BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ÂU THỊ HẠNH TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ BACTERIOCIN CNAZU10 VÀ RUAZU12 TỪ CLOSTRIDIUM NEXILE VÀ RUMINOCOCCUS SP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ÂU THỊ HẠNH TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ BACTERIOCIN CNAZU10 VÀ RUAZU12 TỪ CLOSTRIDIUM NEXILE VÀ RUMINOCOCCUS SP LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 67/QĐ – ĐHNT ngày 24/01/2017 Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: 16/05/2018 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN DUY PGS.TS PHAN THỊ PHƢỢNG TRANG Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Ngơ Đăng Nghĩa Phòng đào tạo sau đại học: KHÁNH HÒA – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Tạo dòng, biểu tinh chế bacteriocin Cnazu10 Ruazu12 từ Clostridium nexile Ruminococcus sp.” đƣợc trình bày luận văn hoàn toàn trung thực, khách quan Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn đƣợc cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn xác đƣợc rõ nguồn gốc Khánh Hòa, ngày 20 tháng 04 năm 2018 Tác giả luận văn Âu Thị Hạnh i LỜI CẢM ƠN Lời tri ân xin gửi đến Quý Thầy Cô Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng Khoa Sau đại học - Trƣờng Đại học Nha Trang truyền đạt, dạy bảo kiến thức quý báu nhƣ tạo điều kiện cho tơi hồn thành chƣơng trình đào tạo Thạc sĩ Tơi xin gửi lời cám ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Văn Duy, Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang PGS.TS Phan Thị Phƣợng Trang, Trung tâm Khoa học Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh ln hƣớng dẫn, định hƣớng truyền đạt cho kinh nghiệm nghiên cứu vô quý báu nhƣ kinh nghiệm sống hữu ích Đồng thời, Thầy Cô hỗ trợ trình học tập, nghiên cứu, nhƣ tạo điều kiện cho tơi phát huy tốt lực Tơi xin cảm ơn Thầy Cơ tất thành tơi đạt đƣợc ngày hơm Tơi xin cảm ơn em Trí, Phƣơng, Tƣơm, Duyên, Diệu làm việc Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh ngƣời ln bên cạnh giúp đỡ, hỗ trợ tơi hồn thành tốt luận văn Tôi biết ơn gia đình, bạn bè đóng góp cơng sức, động viên tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 20 tháng 04 năm 2018 Tác giả luận văn Âu Thị Hạnh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .ix LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bacteriocin 1.1.1 Khái niệm bacteriocin .4 1.1.2 Phân loại bacteriocin 1.1.3 Cơ chế hoạt động bacteriocin 1.2 Một số bacteriocin có hoạt tính kháng ung thƣ 1.2.1 Azurin 1.2.2 Các bacteriocin có hoạt tính kháng ung thƣ khác 1.3 Tình hình nghiên cứu tuyển chọn bacteriocin có tiềm kháng ung thƣ 10 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 10 1.3.2 Tình hình nghiên cứu bacteriocin Việt Nam 11 1.4 Giới thiệu peptide kháng ung thƣ tiềm từ Clostridium nexile Ruminococcus sp 12 1.5 Kỹ thuật tạo dòng, biểu tinh chế protein 14 1.5.1 Khái niệm tạo dòng 14 1.5.2 Vector chủng chủ 15 1.5.3 Một số enzyme dùng tạo dòng 16 1.5.4 Kỹ thuật tạo dòng biểu protein mục tiêu vi khuẩn Escherichia coli .19 1.5.5 Tinh chế protein 21 1.6 Hệ thống biểu protein dung hợp đuôi Histidine .21 1.6.1 Đuôi Histidine .21 1.6.2 Hệ thống vector pET-42a(+) .22 iii 1.6.3 Hệ thống tế bào chủ E coli BL21 .23 1.7 Chất cảm ứng IPTG 214 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu 25 2.1.1 Chủng vi sinh vật 25 2.1.2 Plasmid 25 2.1.3 Enzyme 26 2.1.4 Mồi .26 2.1.5 Thang DNA protein chuẩn 27 2.1.6 Hóa chất sinh học phân tử 27 2.1.7 Thiết bị chuyên dụng 28 