BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME XYLANASE VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL TỪ CHỦNG NẤM MỐC TRICHODERMA SPP Ngành: MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : KS ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực : LÊ NGỌC MỸ MSSV: 1191111028 Lớp: 11HSH02 TP Hồ Chí Minh, 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không chép đồ án/khóa luận tốt nghiệp người khác hình thức Đây nghiên cứu hồn tồn riêng tôi, số liệu đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực chưa cơng bố tác giả Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan LỜI CÁM ƠN Trong thời gian thực đồ án tốt nghiệp em áp dụng lý thuyết học vào thực tế thêm kinh nghiệm bổ ích cho cơng việc sau Em xin chân thành cảm ơn : Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM cho phép em làm đồ án tốt nghiệp Viện, cung cấp thiết bị, máy móc đại giúp ích nhiều cho việc thực đồ án Ks Đỗ Thị Tuyến hướng dẫn, giúp đỡ cho em tận tình, giải thích thắc mắc thực đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ tài liệu để em hoàn thành đồ án cách tốt Các thầy cô khoa Môi trường Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ Thuật Công nghệ TP.HCM tận tình dạy dỗ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em năm học vừa qua Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đồng hành, chia sẽ, động viên Các bạn Viện bạn Nguyễn Thị Hoài An giúp đỡ em thực tốt đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME XYLANASE VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL TỪ CHỦNG NẤM MỐC TRICHODERMA SPP Ngành: MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : KS ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực : LÊ NGỌC MỸ MSSV: 1191111028 Lớp: 11HSH02 TP Hồ Chí Minh, 2013 LỜI CAM ĐOAN Tơi sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không chép đồ án/khóa luận tốt nghiệp người khác hình thức Đây nghiên cứu hồn tồn riêng tôi, số liệu đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực chưa cơng bố tác giả Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan LỜI CÁM ƠN Trong thời gian thực đồ án tốt nghiệp em áp dụng lý thuyết học vào thực tế thêm kinh nghiệm bổ ích cho cơng việc sau Em xin chân thành cảm ơn : Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM cho phép em làm đồ án tốt nghiệp Viện, cung cấp thiết bị, máy móc đại giúp ích nhiều cho việc thực đồ án Ks Đỗ Thị Tuyến hướng dẫn, giúp đỡ cho em tận tình, giải thích thắc mắc thực đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ tài liệu để em hoàn thành đồ án cách tốt Các thầy cô khoa Môi trường Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ Thuật Công nghệ TP.HCM tận tình dạy dỗ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em năm học vừa qua Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đồng hành, chia sẽ, động viên Các bạn Viện bạn Nguyễn Thị Hoài An giúp đỡ em thực tốt đồ án tốt nghiệp ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ viii LỜI MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu .3 Nhiệm vụ nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu Kết cấu Đồ án Tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Giới thiệu chung chất xylan, enzyme xylanase .4 1.1.1 Cơ chất xylan 1.1.2 Hệ enzyme xylanase 1.1.3 Hệ xylanase Trichoderma spp 1.1.4 Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan .6 1.2 Giới thiệu chung nấm sợi Trichoderma spp 1.2.1 Phân loại Trichoderma spp 1.2.2 Đặc điểm sinh học Trichoderma spp 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Trichoderma spp 1.2.4 Một số ứng dụng Trichoderma 1.3 Vai trị giống cơng nghệ sản xuất enzyme 1.4 Yêu cầu giống vi sinh vật công nghệ enzyme 10 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5 2013 Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase 11 1.5.1 Bã mía 11 1.5.2 Cám mì 11 1.6 Phƣơng pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase điều kiện nuôi cấy bán rắn .12 1.6.1 Độ ẩm môi trường nuôi cấy 12 1.6.2 Sự thơng khí 13 1.6.3 Nguồn carbon .13 1.6.4 Nguồn nitrogen .13 1.6.5 pH 14 1.6.6 Các nguyên tố khoáng 14 1.7 Phƣơng pháp tách chiết tinh chế phẩm enzyme .15 1.8 Sợ lƣợc sắc ký lọc gel .16 1.8.1 Bản chất phương pháp 16 1.8.2 Đặc tính gel .17 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 2.1 Nguyên liệu 18 2.2 Hóa chất thiết bị 18 2.2.1 Hóa chất 18 2.2.2 Thiết bị 18 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzyme xylanase từ nấm mốc Trichoderma spp .19 2.3.1 Phương pháp mơ tả hình thái Trichoderma 19 2.3.2 Xác định số lượng bào tử nấm mốc buồng đếm hồng cầu 19 2.3.3 Phương pháp đo đường vành khuyên phân giải 20 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 2.3.4 Quy trình khảo sát số yếu tố 21 2.3.5 Thuyết minh quy trình .22 2.4 Bố trí thí nghiệm 24 2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase 24 2.4.2 Khảo sát tác nhân tủa enzyme xylanase 26 2.4.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase 30 2.5 Phƣơng pháp xác định tiêu nghiên cứu xử lí kết 34 2.5.1 Phương pháp xác định tiêu nghiên cứu 34 2.5.2 Xử lý số liệu 37 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 38 3.1 Quan sát hình thái Trichoderma spp môi trƣờng PGA .38 3.1.1 Quan sát đại thể 38 3.1.2 Quan sát vi thể 39 3.2 Định tính enzyme xylanase Trichoderma spp 40 3.3 Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp .41 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase Trichoderma spp .41 Khảo sát dung môi tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase .51 3.5.1 3.5.2 Khảo sát trình tinh enzyme xylanase từ dịch chiết phương pháp kết tủa 53 3.5.3 3.6 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme xylanase 58 Tinh enzyme xyalanse phƣơng pháp chạy sắc ký lọc gel 60 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 4.1 Kết luận 62 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 4.2 Đề nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC A PHỤ LỤC B PHỤ LỤC C iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Bảng 3.12 So sánh kết tủa enzyme xylanase Tác nhân HT enzyme HL protein cao HLR cao tủa cao (UI/g) (mg) (UI/mg) Cồn 317,4 52,50 6,05 Acetone 427,6 66,08 6,47 Muối 513,8 67,44 7,618 Hoạt tính enzyme (UI/g) HT enzyme Cồn Acetone Muối Tác nhân tủa Đồ thị 3.12 Kết tủa enzyme xylanase từ tác nhân tủa Sau tiến hành tủa enzyme với dung môi khác cho đƣợc kết sử dụng dung dịch muối (NH4)2SO4 bão hòa thu đƣợc enzyme có hoạt tính cao nên định chọn muối tác nhân tủa cho thí nghiệm 57 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 3.5.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme xylanase Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng pH đến chế phẩm enzyme xylanase Bảng 3.13 Kết ảnh hƣởng pH đến chế phẩm enzyme xylanase pH Hoạt tính enzyme (UI/g) 208,13 308,03 238,09 117,54 134,87 350 Hoạt tính enzyme (UI/g) 300 250 200 150 HT enzyme 100 50 pH pH pH pH pH pH Đồ thị 3.13 Biểu diễn hoạt tính xylanase theo pH chế phẩm enzyme xylanase Enzyme nhạy với pH môi trƣờng pH môi trƣờng thƣờng ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa chất enzyme đặc biệt ảnh hƣởng đến độ bền enzyme Chính thế, pH có ảnh hƣởng mạnh đến phản ứng enzyme Mỗi enzyme thích hợp với vùng pH định, qua thí nghiệm chúng tơi nhận thấy 58 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 hoạt tính enzyme xylanase pH 208,13 UI/g, tăng dần lên cao 308,03 UI/g pH Càng tăng độ pH lên pH 5, 6, hàm lƣợng enzyme giảm dần xuống 117,54 UI/g Từ bảng 3.13 đồ thị 3.12 kết luận pH tối ƣu cho hoạt động chế phẩm enzyme Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến chế phẩm enzyme xylanase Bảng 3.14 Kết ảnh hƣởng nhiệt độ đến chế phẩm enzyme xylanase Hoạt tính enzyme Nhiệt độ (UI/g) 30 158,18 40 377,4 50 421,3 60 407,93 70 374,63 450 Hoạt