BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN BACILLUS N6.1 ĐỐI KHÁNG EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực MSSV: 107111217 : MAI NGỌC TUYỀN Lớp: 07DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2011 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nuôi trồng thủy sản mạnh Việt Nam Tính đến thời điểm này, kim ngạch xuất thủy sản Việt Nam đạt tỷ USD với 843.000 thủy sản loại Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn dự báo, giá trị xuất thủy sản Việt Nam đến hết quý IV năm 2010 nhiều khả đạt mức 4,74 tỷ USD, riêng kim ngạch xuất cá tra chiếm ưu đạt khoảng 1,38 tỷ USD Sản lượng cá tra ngày gia tăng ln kèm theo phát sinh dịch bệnh Một bệnh quan trọng cá tra nuôi bệnh gan thận mủ, có số cơng trình nghiên cứu bệnh Và nguyên nhân gây bệnh xác định chủ yếu vi khuẩn E ictaluri (Crumlish ctv, 2002) Khi bệnh xảy ra, nông dân thường lạm dụng kháng sinh hóa chất diệt khuẩn để phòng bệnh điều trị cho cá việc tạo chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc (Schwarz ctv., 2001; Akinbowale ctv., 2006) Để thay phương pháp phòng bệnh truyền thống, phương pháp phòng trị bệnh liệu pháp sinh học sử dụng vaccine, chất kích thích miễn dịch, peptide kháng khuẩn, prebiotic (hợp chất tiền sinh học), đặc biệt phương pháp trị liệu sinh học vi sinh vật có lợi (probiotic) ngày ưa chuộng Việc sử dụng vi sinh vật thay kháng sinh để chữa bệnh trở thành bước tiếp cận đầy hứa hẹn nuôi trồng thủy sản Với ý nghĩa khoa học tính thực tiễn nêu chúng tơi tiến hành “Khảo sát số đặc tính vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra” Đề tài thực Phòng thí nghiệm Vi sinh – Phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II 1.2 Tình hình nghiên cứu Trong năm 2010, Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II tiến hành phân lập, tuyển chọn dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra Nguồn vi sinh vật phân lập từ hệ tiêu hóa, nước, bùn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt ao nuôi cá tra nguồn vi sinh từ ngân hàng vi sinh Đã tiến hành đợt thu mẫu với tổng số mẫu 284 mẫu (hệ tiêu hóa, nước bùn), số khuẩn lạc sàng lọc qua AHLs 592, vi khuẩn lactic 120 khuẩn lạc, vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus 165 khuẩn lạc Một số nghiên cứu khác vi khuẩn probiotic có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh nuôi trồng thủy sản Sàng lọc vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh cách tiếp cận sử dụng chủ yếu việc phân lập vi khuẩn probiotic Trong trình sàng lọc này, đa số nhà nghiên cứu áp dụng phương pháp xác định hoạt tính ức chế in vitro (Spangaard ctv., 2001; Chythanya ctv., 2002; Hjelm ctv., 2004) Hiện nay, có bốn phương pháp thường sử dụng để sàng lọc chủng vi khuẩn tiết hợp chất ức chế in vitro: phương pháp lớp kép (Dopazo ctv., 1988), phương pháp đục lỗ mặt thạch, phương pháp cấy ria vuông góc, phương pháp đĩa giấy khuếch tán Tất phương pháp dựa nguyên tắc chủng vi khuẩn sản xuất hợp chất ngoại bào có tính chất ức chế chủng vi khuẩn khác, hoạt tính thể thông qua việc ức chế tăng trưởng vi khuẩn khác mơi trường agar 1.3 Mục đích nghiên cứu Làm sở để tạo sản phẩm probiotic phù hợp có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E ictaluri 1.4 Nội dung nghiên cứu  Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào  Khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng khả đối kháng với E.ictaluri Bacillus N6.1  Khảo sát khả chịu pH thấp muối mật  Khả phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone  Khảo sát chất đối kháng Bacillus N6.1 lên phát triển E ictaluri phương pháp nuôi chung (co-culture) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CHƯƠNG II: TỒNG QUAN 2.1 Tình hình ni cá tra Đồng Bằng Sơng Cửu Long Trong năm gần đây, nghề nuôi thủy sản nước phát triển nhanh có nhiều bật Hiện Đồng sông Cửu Long, diện tích ni cá tra khơng lớn (năm 2009 5540 ha) sản lượng hàng năm cho 1.000.000 Năm 2010, tình hình sản xuất, tiêu thụ cá tra vùng ĐBSCL có nhiều biến động Đến hết