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 29 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.3.1 PCR (Polymerase chain reaction) 30 2.3.2 Điện di DNA gel agarose .31 2.3.3 Tạo plasmid tái tổ hợp pCnazu10 pRuazu12 biểu E coli .32 2.3.3.1.Thu nhận gen p2seq08 p3seq02 phƣơng pháp PCR 32 2.3.3.2 Thực phản ứng cắt plasmid pET-42a(+) gen p2seq08, p3seq02 33 2.3.3.3 Tạo vector tái tổ hợp pET-42a(+) mang gen p2seq08 p3seq02 34 2.3.4 Tạo chủng E coli chứa plasmid pCnazu10 pRuazu12 34 2.3.5 Điện di protein SDS-PAGE 36 2.3.6 Khảo sát điều kiện nuôi cấy ảnh hƣởng đến mức độ biểu protein tái tổ hợp 37 2.3.6.1 Khảo sát nồng độ IPTG 37 2.3.6.2 Khảo sát nhiệt độ 37 2.3.7 Tinh chế protein Cnazu10 Ruazu12 chứa đuôi His 38 2.3.7.1 Nuôi cấy cảm ứng biểu protein mục tiêu .38 2.3.7.2 Tinh chế protein mục tiêu phƣơng pháp sắc ký lực 39 2.3.8 Phƣơng pháp cắt protein dung hợp 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Tạo plasmid tái tổ hợp pCnazu10 pRuazu12 biểu E coli 41 iv 3.1.1 Thu nhận gene p2seq08, p3seq02 phƣơng pháp PCR 41 3.1.2 Tạo plasmid tái tổ hợp pET-42a(+) mang gene p2seq08, p3seq02 biến nạp vào E coli OmniMax 41 3.2.Tạo chủng E coli mang plasmid tái tổ hợp kiểm tra khả biểu protein tái tổ hợp 50 3.2.1 Tạo chủng E coli BL21 (DE3) mang plasmid pCnazu10 pRuazu12 50 3.2.2 Kiểm tra khả biểu protein tái tổ hợp 51 3.2.2.1 Khảo sát nồng độ IPTG 51 3.2.2.2 Khảo sát nhiệt độ cảm ứng .53 3.3 Tinh chế protein Ruazu12 dung hợp chứa đuôi His thu nhận protein Ruazu12 .55 3.3.1.Tinh chế protein Ruazu12 dung hợp chứa đuôi His .55 3.3.2 Kết cắt loại đuôi dung hợp thu nhận protein Ruazu12 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .59 Kết luận 59 Kiến nghị .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Stt Chữ viết tắt bp DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid L PCR Ghi Cặp bazơ Base pair lít Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 6xHis HexaHistidine dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KDa Kilo Dalton 10 Kan Kanamycin 11 LB Môi trƣờng Luria – Bertani 12 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 13 SDS - PAGE Sodium Dodecyl Sulphate – Điện di Polyacrylamide Gel Electrophoresis polyacrylamide với SDS 14 TEMED Tetramethylethylenediamine 15 TAE Tris – Acetate –EDTA 16 MCS Multiple Cloning site 17 EBW Equilibrate – Binding – Wash buffer 18 PMSF Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Trình tự gen, amino acid kích thƣớc Cnazu10 Ruazu12 14 Bảng 1.2 Các trình tự nhận biết vị trí cắt enzyme giới hạn đƣợc chọn lọc 17 Bảng 2.1 Trình tự mồi đƣợc sử dụng .26 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR thu gen 32 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn .33 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nối 34 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc 35 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt protein dung hợp Ruazu12 40 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ gen p2seq08 p3seq02 .42 Bảng 3.2 Kết đo nồng độ mức độ tinh plasmid tái tổ hợp 47 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc nisin Hình 1.2 Cơ chế hoạt động bacteriocin Hình 1.3 Bacteriocin Cnazu10 từ Clostridium nexile (A) Ruazu12 từ Ruminococcus sp.