ratio 1,14 P-Value 0,3914 Phân tích kết ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh khối chủng Azotobacter spp môi trường ANOVA Table for SINH KHOI by THOI GIAN Analysis of Variance Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 29.0914 Df Mean Square 5,81828 474,552 503,643 12 17 39,546 54 F-Ratio 0,15 P-Value 0,9771 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH Hình dạng khuẩn lạc chủng Azotobacter spp sau ngày nuôi cấy A1- Nhập nội A4 A7 A2 A5 A8 55 A3 A6 A9 Đồ án tốt nghiệp Khuẩn lạc chủng Azotobacter spp sau ngày nuôi cấy A1 – Nhập nội A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 56 Đồ án tốt nghiệp Kết định tính với thuốc thử Nessler Tỷ lệ nảy mầm hạt đậu đen DC A1 A3 A4 57 A2 A5 Đồ án tốt nghiệp A6 A7 A9 58 A8 ... trồng, hạn chế bón phân hóa học phát triển nơng nghiệp sinh thái bền vững [11] Xuất phát từ thực tế đó, tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: Phân lập, tuyển chọn xác định môi trường nhân sinh khối chủng... phân bón vi sinh Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn số chủng Azotobacter cố định đạm cao đất trồng Xây dựng quy trình nhân sinh khối số chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm làm phân sinh. .. học - Xác định số chủng Azotobater spp có khả cố định đạm ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh - Thiết lập quy trình nhân giống, nhân sinh khối Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài sở cho việc lựa chọn