tháng 11/2010, tổng sản lượng sản xuất cá tra toàn vùng đạt gần 2,4 tỉ cá giống, diện tích thả ni 5.420 ha, đạt 90,3% kế hoạch năm; nhờ nâng cao suất (trung bình đạt 261,2 tấn/ha/vụ) nên sản lượng cá thu hoạch 1.141.000 tấn, đạt 95,1%/năm Sản lượng cá xuất đạt 600.000 tấn, kim ngạch xuất đạt 1,3 tỉ USD, giảm 2,8% lượng, 7,8% kim ngạch xuất so kỳ năm 2009 Dự kiến năm xuất đạt 645.000 tấn, kim ngạch xuất đạt 1,4 tỉ USD Đi sâu vào hình thức mơ hình ni, nghề ni cá tra có chuyển đổi từ mơ hình nước chảy lồng bè, đăng quần sông vùng thượng nguồn sơng Tiền sơng Hậu sang mơ hình ni ao dọc cồn bãi ven sông dịch chuyển phía hạ lưu với chất lượng cá tốt Tuy nhiên, tình hình sản xuất tiêu thụ cá tra thể thiếu bền vững, có nhiều nguyên nhân chủ yếu là:  Việc phát triển cá tra nhanh năm vừa qua, đơi vượt q quy hoạch ngành, vượt ngồi quản lý nhà nước dẫn đến cạnh tranh không lành mạnh việc tiêu thụ sản phẩm thị trường quốc tế  Sự không ổn định mặt cung cầu thiếu chế liên kết phối hợp chuổi hệ thống dẫn đến hệ lụy biến động giá thị trường, chất lượng sản phẩm, ô nhiễm môi trường, phá sản người nuôi  Với số lượng lên đến tỉ giống hàng năm việc quản lý đàn cá bố mẹ trại sản xuất thời gian dài vừa qua chưa thật quan tâm mặt quản lý hổ trợ mặt kỹ thuật Hệ dẫn đến chất lượng giống cá tra có ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt biểu giảm sút, tốc độ tăng trưởng chậm hơn, dể nhiễm bệnh trình ương nuôi, tỉ lệ hao hụt cao nuôi  Bệnh cá tra nuôi nguyên nhân gây hao hụt cho người ni Trong loại bệnh gan thận mủ, bệnh trắng gan, trắng mang bệnh gây thiệt hại to lớn cho người nuôi thiệt hại đến 20 – 30% sản lượng ao ni Ngồi bệnh nội ngoại ký sinh tác nhân gây tổn thất cho ao nuôi  Vấn đề ảnh hưởng đến môi trường nuôi chất lượng môi trường nước cấp cho ao nuôi thách thức ổn định bền vững nghề nuôi cá tra Việc giải chất thải nước thải từ ao nuôi cá tra thách thức lớn, đỏi hỏi phải có giải pháp công nghệ kỹ thuật để đảm bảo bền vững môi trường  Vần đề thị trường tiêu thụ cá tra, tương tự với sản phẩm tôm nuôi, chất lượng sản phẩm chế biến đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm đáp ứng yêu cầu truy xuất nguồn gốc nhà nhập đặt việc sản xuất, chế biến, bảo quản xuất sản phẩm cá tra.(Oanh Lê - Nguồn viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II) Hình 2.1: Thu hoạch cá tra ĐBSCL ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.2 Giới thiệu vi khuẩn Edwardsiella spp bệnh gan thận mủ cá tra 2.2.1 Vi khuẩn Edwardsiella spp 2.2.1.1 Phân loại Phân loại khoa học, Edwardsiella thuộc: Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Edwardsiella thường gặp hai loài gây bệnh là: E.tarda E.ictaluri E.tarda tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn cá nước ấm, đặc biệt cá da trơn E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn quan nội tạng gan, thận, tụy cá không vảy, gây bệnh nhiễm trùng đường ruột cá da trơn Mỹ, tác nhân gây bệnh gan thận mủ cá tra Việt Nam Edwardsiella thường gây bệnh động vật máu lạnh: rắn, cá sấu, cá… số động vật thủy sản khác Ở Việt Nam phân lập E.tarda từ cá trê giống; E.ictaluri từ cá tra, cá basa… Bệnh gây thiệt hại ao nuôi cá hương (cỡ từ 4-6cm) đến 5-6 tháng tuổi, xuất cá có kích cỡ 15cm, tỷ lệ tử vong cá từ 60-70%, có trường hợp tới 100% Bệnh xuất nhiều vào mùa xuân, mùa thu ao nuôi mật độ cao, ni cá lồng bè A B Hình 2.2: Vi khuẩn E.ictaluri (hình A) cá tra bị bệnh nhiễm Edwardsiella (hình B) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.2.1.2 Đặc điểm sinh hóa Theo Hawke ctv (1981) Edwardsiella ictaluri, lồi thuộc Enterobacteriacea, Gram âm, hình que, ngắn, kích thước 0.75x1.5-2.5μm Di động yếu 25-300C, khơng di động nhiệt độ cao hơn, catalase dương tính, cytochrome oxidase âm tính lên men glucose (Shott, 1989) Khơng sinh H2S Indole âm tính Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển chậm môi trường BHI (36-48 28-300C) Ở Việt Nam, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh chủ yếu cá tra (ở tất giai đoạn phát triển) Tỷ lệ hao