BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ NỐT SẦN CỦA CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : ĐINH THỊ HÀ Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 07/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ NỐT SẦN CỦA CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐINH THỊ HÀ Tháng 07/2011 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi nhận nhiều ủng hộ giúp đỡ từ gia đình, thầy bạn bè Nay tơi xin chân thành cảm ơn đến  Ban giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học tất thầy tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trường  TS Lê Đình Đơn hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình thực khóa luận  Anh Võ Khánh Hưng, anh Nguyễn Phan Thành, thầy cô anh chị cán viện nghiên cứu Sinh học Môi Trường trường Đại học Nơng Lâm tận tình giúp đỡ, hỗ trợ mặt sở vật chất mặt kỹ thuật  Các bạn lớp DH07SH chia vui buồn hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ góp ý cho suốt thời gian học tập  Con xin ghi ơn ba mẹ nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho động viên, hỗ trợ tinh thần, vật chất để hồn thành tốt khóa luận Xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2011 Đinh Thị Hà i TÓM TẮT Hiện nay, với tình hình tăng dân số, diện tích đất canh tác ngày thu hẹp bị thối hóa mà nhu cầu lương thực, thực phẩm ngày tăng Do đó, vấn đề cải tạo đất tăng suất trồng quan tâm toàn xã hội Hàng năm giới lượng nitơ khí cố định chuyển hoá thành nguồn đạm dạng khác nhau, thơng qua q trình cố định đạm sinh học tự nhiên ước tính gấp hai lần lượng nitơ hóa học sản xuất hàng năm Quan hệ cộng sinh vi khuẩn Rhizobium với rễ họ đậu có vai trò quan trọng cải tạo đất, ổn định suất trồng bền vững hệ sinh thái Vi khuẩn cố định đạm quan tâm, nghiên cứu nhiều loại họ Đậu, có đậu xanh (Vigna radiata) Kỹ thuật phân lập, tuyển chọn, định danh vi khuẩn cộng sinh với rễ họ Đậu làm tảng để tạo chế phẩm từ loại vi khuẩn phụ vụ cho sản xuất nơng nghiệp Do đó, chúng tơi thực đề tài: “Phân lập vi khuẩn cố định đạm từ nốt sần đậu xanh (Vigna radiata) Thí nghiệm gồm nội dung: Phân lập làm chủng vi sinh vật từ nốt sần đậu xanh; Xác định hình thái, nhuộm Gram; Thực thử nghiệm sinh hóa để chọn lọc chủng vi sinh vật có đặc điểm Rhizobium sp.; Phát vi khuẩn Rhizobium sp phản ứng PCR với cặp primer (FGPS 1490, FGPS 132) Kết quả: Thu thập 24 mẫu nốt sần đậu xanh Sau xác định hình thái, nhuộm gram, thực thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn có đặc điểm tương đồng với Rhizobium sp .Sản phẩm PCR gồm band có kích thước khoảng 380 - 550 pb Chọn mẫu giải trình tự có kết tương đồng tới 99% Klebsiella pneumoniae subsp ii SUMMARY Thesis title “Initially isolated nitrogen-fixing bacteria from nodules of green bean plants (Vigna radiata)” Now, togerther with population growth, the land area shrinking and increasingly degraded, the food need to increase So, to solve this problem care of society Every year, on the world have quantity atmospheric nitrogen is fixed and to transform nitrogen sources under various forms through the process of biological nitrogen fixation naturally, is estimated double chemical nitrogen fertilizer produced annually on the world The symbiosis relationship between Rhizobium bacteria with roots of legumes, has an important role in nutrient cycles