BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -‘ NGUYỄN THỊ HẢI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY BAN (HYPERICUM HOOKERIANUM WIGHT &ARN.) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẢI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY BAN (HYPERICUM HOOKERIANUM WIGHT & ARN.) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển (Bộ môn Dƣợc học cổ truyền-Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội), ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn tận tình, bảo giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Phƣơng Thiện Thƣơng, Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu, PGS TS Nguyễn Thùy Dƣơng Bộ môn Dƣợc lực, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Trƣờng Cao đẳng Dƣợc TW Hải Dƣơng tạo điều kiện cho đƣợc học tập nghiên cứu suốt thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS ThS Vũ Duy Hồng – Viện Huyết Học, sinh viên Đỗ Thị Thu Hoàng Thị Lan Anh, ngƣời đồng hành, giúp đỡ cho tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Bộ môn Dƣợc học cổ truyền, Bộ mơn Dƣợc lực, Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn (Viện Dƣợc liệu), Phòng sau đại học trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành luận văn Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp ngƣời thân gia đình ln động viên giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Nguyễn Thị Hải MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỒNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI HYPERICUM 1.1.1 Thực vật học 1.1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.1.3 Các loài thuộc chi Hypericum 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.2.1 Nhóm naphthodianthron bianthraquinon 1.1.2.2 Nhóm phloroglucinol 1.1.2.3 Nhóm xanthon 1.1.2.4 Nhóm flavonoid 1.1.2.5 Các nhóm chất khác 1.1.3 Tác dụng dƣợc lý 1.1.3.1.Tác dụng chống trầm cảm 1.1.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào 1.1.3.3 Tác dụng kháng khuẩn 1.1.3.4 Tác dụng chống oxy hóa 10 1.1.4 Công dụng 11 1.2 TỔNG QUAN VỀ HYPERICUM HOOKERIANUM 12 1.2.1 Thực vật học 12 1.2.1.1 Đặc điểm thực vật 12 1.2.1.2 Phân bố 12 1.2.2 Thành phần hóa học 13 1.2.3 Tác dụng dƣợc lý 15 1.2.3.1 Tác dụng chống oxy hóa 16 1.2.3.2 Tác dụng chống virus 16 1.2.3.3 Khả gây độc tế bào 16 1.2.3.4 Tác dụng chống ung thư 17 1.2.3.5 Tác dụng hệ thần kinh trung ương 17 1.2.3.6 Tác dụng kháng khuẩn 17 1.2.4 Công dụng 18 1.3 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO, CHẤT CHỐNG OXY HOÁ 18 1.3.1 Nguồn gốc gốc tự 18 1.3.2 Stress oxy hóa, tác hại stress oxy hóa 19 1.3.3 Chất chống oxy hóa 19 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 20 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 20 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 20 2.1.3 Động vật thí nghiệm 21 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Chiết xuất, sàng lọc tác dụng chống oxy hoá in vitro từ phân đoạn dịch chiết phần mặt đất ban Hypericum hookerianum 21 2.2.1.1 Chiết xuất cắn toàn phần phân đoạn 21 2.2.1.2 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phương pháp dọn gốc tự DPPH 22 2.2.1.3 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phương pháp dọn gốc tự superoxid 24 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 25 2.2.2.1 Định tính sơ nhóm chất hoá học 25 2.2.2.2 Phân lập hợp chất 29 2.2.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất 30 2.2.