hụt lớn cá tra giống, gây thiệt hại kinh tế lớn giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g ( Thanh Dung ctv., 2004) Theo Ferguson ctv (2001), bệnh ghi nhận xuất ĐBSCL vào cuối năm 1998 có tên BNP (Bacilliaty Necrosis of Pangaius) Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập cá tra nuôi bè Việt Nam, với dấu hiệu có nhiều nốt trắng gan (Thanh Dung ctv., 2005) 2.2.2 Bệnh gan thận mủ cá tra 2.2.2.1 Lịch sử phát Bệnh gan thận mủ cá tra xuất lần vào cuối năm 1998, tác nhân gây bệnh lúc đầu xác định nhóm nghiên cứu trường Đại học Stirling phối hợp với trường Đại học Cần Thơ Bacillus sp (Ferguson ctv., 2001) Đến năm 2002 nhóm nghiên cứu đính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ cá tra vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish ctv., 2002) E ictaluri báo cáo cá nheo Mỹ, Ictalurus punctatus (Hawke, 1979) E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính cá da trơn, hội chứng gọi tắt ESC (Enteric Septicaemia of Catfish) dẫn đến tỉ lệ chết cao cá nheo Mỹ (Austin Austin, 1999) Bệnh tìm thấy nơi nuôi cá nheo nước Mỹ Bệnh xảy tất kích cỡ cá nuôi tập trung giai đoạn cá hương cá giống ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt (USDA/APHIS, 2003) Bệnh xảy theo mùa, đặc biệt xảy thường xuyên nhiệt độ nước nằm khoảng 20 – 29oC (Tucker ctv., 2004) Cá bị bệnh ESC thường giảm ăn, lờ đờ, bơi dạng xoay vòng, xuất huyết xung quanh vùng miệng phần bụng Nhiều vết lở loét nhỏ màu trắng xuất bề mặt da Cá nhiễm bệnh thường Các bệnh thường gặp cá tra giống thịt lồi mắt bụng trương to Bệnh vi khuẩn Bệnh xuất huyết: Aeromonas hydrophila, Clostridium botulinum, Pseudomonas spp., Edwardsiella tarda: mass mortality: 70-80% Edwardsiella ichtaluri gây bệnh gan thận mủ Tỉ lệ chết cao: 80-100% Bệnh ký sinh trùng: Cryptobia spp., Ichthyophthyrius multifiliis, Trichodina, Epistylis - tỉ lệ chết: 15-20% Hình 2.3: Các bệnh thường xuyên xuất cá tra qua giai đoạn nuôi (Lý Thị Thanh Loan ctv., 2007) 2.2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý Xuất vết thương nhỏ da (phía mặt lưng), đường kính khoảng 35mm Những vết thương phát triển thành khối u rỗng bên làm cho da bị sắc tố Cá mắc bệnh chức vận động vây bị rách, gẫy Có thể xuất vết thương bên biểu bì, cơ, ấn vào phát khí có mùi hôi Các vết thương gây hoại tử vùng xung quanh Bệnh xuất ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt chất lượng nước môi trường nuôi xấu, nuôi với mật độ dày Nhiệt độ thích hợp để phát triển khoảng 300C 2.2.2.3 Một số nghiên cứu biện pháp phòng bệnh gan thận mủ Có nhiều nghiên cứu giới lĩnh vực sản xuất vaccine phòng bệnh E ictaluri gây cá da trơn Shoemaker ctv (1999) nghiên cứu ảnh hưởng ba loại vaccine sống cải tiến dạng đông khô (Immuno X+5, Immuno2 X+5, Serial 1A) loại vaccine sống truyền thống (RE-33) Cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) gây miễn dịch phương pháp ngâm ngày tuổi khác (từ ngày tuổi đến 31 ngày tuổi) Kết cho thấy hiệu lực vaccine thể từ cá gây miễn dịch giai đoạn ngày tuổi 10 ngày tuổi Tỉ lệ sống cá ngày tuổi gây miễn dịch dao động khoảng 58,4 – 77,5%, cá 10 ngày tuổi dao động khoảng 64,1 – 78,9% Ba năm sau đó, nhóm tác giả nghiên cứu phương pháp in vivo việc sử dụng loại vaccine sống cải tiến này, gây miễn dịch từ giai đoạn trứng cá nheo Mỹ, phương pháp ngâm thời gian 10 phút Kết cho thấy phương pháp gây miễn dịch hiệu quả, với tỉ lệ bảo hộ khoảng 59,7% (Shoemaker ctv., 2002) Trong năm gần đây, số nhóm nghiên cứu quan tâm đến việc phát triển chế phẩm vi sinh (probiotic) số chế phẩm sinh học khác bổ sung vào thức ăn để phòng bệnh E ictaluri cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) Shelby ctv (2007) bổ sung hai loại chế phẩm vi sinh có chứa Pediococcus sp Enterococcus sp (riêng lẻ phối hợp với nhau) vào thức ăn cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) giống cho ăn vòng 5-8 tuần Sau tiến hành đo tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) thông số miễn dịch protein huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement Các số liệu vi sinh cho thấy hai chủng vi khuẩn probiotic tồn thức ăn sau bổ sung thời gian bảo quản khoảng tuần Tuy nhiên tác giả khơng tìm thấy khác biệt ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt tăng trọng, đáp ứng miễn dịch tính kháng bệnh cá sau thời gian cho ăn thức ăn có bổ sung probiotic Aboagye ctv (2008) thử nghiệm ảnh hưởng chế phẩm vi sinh Lymnozyme đến tỉ lệ sống cá nheo Mỹ sau gây nhiễm thực nghiệm với Edwardsiella ictaluri Kết nghiên cứu cho thấy, nghiệm thức có bổ sung Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục hai tuần, tỉ lệ chết cá sau gây nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm cách có ý nghĩa thống kê (p = 0,002) so với nghiệm thức đối chứng (80%) Các nhà khoa học Nauy Mỹ nghiên cứu hiệu kháng khuẩn hai lọai peptide tổng hợp cecropin B cecropin P1 số chủng vi khuẩn gây bệnh cá, có E ictaluri (Kjuul ctv., 1999) Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cecropin B dao động từ 0,3-1,3 µm Các dẫn xuất cecropin B biết đến có họat tính kháng khuẩn nhiều lồi vi khuẩn gây bệnh, có khả tăng cường tính đề kháng cá nheo Mỹ gây cảm nhiễm với E ictaluri (Kelly ctv., 1993) Prebiotic hợp chất bổ sung vào thức ăn, có tác dụng kích thích sinh trưởng hoạt tính hệ vi khuẩn có lợi diện hệ tiêu hóa vật chủ (Delzenne & Roberfroid, 1994) Prebiotic thường sử dụng kết hợp với probiotic (gọi synbiotic) Các hợp chất đường mạch ngắn sử dụng phổ biến prebiotic bổ sung vào thức ăn thủy sản, số bao gồm: Inulin, fructoseoligosaccharide, transgalacto-oligosaccharide, lactulose (Mahious, 2005), isomaltooligosaccharide (Li ctv., 2009) Hiệu dinh dưỡng sức khỏe số oligosaccharide chứng minh cá (Glencross ctv., 2003; Li & Gatlin, 2005; Pryor ctv., 2003) Isomalto-oligosaccharide nồng độ 0,2% sử dụng kết hợp với vi khuẩn probiotic Bacillus OJ (108 cfu/g thức ăn) bổ sung vào thức ăn cho tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) giúp điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường phản ứng miễn dịch khả đề kháng virus đốm trắng, thông qua ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Đồng thời dựa vào hình 4.9, nhận thấy điều kiện nhiệt độ không ảnh hưởng đến phát triển vi khuẩn mà ảnh hưởng đến khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Tại 250C, 300C 350C, khả đối kháng Bacillus N6.1 với E.ictaluri mạnh có khác biệt ý nghĩa so với giá trị nhiệt độ lại (P < 0,05) Ở nhiệt độ 40oC mật độ vi khuẩn thấp, khả đối kháng với E.ictaluri yếu Kết chứng tỏ chủng Bacillus N6.1 tăng trưởng tốt có khả đối kháng mạnh nuôi điều kiện nhiệt độ từ 30-35oC Mật độ vi khuẩn có ảnh hưởng đến khả đối kháng với vi sinh vật gây bệnh, mật độ vi khuẩn cao khả đối kháng mạnh So với số thử nghiệm định tính, chủng Bacillus spp từ 32 chủng qua sàng lọc từ mẫu đất nước Cần Giờ đem thử nghiệm phát triển nhiệt độ 20-40oC (Nguyễn Đức Quỳnh Như ctv, 2009) Vì vậy, chủng Bacillus N6.1 ứng dụng làm vi sinh vật probiotic nên ni nhiệt độ từ 30-35oC để đạt hiệu cao 4.3.3 Ảnh hưởng nồng độ muối lên tăng trưởng khả đối kháng E.ictaluri Nồng độ muối ảnh hưởng lớn đến tăng trưởng khả đối kháng vi sinh vật có lợi vi sinh vật gây hại gây bệnh Do việc xác định nồng độ muối thích hợp đóng vai trò cần thiết Sau 24 ni cấy 300C, 120 vòng/phút Tại nồng độ muối khác nhau, đem đo OD600nm ghi nhận kết Đồng thời với việc đo OD600nm, tiến hành thu dịch vi khuẩn khảo sát khả đối kháng với E.ictaluri Kết trình bày hình 4.10 55 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Hình 4.10: Ảnh hưởng nồng độ muối lên tăng trưởng khả đối kháng E.ictaluri Bacillus N6.1 Các nghiệm thức với chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Dựa vào hình 4.10, chúng tơi nhận thấy chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả chịu tất nồng độ muối khảo sát Tuy nhiên, nồng độ muối 4% Bacillus N6.1 phát triển mạnh nhất, cho mật độ cao có khác biệt ý nghĩa so với nồng độ muối lại (P < 0,05) Tại nồng độ muối 3%, chủng phát triển mạnh mật độ thấp so với nồng độ muối 4% Ở nồng độ muối 