(B) .13 Hình 1.4 Sơ đồ quy trình tạo dòng 20 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc plasmid pET-42a(+) 25 Hình 2.2 Thang DNA (A) thang protein (B) 27 Hình 2.3 Sơ đồ chƣơng trình chạy PCR .30 Hình 3.1 Kết PCR thu gen 41 Hình 3.2 Sơ đồ plasmid tái tổ hợp pCnazu10 mang gen p2seq08 43 Hình 3.3 Sơ đồ plasmid tái tổ hợp pRuazu12 mang gen p3seq02 43 Hình 3.4 Kết biến nạp sản phẩm nối pCnazu10 vào E.coli OmniMAX .44 Hình 3.5 Kết biến nạp sản phẩm nối pRuazu12 vào E.coli OmniMAX .44 Hình 3.6 Kết PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pCnazu10 45 Hình 3.7 Kết PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pRuazu12 46 Hình 3.8 Kết giải trình tự gen p2seq08 48 Hình 3.9 Kết giải trình tự gen p3seq02 49 Hình 3.10 Kết biến nạp plasmid pCnazu10 vào E coli BL21 (DE3) 50 Hình 3.11 Kết biến nạp plasmid pRuazu12 vào E coli BL21 (DE3) 50 Hình 3.12 Kết khảo sát ảnh hƣởng nồng độ IPTG lên biểu protein Cnazu10 chủng E.coli BL21 (DE3) 51 Hình 3.13 Kết khảo sát ảnh hƣởng nồng độ IPTG lên biểu protein Ruazu12 chủng E.coli BL21(DE3) 52 Hình 3.14 Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy lên tính tan protein Cnazu10 53 Hình 3.15 Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy lên mức độ biểu Ruazu12 54 Hình 3.16 Kết tinh chế protein dung hợp Ruazu12 56 Hình 3.17 Kết cắt loại dung hợp thu nhận protein Ruazu12 57 viii Sự tinh protein quan trọng từ protein tinh xác định đƣợc trình tự acid amin, mối liên hệ tiến hóa protein cá thể khác khảo sát chức sinh hóa protein Hình 3.16 Kết tinh chế protein dung hợp Ruazu12 M: Thang chuẩn protein; (-): Mẫu chứng âm; BC: Phân đoạn trƣớc cột; AC: Phân đoạn sau cột, W5, W10: phân đoạn rửa cột 20…250: phân đoạn dung ly với nồng độ imidazole từ 20 mM đến 250 mM 3.3.2 Kết cắt loại đuôi dung hợp thu nhận protein Ruazu12 Dịch sau cắt loại đuôi dung hợp đƣợc thẩm tách để loại bỏ EDTA, DTT, sau cho qua cột Histrap thu phân đoạn sau cột Kết đƣợc thể nhƣ hình 3.17 Kết từ hình 3.17 cho thấy, TEV protease sử dụng phản ứng cắt có hoạt tính tốt thơng qua kết phân cắt protein LysSN-LLO Protein LysSN-LLO đƣợc cung cấp Trung tâm Công nghệ Sinh học – Đại học Khoa học tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh protein chất có chứa trình tự nhận biết TEV dùng để 56 kiểm tra hoạt tính TEV Ở phân đoạn trƣớc cắt LysSN-LLO có kích thƣớc khoảng 76 kDa phân đoạn sau cắt protein cho vạch (LLO) 57 kDa 19 kDa (LysSN) Đối với protein dung hợp Ruazu12, ta nhận thấy vạch mục tiêu có kích thƣớc 36 kDa hầu nhƣ không thay đổi lƣợng protein diện phân đoạn trƣớc cắt sau cắt, đồng thời phân đoạn thu đƣợc sau qua cột Histrap khơng có xuất vạch protein Đồng thời phân đoạn rửa cột (W) lại xuất vạch có kích thƣớc 36 kDa Từ kết cho thấy, TEV protease không cắt đƣợc protein dung hợp mục tiêu Điều vùng cắt protein dung hợp bị cuộn gấp vào bên trong, TEV protease khơng nhận diện đƣợc nên khơng cắt thành cơng Hình 3.17 Kết cắt loại đuôi dung hợp thu nhận protein Ruazu12 LysSN-LLO: protein để xác nhận hoạt tính TEV 57 BC: trƣớc cắt, AC: sau cắt; W: rửa cột Nhƣ vậy, thu nhận đƣợc lƣợng nhỏ protein Ruazu12 dạng dung hợp chƣa cắt rời Ruazu12 để tách Ruazu12 khỏi protein dung hợp Khảo sát việc biểu protein màng Cnazu10 Ruazu12 hệ thống biểu pET- 42a(+) E coli không hiệu Cần phải thay đổi hệ thống biểu chủng chủ cho nghiên cứu nhóm 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Các kết đạt đƣợc đề tài luận văn bao gồm: - Tạo dòng thành cơng vector pCnazu10 pRuazu12 cho phép biểu protein mục tiêu Cnazu10 Ruazu12 từ Clostridium nexile Ruminococcus sp chủng E coli OmniMAX - Biểu thành công protein E coli BL21 (DE3) - Điều kiện nuôi cấy cảm ứng biểu protein mục tiêu nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ƣu 0,5 mM Cnazu10 0,01 mM Ruazu12 Protein Cnazu10 