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan 30 2.2.4 Xử lý số liệu 34 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ IN VITRO TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CÂY BAN H HOOKERIANUM 35 3.1.1 Xác định độ ẩm dƣợc liệu 35 3.1.2 Chiết xuất 35 3.1.3 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa invitro phƣơng pháp dọn gốc tự DPPH 37 3.1.4 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro phƣơng pháp dọn gốc tự superoxid 37 3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 38 3.2.1 Định tính sơ nhóm chất phƣơng pháp hóa học 38 3.2.2 Định tính cắn ethyl acetat sắc kí lớp mỏng 39 3.2.3 Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất từ phần mặt đất an H hookerianum 40 3.2.3.1 hân lập 40 3.2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 42 3.2.3.3 Xác định cấu tr c hợp chất phân lập 43 3.3 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN IN VIVO 50 CHƢƠNG IV BÀN LUẬN 56 4.1 VỀ CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ IN VITRO 56 4.1.1 Về chiết xuất 56 4.1.2 Về sàng lọc tác dụng chống oxy hoá in vitro 56 4.1.2.1 Về đánh giá tác dụng dọn gốc tự DPPH 56 4.1.2.2 Về đánh giá tác dụng dọn gốc tự Superoxid 57 4.2 VỀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 57 4.2.1 Về định tính sơ nhóm chất hóa học 57 4.2.2 Về phân lập xác định cấu trúc hợp chất 57 4.3 VỀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN IN VIVO 61 KẾT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………….66 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt ASAT Tên đầy đủ Aspartat aminotransferase ALAT BET BuOH Alanin aminotransferase Cắn phân đoạn ethyl acetat phần mặt đất ban Butanol BTP CC Cắn phân MeOH toàn phần phần mặt đất ban Sắc ký cột (Column chromatography) 13 DPPH Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon (13) Nuclear magnetic resonance) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DMSO Dimethyl sulfoxid 10 ESI-MS 11 12 13 14 EtOAc H – NMR Hx IC50 Phổ khối lƣợng ion hóa tia điện (Electrospray ionization mass spectrometry) Ethyl acetat Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton n- Hexan Nồng độ ức chế 50% 15 IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) 16 17 18 19 20 21 MeOH MDA Mp MS NMR NBT Methanol Malonyl dialdehyd Nhiệt độ nóng chảy (Melting point) Phổ khối (Mass spectrometry) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) Nitroblue tetrazolium 22 23 24 NaCMC GSH PAR Natri carboxymethyl cellulose Glutathion Paracetamol 25 26 27 28 SOD v/v TT TLTK Superoxide dismutase Thể tích/thể tích Thuốc thử Tài liệu tham khảo C – NMR DANH MỤC CÁC BẢNG STT 10 11 12 13 14 15 TÊN BẢNG Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Hypericum Việt Nam Bảng 1.2 Các hoạt chất đƣợc phân lập từ H hookerianum (Wight & Arn.) giới Bảng 1.3 Các hợp chất đƣợc phân lập từ ban H hookerianum (Wight & Arn.) thu hái Sapa Bảng 3.1 Khối lƣợng cắn phân đoạn dịch chiết methanol phần mặt đất Ban Bảng 3.2 Nồng độ ức chế 50% (IC50) gốc tự DPPH cúa mẫu thử chất đối chiếu Bảng 3.3 Nồng độ ức chế 50% (IC50) gốc tự superoxid mẫu thử chất đối chiếu Bảng 3.4 Kết định tính nhóm chất hóa học Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR chất A astilbin theo tài liệu tham khảo Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR chất B quercitrin theo tài liệu tham khảo ảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR chất C hyperin theo tài liệu tham khảo Bảng 3.8 Ảnh hƣởng cao an hoạt độ AST huyết chuột lô nghiên cứu Bảng 3.9 Ảnh hƣởng cao an hoạt độ ALT huyết chuột lô nghiên cứu Bảng 3.10 Ảnh hƣởng cao an hàm lƣợng MDA gan chuột lô nghiên cứu Bảng 3.11 Ảnh hƣởng cao an hàm lƣợng GSH gan chuột lô nghiên cứu Bảng 3.12 Ảnh hƣởng cao an hàm lƣợng SOD gan chuột lô nghiên cứu TRANG 14 15 35 37 38 38 44 46 49 51 52 53 54 54 