1, 2, 5% 56 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt chủng phát triển mật độ không cao Trong nồng độ muối 0,5% 6% mật độ vi khuẩn thấp Đồng thời dựa vào hình 4.10, nhận thấy nồng độ muối 3, 4, 5%, Bacillus N6.1 khả đối kháng Bacillus N6.1 với E.ictaluri mạnh có khác biệt ý nghĩa so với nồng độ muối lại (P < 0,05) Ở nồng độ muối 0.5, 1, 2, 6% khả đối kháng với E.ictaluri yếu Kết chứng tỏ chủng Bacillus N6.1 phát triển mạnh nồng độ muối môi trường từ - 4% Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn không tương đồng với khả đối kháng vi sinh vật gây bệnh, khả đối kháng nồng độ muối 3% cao Điều nồng độ 3%, Bacillus N6.1 thích nghi có khả tiết số hợp chất ức chế mạnh phát triển E.ictaluri so với nồng độ muối lại Một số thử nghiệm định tính trước đây, chủng Bacillus spp từ 32 chủng qua sàng lọc từ mẫu đất nước Cần Giờ đem thử nghiệm có chủng chịu 8% muối, chủng chịu 10% muối (Nguyễn Đức Quỳnh Như ctv, 2009) Vì vậy, chủng Bacillus N6.1 ứng dụng làm vi sinh vật probiotic nên nuôi nồng độ muối 3- 4% để đạt hiệu cao 4.4 Khảo sát khả chịu pH thấp muối mật Việc thử nghiệm khả chịu pH thấp muối mật đóng vai trò quan trọng trình chọn lọc vi khuẩn probiotic Vì chủng chủ yếu cung cấp cho thể vật chủ qua đường tiêu hóa, chúng khơng chịu pH thấp muối mật dày khả sống sót chúng thấp Khi khơng có hiệu việc phòng bệnh hổ trợ tiêu hóa 4.4.1 Khả chịu đựng acid dày pH thấp tiêu chí lựa chọn cho chủng probiotic (Quwehand ctv 1999, Çakır 2003) Vì để vào ruột non vi sinh vật phải qua điều kiện pH thấp dày (Chou Weimer,1999,Çakır 2003) 57 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Hình 4.11: Khả chịu pH thấp Bacillus N6.1 Dựa vào hình 4.11, chúng tơi nhận thấy pH 2, ban đầu vi khuẩn Bacillus N6.1 có mật độ trung bình 2x107 cfu/ml tương ứng với tỉ lệ sống 100%, sau tiếp xúc với với điều kiện pH thấp tỉ lệ sống giảm xuống 97.9% Nhưng tỉ lệ sống lại tăng lên sau tiếp xúc >100% sau 24 Ở pH 3, tương tự sau tiếp xúc với với điều kiện pH thấp tỉ lệ sống giảm xuống 97.9%, 99.7%, sau lại tỉ lệ sống lại tăng lên Nguyên nhân chủng tăng sinh môi trường DSM tạo thành bào tử, mà bào tử lại có khả sống điều kiện bất lợi môi trường so với dạng tế bào sinh dưỡng Do đó, ban đầu pha thích nghi mật độ vi khuẩn giảm xuống , sau vi khuẩn bắt đầu thích nghi chúng phát triển nên mật độ tăng lên Tuy nhiên điều kiện pH thấp sau 24 tỉ lệ sống Bacillus N6.1 cao pH 4, pH Kết chứng tỏ 58 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt vi khuẩn Bacillus N6.1 chủng làm probiotic bổ sung vào thức ăn cho loài thủy sản, đặc biệt tơm cá chủng có tỉ lệ sống điều kiện pH thấp cao Kết tương đồng với nghiên cứu tồn vi khuẩn probiotic điều kiện acid, có khả chịu acid dày (pH thử nghiệm 3(Audet ctv 1988; Jankowski ctv 1997, Krasaekoopt ctv 2003; Doleyres Lacroix 2004) Theo Prasad, cộng sự, 1998 Khi kiểm tra tất chủng, chủng tồn pH Các chủng tiếp tục thử nghiệm với pH khả chịu đựng 4.4.2 Khả chịu đựng muối mật Hình 4.12: Khả chịu muối mật (Bile salt, India) Bacillus N6.1 Dựa vào hình 4.12, chúng tơi nhận thấy nồng độ muối mật 0.3%, ban đầu mật độ vi khuẩn 2x107 cfu/ml tương ứng với tỉ lệ sống 100%, sau tiếp xúc tỉ 59 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt lệ sống tăng lên tiếp tục tăng cao sau tiếp xúc Nhưng tỉ lệ sống lại bắt đầu giảm sau giờ, giảm mạnh sau 24 Ở nồng độ muối mật 0.5, 1, 2% tương tự Nguyên nhân chủng tạo thành bào tử tăng sinh mơi trường DSM, mà bào tử lại có khả sống điều kiện bất lợi môi trường so với dạng tế bào sinh dưỡng Do đó, chủng vi khuẩn thích nghi chúng phát triển làm mật độ tăng lên, khả sống điều kiện muối mật kém, sau chúng ngừng tăng trưởng bắt đầu vào pha tàn lụi nên mật độ giảm xuống, dẫn đến tỉ lệ sống giảm sau 24 Tuy nhiên nồng độ muối mật sau 24 tỉ lệ sống Bacillus N6.1 cao 0.3% 0.5% thấp nồng độ 2% Kết chứng tỏ vi khuẩn Bacillus N6.1 chủng làm probiotic bổ sung vào thức ăn cho lồi thủy sản, đặc biệt tơm cá chủng có tỉ lệ sống cao điều kiện muối mật sau Theo kết nghiên cứu Prasad ctv, 