biểu đa số dạng tủa Trong protein Ruazu12 biểu dạng tan dạng tan nhiệt độ 23oC - Tinh chế đƣợc lƣợng nhỏ protein Ruazu12 dạng dung hợp - Chƣa cắt đƣợc protein Ruazu12 khỏi protein dung hợp Kiến nghị Trên sở kết thu nhận đƣợc, để nghiên cứu đến kết hoàn thiện hơn, đề tài kiến nghị tiến hành thêm bƣớc thí nghiệm tiếp theo: - Nghiên cứu biểu protein Cnazu10 dạng tan tiến hành tinh chế protein - Nghiên cứu hồn thiện quy trình tinh chế protein Ruazu12, bao gồm quy trình cắt loại bỏ đuôi dung hợp - Khảo sát biểu tinh chế protein hệ thống biểu tế bào chủ khác - Thử hoạt tính kháng ung thƣ protein Ruazu12 tái tổ hợp thu đƣợc dòng tế bào ung thƣ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thị Hồng Tuyết, 2004, Nghiên cứu bcateriocin sản xuất Lactobacillus acidophilus NrrlB – 2092, Luận văn thạc sĩ Sinh học, ĐHQG TpHCM Nguyễn Hữu Duyên, 2017, Tạo kháng thể kháng Hemolysin E Salmonella Typhi đƣợc biểu E coli BL21 (DE3) Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Di truyền học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2000, Giáo trình vi sinh vật học, Nhà xuất Hà Nội Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy, 2002, Nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacterioxin lồi Lactobacillus plantarum L24 Tạp chí Di truyền học Ứng dụng Nguyễn Thị Thanh Trà, 2016, Tuyển chọn bacteriocin kháng ung thƣ tiềm từ hệ vi sinh vật đƣờng ruột ngƣời kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ ngành Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Nha Trang Trần Linh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo, 2010, Giáo trình thực tập kỹ thuật thao tác gen, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh Alzari, P.M, Souchon, H and Dominguez, R 1996, The crystal structure of endoglucanase CelA, a family glycosyl hydrolase from Clostridium thermocellum, Structure (London, England: 1993), 4(3), 265–275 Bang, MH, Van, RT, Thinh, NT, Song, LH, Dung, TT, Van, TL, Van, DL, Ky, TD, Pan, D, Shaheen, M & Ghoneum, M 2010, Arabinoxylan rice bran (MGN-3) enhances the effects of interventional therapies for the treatment of hepatocellular 60 carcinoma: a three-year randomized clinical trial Anticancer Res 30(12):514551 Bayer, E.A, Belaich, J-P, Shoham, Y and Lamed, R 2004, The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides, Annual review of microbiology, 58, 521–554 10 Broadbent JR, Chou YC, Gillies K and Kondo JK 1989, Ninsin inhitbits several gram – positive, mastitis–causing pathogens, J.Dairy Sci, 1989, Dec;72(12) :3342-5 11 Choi, J, Lee, M, Cho, Y, Park, B, Kim, S and Kim, G 2011, The bacterial protein azurin enhances sensitivity of oral squamous carcinoma cells to anticancer drugs, Yonsei Med J 52:773-778 12 Cotter, P.D., Hill, C., Ross, R.P 2005 Bacteriocins: Developing innate immunity for food Nat Rev Microbiol, 3, 777-788 13 Desriac F, Defer D, Bourgougnon N, Brillet B, Le Chevalier P, Fleury Y, 2010 “Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated Bacteria Warfare: Inventory and Potential Applications as an Aquaculture Probiotic” Marine Drugs 2010 , , 1153-1177, DOI 10.3390/md8041153 14 Eldor, R, Arbit, E, Corcos, A & Kidron, M 2013, Glucosereducing effect of the ORMD-0801 oral insulin preparation in patients with uncontrolled type diabetes: a pilot study, PLoS One 8:e59524 15 Eveleigh, D.E, Mandels, M, Andreotti, R and Roche, C 2009, Measurement of saccharifying cellulase, Biotechnology for Biofuels, 2, 21 16 Fialho, AM, Bernardes, N & Chakrabarty, AM 