of nitrogen, a stable crop yields and unshakeable ecosystem Nitrogen-fixing bacteria are interested in attracting more research and applied to many different crops Green bean plants (Vigna radiata) is a plant of high economic value Technical isolation, selection, identification the bacteria symbiosis with roots of green bean plants contribute to improvement soil, increased crop yields The experiment consists of four main: Isolation and purification of microbial strains from nodules of green bean plants; Determine morphology, Gram staining; Perform biochemical testing for testing for microorganisms collected for selected characteristics to consistent with Rhizobium sp.; Detecting bacteria Rhizobium sp by PCR with primer pair (FGPS 1490, FGPS 132) The Result: 24 samples collected strain from nodules of green bean plants; After the process of determining morphology, gram staining, biochemical tests, seven strains have characteristics similar with Rhizobium sp Product of PCR band size about 380 to 550 pb Choose samples to decipher sequence has similar results to 99% of Klebsiella pneumoniae subsp iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .vii DANH SÁCH CÁC HÌNH .viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu .2 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thực vật họ Đậu 2.2 Giới thiệu đậu xanh (Vigna radiata) 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái đậu xanh (Vigna radiata) 2.3 Vai trò nitơ thực vật 2.4 Các nguồn nitơ cung cấp cho 2.5 Quá trình cố định nitơ tự nhiên 2.6 Tổng quan vi khuẩn cố định nitơ 2.6.1 Phân loại vi khuẩn cố định nitơ 2.6.2 Đặc điểm vi khuẩn cố định nitơ 2.6.3 Vai trò vi khuẩn cố định nitơ tự nhiên .8 2.7 Vi khuẩn Rhizobium 2.7.1 Lịch sử phát vi khuẩn Rhizobium 2.7.2 Phân loại vi khuẩn Rhizobium .8 2.7.3 Đặc điểm vi khuẩn Rhizobium 11 2.7.5 Cơ chế cộng sinh Rhizobium với họ đậu 12 2.8 Ly trích DNA phản ứng PCR (Polymease Chain Reaction) 14 2.8.1 Ly trích DNA 14 iv 2.8.1.1 Nguyên lý .14 2.8.2 Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) 15 2.8.2.1 Khái niệm chung 15 2.8.2.2 Nguyên lý .15 2.8.2.3 Các thành phần phản ứng PCR 15 2.8.2.4 Các giai đoạn phản ứng PCR .18 2.9 Tình hình nghiên cứu giới nước 19 2.9.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Rhizobium sp giới 19 2.9.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Rhizobium sp Việt Nam 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 3.1 Thời gian Địa điểm 21 3.2 Vật liệu nghiên cứu 21 3.2.1 Mẫu thí nghiệm: 21 3.2.2 Hóa chất sử dụng 22 3.2.3 Thiết bị dụng cụ 23 3.3 Phương pháp thí nghiệm 23 3.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập làm vi khuẩn từ nốt sần đậu xanh 23 3.3.2 Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào xác định Gram vi khuẩn 23 3.3.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa .24 3.3.3.1 Khả tạo thành Indol 24 3.3.3.2 Khả dịch hóa gelatin 24 3.3.3.3 Khả phân giải urê 25 3.3.3.4 Khả lên men đường 25 3.3.3.5 Phản ứng VP (Voges – Prokauer) 25 3.3.3.6 Khả di động 25 3.3.4.Thí nghiệm 4: Phát chủng vi khuẩn Rhizobium phương pháp PCR 26 3.3.4.1 Ly trích DNA tổng số vi khuẩn 26 3.3.4.2 Thực phản ứng PCR 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Phân lập làm chủng vi khuẩn từ nốt sần đậu xanh 29 4.2 Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào nhuộm Gram vi khuẩn 30 4.