1998., chủng Bacillus spp phát triển 0,3% muối mật sau Một số nghiên cứu khác cho thấy vi khuẩn probiotic phát triển MRS có bổ sung 0,5% muối mật (Noriega ctv, 2006) Nghiên cứu sử dụng nồng độ muối mật từ 1% - 3% bào tử vi khuẩn tồn tốt so với tế bào sinh dưỡng (Chandramouli ctv, 2004.; Kailasapathy 2005) 60 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 4.5 Khả phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone 4.5.1 Dựng đường chuẩn tương quan nồng độ phân tử tín hiệu quorum sensing (N-hexanoyl homoserine lactone, HHL) đường kính vòng sắc tố violacein Hình 4.13: Đường chuẩn tương quan nồng độ phân tử HHL đường kính vòng tròn sắc tố violacein Dựa vào đường chuẩn mối tương quan nồng độ C6-HHL đường kính vòng sắc tố, ta thiết lập phương trình y = 11,20x + 17,53 để quy đổi từ đường kính vòng tròn violacein sang nồng độ C6-HHL (N-Hexanoyl homoserine lactone) Trong đó: x: ln[HHL] y: đường kính vòng tròn violacein (mm) 61 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 4.5.2 Khả phân hủy phân tử HHL Bacillus N6.1 HHL sử dụng hợp chất thử nghiệm tạo tác nhân gây bệnh Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda Vibrio salmonicida (Swift ctv.,1997; Morohoshi ctv, 2004; Bruhn ctv, 2005) Quá trình bẻ gãy phân tử tín hiệu AHL xúc tác hai lọai enzyme: AHL-acylase AHL-lactonase Hình 4.14: Khả phân hủy phân tử tín hiệu C6- HHL Bacillus N6.1 Dựa vào hình 4.14, chúng tơi nhận thấy nồng độ HHL mẫu giảm dần theo thời gian khảo sát có khác biệt ý nghĩa so với đối chứng (P < 0,05), điều chứng tỏ vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả phân hủy HHL phân hủy HHL xảy khơng hồn tồn sau 24 Nồng độ HHL bắt đầu giảm sau giảm 62 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt nhiều sau 24 giờ, pH đo sau 24 8.08, pH phù hợp không làm ảnh hưởng đến nồng độ C6-HHL môi trường Theo nghiên cứu Defoirdt ctv (2010), Đoàn Thanh Loan ctv (2010), chủng vi khuẩn Bacillus phân lập ni cấy mơi trường có chứa HHL Vi khuẩn nuôi 108 cfu/ml đệm LB20 bổ sung mg HHL/L để xác định khả phân hủy HHL Tất vi khuẩn phân lập như: Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis Bacillus thuringiensis có khả phân hủy HHL vòng 6-9 Nồng độ HHL giảm sau giờ, từ 5mg/l lại 0,7 - 0,9 mg/l gần hoàn toàn Và Bacillus cereus Bacillus thuringiensis có khả phân hủy lactonase enzyme AiiA (Đồng cộng sự, 2002; Lee cộng sự, 2002) phân lập từ tôm thẻ chân trắng 4.6 Khảo sát chất đối kháng Bacillus N6.1 lên phát triển E ictaluri phương pháp nuôi chung (co-culture) Để biết chất đối kháng Bacillus N6.1 E.ictaluri tiến hành khảo sát phần 3.3.6 ghi nhận kết Kết trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2: Khảo sát chất đối kháng Bacillus N6.1 E ictaluri phương pháp nuôi chung Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Phương pháp ni Dịch sau lọc Canh khuẩn Bacillus N6.1 23.7 ± 2.1 Bacillus N6.1 + E ictaluri (nuôi chung) 14.5 ± 1.32 22.3 ± 5.9 Dựa vào bảng 4.2, nhận thấy khả đối kháng Bacillus N6.1 xảy có diện vi sinh vật gây bệnh Ở điều kiện nuôi khác dịch sau lọc xảy đối kháng Bacillus N6.1 nuôi chung với vi khuẩn gây bệnh E.ictaluri Mặt khác, khả đối kháng dịch vi khuẩn có tế bào sinh dưỡng điều kiện ni khác Ở điều kiện nuôi riêng Bacillus N6.1 khả 63 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt đối kháng chủng vi khuẩn với E.ictaluri mạnh hơn, đường kính vòng kháng khuẩn to điều kiện ni chung Nhìn chung, chủng vi khuẩn điều kiện bình thường chúng khơng tiết hợp chất đối kháng, gặp điều kiện bất lợi, có diện vi khuẩn gây bệnh chúng lại tiết hợp chất ức chế vi khuẩn gây bệnh Điều lí giải dịch sau lọc 0.2 µm điều kiện ni riêng lại khơng có khả đối kháng Tuy nhiên, canh khuẩn điều kiện ni có khả đối kháng khơng tương đồng điều kiện nuôi chung, Bacillus N6.1 vừa tiết chất đối kháng chống lại E.ictaluri vừa bị cạnh tranh dinh dưỡng nên không phát triển, mật độ giảm dẫn đến đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ điều kiện nuôi riêng Kết chứng tỏ chất đối kháng Bacillus N6.1 tiết chất đối