2012, Recent patents on live bacteria and their products as potential anticancer agents, Recent Patents on AntiCancer Drug Discovery 7:31-55 17 Fontes, C.M.G.A and Gilbert, H.J 2010, Cellulosomes: highly efficient nanomachines designed to deconstruct plant cell wall complex carbohydrates, Annual review of biochemistry, 79, 655–681 18 Grandis, V, Bizzarri, AR & Cannistraro, S 2007, Docking study and free energy simulation of the complex between p53 DNA-binding domain and azurin, J Mol Recognit 20:215-226 61 19 Green, M.R and Sambrook, J 2012, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (NY) 20 Heschard, Y & Sahl, HG 2002, Review Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Gram-positive bacteria Biochemistry, 84 (5-6), pp 545-557 21 Jia, L, Gorman, GS, Coward, LU, Noker, PE, Mccormick, D, Horn, TL, Harder, JB & Muzzio, M 2011, Preclinical pharmacokinetics, metabolism, and toxicity of azurin-p28 (NSC745104) a peptit inhibitor of p53 ubiquitination Cancer Chemoth Pharm 28:513-524 22 Joo, NE, Ritchie, K, Kamarajan, P, Miao, D & Kapila, YL 2012, Nisin, an apoptogenic bacteriocin and food preservative, attenuates HNSCC tumorigensis via CHAC1, Cancer Med 1(3):295-305 23 Kanno, S, Maeda, N, Tomizawa, A, Yomogida, S, Katoh, T & Ishikawa, M 2012, The potent histone deacetylase inhibitor spiruchostatin B towards susceptible NALM-6 human B cell leukemia cells, Int J Oncol 40:1391-1396 24 Le, MH, Do, TT, Hoang, TH, Chau, VM & Nguyen, TD 2012, Toxicity and anticancer effects of an extract from Selaginella tamariscina on a mice model Nat Prod Res 26(12):1130-4 25 Lee, C, Wu, C & Shiau, A 2005a, Systemic administration of attenuated Salmonella choleraesuis survival in the murine melanoma model Cancer Gen Ther 12:175-184 26 Lee, DG, Hahm, K, Park, Y, Kim, H, Lee, W, Lim, S, Seo, Y & Choi, C 2005b, Functional and structural characteristics of anticancer peptit Pep27 analogues, Cancer Cell Int 14:1-14 27 Ly, TU, Tran, NQ, Hoang, TK, Phan, KN, Truong, HN & Nguyen, CK, 2013, Pegylated dendrimer and its effect in fluorouracil loading and release for enhancing antitumor activity J Biomed Nanotechnol 9(2):213-20 28 Nam, NH, Huong, TL, Dung, DT, Dung, PT, Oanh, DT, Park, SH, Kim, K, Han, BW, Yun, J, Kang, JS, Kim, Y & Han, SB 2013, Synthesis, bioevaluation and docking study of 5-substitutedphenyl-1,3,4-thiadiazole-based hydroxamic acids as histone deacetylase inhibitors and antitumor agents J Enzyme Inhib Med Chem 29(5):611-8 62 29 Nguyen C, Nguyen VD, 2016, Discovery of azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microbiome through homology modeling and molecular docking against the tumor suppressor p53 Biomed Research International 2016: 8490482 30 Nguyen, HT, Chau, VM, Tran, TH, Phan, VK, Hoang, TH, Nguyen, TD, Nguyen, XN, Tai, BH, Hyun, JH, Kang, HK & Kim, YH, 2009, C29 sterols with a cyclopropane ring at C-25 and 26 from the Vietnamese marine sponge Ianthella sp and their anticancer properties Bioorg Med Chem Lett 19(16):4584-8 31 Nguyen, HX, Nguyen, MT, Nguyen, TA, Nguyen, NY, Phan, DA, Thi, PH, Nguyen, TH, Dang, PH, Nguyen, NT, Ueda, JY & Awale, S 2013, Cleistanthane diterpenes from the seed of Caesalpinia sappan and their antiausterity activity against PANC-1 human pancreatic cancer cell line Fitoterapia 91:148-53 32 Nguyen, MT, Nguyen, NT, Nguyen, KD, Dau, HT, Nguyen, HX, Dang, PH, Le, TM, Nguyen Phan, TH, Tran, AH, Nguyen, BD, Ueda, JY & Awale, S 2014, Geranyl dihydrochalcones from Artocarpus altilis and their