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Hình Hình 1.1 Bụi cây, hoa H hookerianum Trang 13 Hình 2.1 Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng - lỏng Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn 22 36 Hình 3.2 Sắc ký đồ cắn phân đoạn ethyl acetat (hệ III) điều kiện quan sát 40 Hình 3.3 Sắc ký đồ phân đoạn cắn ethyl acetat phần mặt đất an 41 10 11 12 Hình 3.4 Sơ đồ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat phần mặt đất an Hình 3.5 Sắc kí đồ kiểm tra chất phân lập đƣợc Hình 3.6 Chất A phân lập đƣợc Hình 3.7 Cơng thức cấu tạo chất A Hình 3.8 Chất B phân lập đƣợc Hình 3.9 Cơng thức cấu tạo chất B Hình 3.10 Chất C phân lập đƣợc 13 Hình 3.11 Công thức cấu tạo chất C 42 43 43 45 46 48 48 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có hệ sinh thái thực vật đa dạng phong phú Việc sử dụng cỏ việc phòng chữa bệnh đƣợc ông cha ta sử dụng từ lâu đời Tuy nhiên sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chƣa đƣợc nghiên cứu đầy đủ liều lƣợng, độc tính hiệu điều trị Hiện nay, chứng khoa học cho thấy gia tăng nồng độ gốc tự tế bào nguyên nhân chủ yếu gây nên vấn đề bệnh tật nhƣ xơ vữa động mạch, tiểu đƣờng, ung thƣ [45] Vì xu hƣớng tìm kiếm nghiên cứu hoạt chất từ dƣợc liệu có hoạt tính sinh học cao để chống lại gốc tự mối quan tâm nhiều nhà khoa học giới Chi Hypericum chi lớn thuộc họ Ban (Hypericaceae) gồm 460 loài phân bố nhiều nơi giới [78] Một số loài phổ biến nhƣ H perforatum, H patulum, H mysorence, H polyanthenum, H Drummondii đƣợc sử dụng để giảm lo âu, giảm đau ảo vệ gan [29], [53], [69] Lồi Hypericum patulum đƣợc gọi an tròn đƣợc nghiên cứu Việt Nam dùng điều trị viêm gan mạn [1] Hypericum hookerianum loài thuộc chi Hypericum, phân bố chủ yếu số vùng Trung quốc, Nepal, Ấn Độ Việt Nam Tại Ấn Độ loài Hypericum hookerianum đƣợc sử dụng y học cổ truyền để làm lành vết thƣơng [52], Trung quốc đƣợc sử dụng điều trị viêm bàng quang [8] Gần giới có số nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa, tác dụng thần kinh trung ƣơng, chống virus chống ung thƣ loài ban [28], [50], [53] Tại Việt Nam loài H hookerianum mọc phổ biến Sapa (Lào Cai) nhiên chƣa đƣợc sử dụng y học, chủ yếu đƣợc bà dân tộc dùng chữa đau mắt cho gia súc [4] Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Hải (2017) ƣớc đầu nghiên cứu sơ ộ đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học, phân lập xác định đƣợc số hoạt chất từ loài Hypericum hookerianum [7] Hiện chƣa có nghiên cứu nƣớc đánh giá tác dụng sinh học loài ban Trên sở nghiên cứu loài Hypericum hookerianum Việt Nam, nhằm góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học đánh giá số tác dụng PHỤ LỤC 4: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT C Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR,) Phổ khối (MS), Phổ HMBC Inten.(x10,000,000) 111 1.50 1.25 1.00 195 0.75 463 209 561 0.50 0.25 331 0.00 100 200 300 400 500 600 700 m/z 600 700 m/z ESIInten.(x10,000,000) 2.0 465 1.5 115 303 1.0 0.5 143 0.0 100 212 200 338 300 391 552 400 500 ESI+ ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẢI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY BAN (HYPERICUM. .. chống oxy hóa đánh giá tác dụng bảo vệ gan ban (Hypericum hookerianum Wight & Arn. ) với mục tiêu sau: Chiết xuất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro phân đoạn dịch chiết phần mặt đất ban (Hypericum. .. (Hypericum hookerianum Wight & Arn. ) Phân lập xác định cấu trúc hóa học 2-3 chất phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa in vitro Đánh giá tác dụng bảo vệ gan động vật thực nghiệm từ phần mặt đất ban (Hypericum