tính enzyme (UI/g) 400 350 300 250 200 HT enzyme 150 100 50 30o 40o 50o 60o 70o Nhiệt độ Đồ thị 3.14 Biểu diễn hoạt tính xylanase theo nhiệt độ chế phẩm enzyme xylanase 59 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Nhiệt độ yếu tố vật lý có ảnh hƣởng lớn đến phản ứng enzyme, chúng liên quan đến khả kết hợp enzyme chất, nâng cao lực enzyme chất Nhiệt độ enzyme khơng cố định mà thay đổi tùy theo chất, tốc độ phản ứng lúc tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Thơng thƣờng nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng nhƣng với ngƣỡng tới hạn, vƣợt ngƣỡng tốc độ phản ứng enzyme giảm Từ kết cho thấy nhiệt độ 30oC hoạt tính enzyme thấp (158,18 UI/g) tăng nhiệt độ lên 50oC hoạt tính enzyme tăng cao (421,3 UI/g) tăng nhiệt độ lên 60oC 70oC hoạt tính enzyme có xu hƣớng giảm từ từ cịn 407,93 374,63 Từ kết kết luận nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động chế phẩm 50oC 3.6 Tinh enzyme xyalanse phƣơng pháp chạy sắc ký lọc gel Sau tiến hành chiết xuất enzyme dung môi nhƣ nƣớc cất, đệm acetate pH5, NaCl tủa enzyme tác nhân nhƣ cồn, muối, acetone, ta thu đƣợc kết chiết xuất enzyme nƣớc cất tủa enzyme muối cho hoạt tính enzyme cao nên ta chọn tác nhân để thu enzyme tủa tỷ lệ độ hịa tan muối 65% Q trình tinh đƣợc thực gel Biogel P-100 hàng Bio – Rad, Mỹ Sau ly trích enzyme muối (NH4)2SO4 ta thu đƣợc dịch chiết enzyme, tiến hành chạy sắc ký để tinh sản phẩm Trƣớc chạy sắc ký ta tiến hành loại muối màng thẩm tích Màng cho muối (NH4)2SO4 qua protein đƣợc giữ lại, ta thu mẫu tiến hành chạy sắc ký Sau chạy sắc ký ta thu đƣợc peak Sau tiến hành xác định hoạt tính xylanase hàm lƣợng protein peak 60 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -0.1 10 20 30 40 50 60 Đồ thị 3.15 Sắc ký đồ excel chạy sắc ký enzyme xylanase Bảng 3.15 Hiệu suất tinh Nghiệm thức Trƣớc sắc ký Σ HT Σ HL Hoạt tính riêng Độ tinh (lần) Hiệu suất (%) 544,0 340 1,6 100 Sau sắc ký 371,5 13,9 26,7 16,7 68,3 Ta thấy enzyme sau tinh có hoạt tính hàm lƣợng protein thấp so với tổng hoạt tính enzyme hàm lƣợng protein trƣớc tinh Điều xảy thao tác, tủa, ly tâm…trong trình tinh làm thất enzyme Tuy nhiên hoạt tính riêng lại cao nhiêu lần, hiệu suất tinh cao 61 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Giá trị Hàm lƣợng Hoạt tính xylanase tối ƣu Protein (mg/g) (UI/g) Tỉ lệ CM:BM 4:6 35,47 139,48 Độ ẩm (%) 55% 39,73 149,68 pH 5.5 41,60 150,74 Nổng độ dinh dƣỡng x4 42,40 170,80 Thời gian nuôi cấy 48h 46,93 199,72 Tỷ lệ giống 4.48x1011 49,87 212,39 Các yếu tố Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ sử dụng dung môi để tách chiết enzyme xylanase cho kết sử dụng nƣớc cất để tách chiết enzyme cho hoạt tính enzyme (176,77 UI/g) hàm lƣợng protein (68,8 mg/g) với tỷ lệ tách 1:5 cao Khảo sát trình tinh enzyme xylanase từ dịch chiết thô phƣơng pháp tủa cho kết dùng tác nhân tủa muối ammonisulfate cho hoạt tính enzyme (513,8 UI/g) hàm lƣợng protein (67,44 mg/g) với nồng độ 65% cao Khảo sát ảnh hƣởng pH đến chế phẩm enzyme xylanase cho kết với pH cho hoạt tính enzyme (308,03 UI/g) cao Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm enzyme xylanase cho chúng tơi kết với nhiệt độ phản ứng enzyme chất ứng với 50oC cho hoạt tính enzyme (421,3 UI/g) cao Hiệu suất độ tinh enzyme xylanase sau tiến hành chạy sắc ký lọc gel là: Hoạt tính riêng Độ tinh (lần) Hiệu suất (%) 26,7 16,7 68,3 62 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 4.2 Đề nghị - Thực phƣơng pháp tối ƣu hóa mơi trƣờng thực nghiệm - Tiếp tục thực phƣơng pháp sắc ký lọc gel với enzyme xylanase đƣợc tủa cồn acetone - Thực phƣơng pháp chạy điện di gel SDS để xác định trọng lƣợng phân tử protein 63 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Phạm Thị Trân Châu PGS TS Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học, tập Enzyme ứng dụng, Nxb Giáo dục [2] Nguyễn Lân Dũng tác giả (1979), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [3] Nguyễn Đức Lƣợng (2000), Công nghệ vi sinh vật tập – Cơ sở vi sinh vật học công nghiệp, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh [4] Nguyễn Thị Uyên Thảo (2007), Nghiên cứu tạo chế phẩm xylanase từ vi nấm Trichoderma, Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, trƣờng Đại Học Khoa học tự nhiên TP.HCM [5] Lê Ngọc Tú cộng (1982), Enzyme vi sinh vật, tập 2, Nxb Khoa Học Kỹ thuật, Hà Nội, trang 124 – 185 [6] Nguyễn Đức Lƣợng, Công nghệ enzyme protein, NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM, 2004 [7] Lê Tú Ngọc tác giả, Hóa sinh công nghiệp, NXB KH & KT Hà Nội [8] Nguyễn Thị Thu Thảo, Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ Trichoderma spp tạo chế phẩm bóc vỏ tiêu đen sản xuất tiêu tr ng, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học Trƣờng Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM [9] Trần Linh Thƣớc, Tài liệu thực tập chuyên đề cao học chuyên ngành vi sinh hóa X, XI, trƣờng Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM Tài liệu Tiếng Anh [11] Bastawde K B (1998), “Xylanase structure, microbial xylanase, and their mode of action”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 8, pp 353 – 368 [12] Collins T, Charles Gerday., Georges Feller (2004), “Xylanase, Xylanase families and extremophilic xylanase”, Periodical 29, p3 – 23 64 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 [13] Esposito E., Silva M D., (1998), “Systematics and environmental application of the genus Trichoderma” Crical reviews in Microbiology, 24 (2), pp 89 – 98 [14] Ridder E R., Nokes S E., Knutson B L., (1999), “Optimization of solid – state fermentation parametersfor the production of xylanase bt Trichoderma longibrachiatum on wheat bran in a forced aeration system”, Transactions of The ASABE Vol 42(6): 1785 – 1790, Published by the American Society of Agricultural and Biological Engineers, St Joseph, Michigan [15] Shallom D, Shoham Y (2003), “Microbial hemicellulase”, Current Opinion Microbiol., (3), pp 219 – 228 Tài liệu Internet [16] http://www.biopract.de/html/prod_e_enzyme2.htm [17] www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC [18] http://www.vusta.vn/Temps/Home/template2/?nid=7345 [19] http://www.enzymes.co.uk/answer24.pectinase.htm [20] http://www.doctorfungus.org/thefungi/trichoderma.htm [21].http://vinhphucdost.gov.vn/index.php?mode=14&id=26337&strContent=29&st rShow=410 65 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC A Phụ lục A1: Đƣờng chuẩn Bardford BRADFORD y = 0.0034x + 0.0067 R² = 0.9974 0.25 0.2 OD 0.15 0.1 0.05 0 10 20 30 40 NỒNG ĐỘ Phụ lục A2: Đƣờng chuẩn xylose 50 60 70 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC B Hình B1: Nấm mốc hình thành bào tử mơi trƣờng lúa Hình B2 Nấm mốc mơi trƣờng cám mì : bã mía 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình B3 Chế phẩm enzyme thơ Hình B4 Nấm mốc mơi trƣờng thạch nghiêng 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC C Hình C1 Máy khuấy Hình C2 Cân phân tích Hình C3 Kính hiển vi 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình C4 Máy Vortex Hình C5 Tủ hút Hình C6 Microwave Hình C7 Máy đo quang phổ Hình C8 Tủ ủ 2013 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình C9 Autoclave 2013 ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME XYLANASE VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL TỪ CHỦNG NẤM MỐC TRICHODERMA SPP Ngành:... Từ lý xây dựng đề tài: ? ?Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme xylanase tinh sắc ký lọc gel từ nấm mốc Trichoderma spp. ” Mục đích nghiên cứu Tìm mơi trƣờng tốt để chủng nấm. .. nấm mốc Trichoderma spp thực tối ƣu hóa mơi trƣờng Tinh enzyme xylanase đƣợc thu nhận từ nấm mốc Trichoderma spp Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát thành phần môi trƣờng cảm ứng để chủng nấm mốc Trichoderma