antiausteric activity Planta Med 80(2-3):193-200 33 Nguyen VD, Nguyen HHC 2015, Molecular screening of Azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microfora using bioinformatics Advances in Intelligent Systems and Computing 358, 219-229 34 Phan, T.T.P, Nguyen, H.D and Schumann, W 2006, Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis, Protein Expression and Purification, 46(2), 189–195 35 Poeta P, Costa D, Sáenz Y, Klibi N, Ruiz-Larrea F, Rodrigues J, Torres C, 2005 “Characterization of antibiotic resistance genes and virulence factors in faecal enterococci of wild animals in Portugal” J.Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2005, Nov;52(9):396-402 36 Punj, V, Das Gupta, TK & Chakrabarty, AM 2003, Bacterial cupredoxin azurin and its interactions with the tumor suppressor protein p53 Biochem Biophys Res Commun 312(1):109-14 37 Riley, MA 2009, Bacteriocins, Biology, Ecology, and Evolution In: Schaechter M (edi.), Encyclopedia of Microbiology, Oxford: Elsevier, pp 32-44 63 38 Riederer, A, Takasuka, T.E, Makino, S, Stevenson, D.M, Bukhman, Y.V, Elsen, N.L and Fox, B.G, 2011, Global gene expression patterns in Clostridium thermocellum as determined by microarray analysis of chemostat cultures on cellulose or cellobiose, Applied and environmental microbiology, 77(4), 1243– 1253 39 Saito, H, Shibata, T and Ando, T 1979, Mapping of genes determining nonpermissiveness and host-specific restriction to bacteriophages in Bacillus subtilis Marburg, Molecular & General Genetics: MGG, 170(2), 117–122 40 Sand, SL, Nissen-Meyer, J, Sand, O & Haug, TM 2013, Plantaricin, A, a cationic peptit produced by Lactobacillus plantarum, permeabilizes eukaryotic cell membranes by a mechanism dependent on negative surface charge linked to glycosylated membrane proteins Biochim Biophys Acta 1828(2):249-59 41 Schallmey, M, Singh, A and Ward, O.P, 2004, Developments in the use of Bacillus species for industrial production, Canadian journal of microbiology, 50(1), 1–17 42 Schumann, W, 2007, Production of recombinant proteins in Bacillus subtilis, Advances in Applied Microbiology, 62, 137–189 43 Taranta, M, Bizzarri, AR & Cannistraro, S 2008, Probing the interaction between p53 and the bacterial protein azurin by single molecule force spectroscopy J Mol Recognit 21:63-70 44 Taranta, M, Bizzarri, AR & Cannistraro, S 2009, Modeling the interaction between the N-terminal domain of the tumor suppressor p53 and azurin J Mol Recognit 22:215-222 45 Thao, NP, Cuong, NX, Luyen, BT, Nam, NH, Cuong, PV, Thanh, NV, Nhiem, NX, Hanh, TT, Kim, EJ, Kang, HK, Kiem, PV, Minh, CV & Kim, YH, 2013 Steroidal constituents from the starfish Astropecten polyacanthus and their anticancer effects Chem Pharm Bull (Tokyo) 61(10):1044-51 46 Thinh, PD, Menshova, RV, Ermakova, SP, Anastyuk, SD, Ly, BM & Zvyagintseva, TN 2013, Structural characteristics and anticancer activity of fucoidan from the brown alga Sargassum mcclurei Mar Drugs 11(5):1456-76 64 47 Thomas, JM, Maria, EC & Montville, B 1994, Evidence that dissipation of proton motive force is a common mechanism of action for bacteriocins and other antimicrobial proteins Food Microbiology 24(1-2):53-74 48 Tolonen, A.C, Haas, W, Chilaka, A.C, Aach, J, Gygi, S.P and Church, G.M, 2011, Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe, Molecular systems biology, 7, 461 49 Vesterlund S, Paltta J, Lauková A, Karp M, Ouwehand AC , 2004 Rapid screening method for the detection of antimicrobial substances