kháng có diện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Tóm lại, chủng Bacillus N6.1 có khả sinh số enzyme ngoại bào, chủng tăng trưởng đối kháng mạnh nồng độ muối 3-5%, pH từ 7-8 nhiệt độ từ 3035oC Có khả chịu muối mật acid dày, đồng thời có khả phân hủy tính hiệu HHL, tiết chất đối kháng có diện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Vì vậy, chủng chủng tiềm sử dụng làm chế phẩm probiotic phục vụ cho nuôi trồng thủy sản 64 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Theo kết số khảo sát cho thấy vi khuẩn Bacillus N6.1có số đặc tính sau:  Có khả sinh enzyme ngoại bào như: amylase, cellulase, caseinase, gelatinase, khơng có khả sinh enzyme lipase  Tăng trưởng đối kháng mạnh nhiệt độ từ 30-35oC, tốt 30oC Ở nồng độ muối từ 3-4%, pH từ 7-8, tốt pH  Có khả chịu đựng acid dày nồng độ muối mật từ 0.3-2%  Có khả phân hủy tín hiệu HHL sau giờ, nồng độ HHL lại mơi trường giảm mạnh sau 24 khơng phân hủy hồn tồn  Có khả sản xuất chất ức chế phát triển vi khuẩn Edwardsiella ictaluri môi trường tiến hành ni chung khơng có khả hình thành hợp chất điều kiện khơng có diện vi khuẩn gây bệnh 5.2 Đề nghị Để đưa chủng vào ứng dụng thực tế, cần tiến hành thêm số khảo sát sau:  Định danh sinh học phân tử để xác định xác tên lồi  Khả tương thích với chủng khác  Khả bảo hộ cá tra điều kiện in vivo  Một số thông số kỹ thuật lên men chủng chọn làm probiotic 65 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Hạnh, V.T., L.T.B Phượng, L.T Hưng, T.T.H Vân T.T Phong (2004) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm VEM dùng nuôi trồng thủy sản, Tuyển tập Hội thảo tồn quốc NC&ƯD KHCN ni trồng thủy sản Lý Thị Thanh Loan, Đỗ Quang Tiền Vương, Nguyễn Thanh Trúc, Thới Ngọc Bảo, Đặng Ngọc Thùy, Lưu Đức Điền (2007) Quan trắc, cảnh báo môi trường phòng ngừa dịch bệnh số vùng ni thủy sản tỉnh phía nam – năm 2005, Tuyển tập Nghề Cá Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007 Nguyễn Văn Minh (2010) Phân lập sàn lọc số vi khuẩn làm probiotic nuôi trồng thủy sản từ trùng quế(Peryonyx escavatus),luận văn thạc sĩ, Đại học khoa học Tự nhiên, Tp HCM Nguyễn Đức Quỳnh Như, Trần Thị Thanh Thảo, Huỳnh Bái Nhi, Trần Cát Đông, (2009) Phân lập sàng lọc số chủng Bacillus làm probiotic nuôi thủy sản, Bộ KH CN, Tuyển tập hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía nam, tr 444-449 Đặng Thị Hồng Oanh Tình hình kháng thuốc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh Đồng Bằng Sông Cửu Long, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ Nguyễn Thanh Phương (2007) Báo cáo tổng kết đề tài “Quan trắc môi trường xác định tác nhân gây bệnh cá da trơn (Tra – Pangasianodon hypophthalmus Basa – Pangasius bocourti) Tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) tỉnh An Giang” Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, 81 trang Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004).Bệnh học thủy sản, NXB Nông nghiệp Tp HCM Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Vũ Hồng Như Yến (2007) Hổn hợp vi khuẩn phân hủy NACYL Hormoserine Lactone giúp nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá Turbot 66 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt (Scophthalmus maximus L.).Tuyển tập nghề nuôi cá sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007 Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2008) Chuyên đề 3: Các phương pháp xác định chế tác động vi khuẩn Probiotic Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy (2010).Khảo sát điều kiện nuôi cấy phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7, Đại học Đà Nẵng Tài liệu tiếng anh Aboagye, D.L., Daniels, W.H., Terhune, J.S., Arias, C.R (2008) The effect of the probiotic Lymnozyme on survival of channel catfish challenged with Edwardsiella ictaluri Aquaculture America 2008 – Meeting abstract Austin, B & Austin, D.A (1999) Enterobacteriacea representatives In: Bacterial Fish Pathogens: Diseases of Farmed and Wild Fish (ed By B Austin & D.A Austin), 3rd edn, pp 81-84 Springer