J.Microbiol Methods, 2004 , Apr;57(1):23-31 50 Vinodhkumar, R, Song, Y & Devaki, T 2008, Romidepsin (depsipeptit) induced cell cycle arrest, apoptosis and histone hyperacetylation in lung carcinoma cells (A549) are associated with increase in p21 and hypophosphorylated retinoblastoma proteins expression Biomed Pharmacother 62:85-93 51 Walenkamp, AME, Bestebroer, J, Boer, IGJ & Kruizinga, R 2010, Staphylococcal SSL5 binding to human leukemia cells inhibits cell adhesion to endothelial cells and platelets Neoplasia 32:1-10 52 Walenkamp, AME, Boer, IGJ, Bestebroer, J, Rozeveld, D, Timmer-Bosscha, H, Hemrika, W, van Strijp, JAG & de Haas, CJC 2009, Staphylococcal superantigen-like 10 inhibits CXCL12-induced Neoplasia 11:333-344 53 Wood, LM, Vafa, ZP & Paterson, Y 2010, Listeria-derived ActA is an effective adjuvant for primary and metastatic tumor immunotherapy Cancer Immunol Immunother 59:1049-1058 54 Yamada, T, Christov, K & Das, BC 2011, Mechanism of action of p28, a first-inclass, non-HDM2 mediated peptit inhibitor of p53 ubiquitination J Clin Oncol 29 Psuppl; abstr e13513 55 Yoon, J.H, Park, J.E, Suh, D.Y, Hong, S.B, Ko, S.J and Kim, S.H, 2007, Comparison of dyes for easy detection of extracellular cellulases in fungi, Mycobiology, 35(1), 21–24 65 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần hỗn hợp a Thành phần hóa chất dùng cho điện di DNA Thành phần Thể tích Ghi Bromophenol blue 1% 12,5 µl Xylene cyanol FF 1% 12,5 µl Glycerol 15 ml Tris base 242 g/l Glacial acetic acid 57,1 ml Dung dịch điện di DNA EDTA 100 mM, pH 8,0 100 ml TAE 50X dH2O 1000 ml Agarose 1g TAE 1X 50 ml Safeview 5µ Dung dịch nạp mẫu 6X Gel điện di DNA b Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật Thành phần Thể tích Trypton 10 g/l Yeast extract g/l NaCl g/l Ghi Môi trƣờng LB lỏng Nƣớc cất vừa đủ Agar Kháng sinh kanamycin 1000 ml 20 g/l 50 µg/ml Mơi trƣờng LB lỏng đặc c Dung dịch nạp mẫu điện di SDS – PAGE Thành phần Tris – HCl pH 6,8 Thể tích 250 mM SDS 10% Glycerol 30% DTT Ghi Nạp mẫu 5X 500 mM Bromophenol blue 0,02% Tris – HCl pH 6,8 250 mM Glycine 192 mM SDS Điện di 1X 0,1% d Thành phần dung dịch EBW Thành phần Thể tích Lysozyme 10 µl/ml DNase I (50 mg/ml) 20 µl/ml PMSF (500 mM) mM e Thành phần dung dịch dung ly Thành phần Thể tích Tris – HCl pH 8,0 30 mM NaCl 500 mM Glycerol Immidazole 5% Các nồng độ từ 20 mM đến 250 mM f Thành phần gel polyacrylamide 12% Thành phần Gel phân tích (µl) Gel gom (µl) 30% Acrylamide-Bisacrylamide 3.000 480 Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 2.000 - Tris-HCl 1,5 M, pH 6,8 - 750 SDS 10% 70 35 APS 10% 48 25 TEMED 3,5 3,5 2.500 2.000 H2 O g Dung dịch bảo quản protein Thành phần Thể tích Tris – HCl pH 8,0 30 mM NaCl 300 mM Glycerol 20% Phụ lục 2: Kết giải trình tự gene Cnazu10 plasmid pCnazu10 Phụ lục 3: Kết giải trình tự gene Ruazu12 plasmid pRuazu12 ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ÂU THỊ HẠNH TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ BACTERIOCIN CNAZU10 VÀ RUAZU12 TỪ CLOSTRIDIUM NEXILE VÀ RUMINOCOCCUS SP LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công... ung thƣ Trong số có bacteriocin từ Clostridium nexile Ruminococcus sp Trong đề tài: Tạo dòng, biểu tinh chế bacteriocin Cnazu10 Ruazu12 từ Clostridium nexile Ruminococcus sp. ”, Các gene p2seq08... để tạo dòng gene mã hóa Cnazu10 Ruazu12 biểu đƣợc protein Cnazu10 Ruazu12 từ bacteriocin vi khuẩn Clostridium nexile Ruminococcus sp tiết - Nghiên cứu cung cấp quy trình tạo dòng, biểu tinh chế