Praxis Publishing, Chichester Brown, M.R., S.M Barrett, J.K Volkman, S.P Nearhos, J.A Nell, and G.L Allan (1996) Biochemical composition of new yeasts and bacteria evaluated as food for bivalve aquaculture Aquaculture 143:341-360 Crumlish, M., Dung, T.T., Turnbull, J.F., Ngoc, N.T.N., Ferguson, H.W (2002) Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases 25, 733-736 Ferguson, H.W., Turnbull, J.F., Shinn, A., Thompson, K., Dung, T.T., Crumlish, M (2001) Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases 24, 509-513 67 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Glencross, B.D., Boujard, T., Kaushik, S.J (2003) Influence of oligosaccharides on the digestibility of lupin meals when fed to rainbow trout, Oncorhynchus mykiss Aquaculture 219, 703-713 Hawke, J.P (1979) A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish, Ictalurus punctatus Journal of the Fisheries Research Board of Canada 36, 1508-1512 Hai, N.V., R Fotedar, and N Buller 2007 Selection of probiotics by various inhibition test methods for use in the culture of western king prawns, Penaeus latisulcatus (Kishinouye) Aquaculture 272:231-239 Li, J., Tan, B., Mai, K (2009) Dietary probiotic Bacillus OJ and isomaltooligosaccharides influence the intestine microbial populations, immune responses and resistance to white spot syndrome virus in shrimp (Litopenaeus vannamei) Aquaculture 291, 35-40 McClean, K.H., M.K Winson, L Fish, A Taylor, S.R Chhabra, M Camara, M Daykin, J.H Lamb, S Swift, B.W Bycroft, G.S.A.B Stewart, and P Williams 1997 Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of Nacylhomoserine lactones Microbiology 143:3703-3711 Mourad, K., and K Nour-Eddine 2006 In vitro preselection criteria for probiotic Lactobacillus plantarum strains of fermented olives origin International Journal of Probiotics and Prebiotics 1:27-32 Shoemaker, C.A., Klesius, P.H., Evans, J.J (2002) In vovo methods for utilizing the modified live Edwardsiella ictaluri vaccine against enteric septicemia in channel catfish Aquaculture 203, 221-227 Nguyen Thi Ngoc Tinh, Vu Hong Nhu Yen, Kristof Dierckens, Patrick Sorgeloos, Peter Bossier (2008) An acyl homoserine lactone-degrading microbial community improves the survival of first-feeding turbot larvae (Scophthalmus 68 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt maximus L.) Laboratory of Aquaculture & Artemia Reference Center, Ghent University, Rozier 44, 9000 Gent, Belgium Tom Defoirdt, Loan Doan Thanh, Bart Van Delsen, Peter De Schryver, Patrick Sorgeloos ,Nico Boon , Peter Bossier (2010) N-acylhomoserine lactonedegrading Bacillus strains isolated from aquaculture animals Laboratory of Aquaculture and Artemia Reference Center, Ghent University, Rozier 44, 9000 Gent, Belgium Robertson, P.A.W., C O'Dowd, C Burrells, P Williams, and B Austin (2000) Use of Carnobacterium sp as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) Aquaculture 185:235-243 W K.Ding and N.P Shah (2007) Acid, Bile, and Heat Tolerance of Free And Microencapsulated Probiotic Bacteria Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh “mủ gan thận” cá tra nuôi Bến Tre, www.ntu.edu.vn/khoa/nuoitrong/privateres/khoa/nuoitrong/file/sv/2008 http://www.nongnghiep.vinhlong.gov.vn/Default.aspx?tabid=64&categoryid=47&item id=2888 http://www.tongcucthuysan.gov.vn/Portal/NewsDetail.aspx?newsid=8548&lang=vi- 69 ... Bacillus 16 5 khuẩn lạc Một số nghiên cứu khác vi khuẩn probiotic có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh nuôi trồng thủy sản Sàng lọc vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh cách... có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E ictaluri 1. 4 Nội dung nghiên cứu  Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào  Khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng khả đối kháng. .. Trong năm 2 010 , Vi n Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II tiến hành phân lập, tuyển chọn dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra Nguồn vi sinh