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa 32 v 4.4 Thí nghiệm 4: Phát vi khuẩn Rhizobium sp phương pháp PCR 36 4.4.1 Ly trích DNA tổng số vi khuẩn phân lập từ nốt sần đậu xanh 36 4.4.2 Phản ứng PCR 36 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ctv : Cộng tác viên bp : Base pair DNA : Deoxyribonucleotide acid DNTP : Deoxynucleotide triphosphate EtBr : Ethidium bromide : Hecta mM : Mili mol / lít NaCl : Natri clorua ng : Nano gam PCR : Polymerase chain reaction RNAse : Ribonuclease SDS : Sodium dodecyl sulfate TAE : Tris Acetate EDTA Taq : Thermus aquaticus TE : Tris EDTA Tm : UV : Melting temperature Ultra violet YEMA : Yeast extract manitol agar μl : Micro lít μg : Micro gam μM : Micro mol / lít vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cây đậu xanh Hình 2.2 Chu trình cố định nitơ tự nhiên .6 Hình 2.4 Vi khuẩn Rhizobium Hình 2.6 Cơ chế tạo nốt sần họ đậu 13 Hình 2.7 Nguyên tắc phản ứng PCR .18 Hình 4.1 Màu sắc, hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn mơi trường YEMA 30 Hình 4.2 Vi khuẩn môi trường chọn lọc YEMA - Congo Red 31 Hình 4.3 Hình dạng, màu sắc quan sát kính hiển vi 100X 31 Hình 4.5 Thử nghiệm khả lên men đường 33 Hình 4.6 Thử nghiệm khả tạo thành Indol 34 Hình 4.7 Thử nghiệm khả phân giải ure 34 Hình 4.8 Thử nghiệm khả di động .35 Hình 4.9 Điện di kiểm tra mẫu 36 Hình 4.10 Sản phẩm PCR 37 viii Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập làm chủng vi khuẩn từ nốt sần đậu xanh Để nuôi cấy vi khuẩn nốt sần, người ta thường sử dụng môi trường chứa nguồn Carbon cho Rhizobium fructose, glucose, lactose, sucrose, mannitol, số muối khống cao nấm men (Báo cáo Hội thảo Tập huấn Quản lý Chất lượng Chế phẩm Vi sinh Cố định đạm cho Cây họ đậu, 2007) Môi trường dùng để phân lập tăng sinh vi khuẩn nốt sần thường sử dụng môi trường YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar) Từ rễ đậu xanh thu thập từ tỉnh, chọn lấy nốt sần Vì rễ đậu xanh vùng khác nên số lượng kích thước nốt sần thu rễ khác nhau.Thường nốt sần tập trung rễ gần cổ rễ Sau chọn nốt sần tiến hành vô trùng để loại bỏ loại tạp nhiễm nốt sần nghiền nhỏ eppendoft (đươc hấp khử trùng) có chứa sẵn ml nước cất vơ trùng, thu dịch khuẩn Dịch khuẩn cấy ria đĩa môi trường YEMA vô trùng đem ủ 28 - 30oC vòng 24 Kết thu nhiều khuẩn lạc có màu sắc, hình dạng khác đĩa, để làm chủng vi khuẩn thu tiến hành chọn khuẩn lạc đơn cấy nhiều lần đĩa môi trường YEMA đến thu dòng khuẩn lạc có hình dạng màu sắc Kết thu bảng 4.1, có dòng khuẩn lạc có đặc điểm dòng 1: khuẩn lạc có màu trắng đục, tròn, lồi có dịch nhầy (hình 4.1 (a)); dòng 2: khuẩn lạc có màu vàng, tròn, khơ (hình 4.1 (b)); dòng 3: khuẩn lạc có màu trắng trong, dẹp, khơ (hình 4.1 (c)) Trong Do chúng tơi chọn dòng có đặc điểm tương đồng với đặc điểm Rhizobium sp kết phù hợp với Irum Naz ctv (2009), Rhizobium vi khuẩn hiếu khí, dị dưỡng, nuôi cấy môi trường phân lập YEMA ủ 28 - 30oC 24 giờ, tạo khuẩn lạc màu trắng đục trắng trong, tròn, có dịch nhầy 29 Hình 4.1 Màu sắc, hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn mơi trường YEMA (a) khuẩn lạc có màu trắng, tròn, lồi, có dịch nhầy xung quanh (b) khuẩn lạc có màu vàng, tròn, khơ.(c) khuẩn lạc có màu trắng, tròn, lồi, khơ Bảng 4.1 Kết đặc điểm, màu sắc khuẩn lạc môi trường YEMA Mẫu Đặc điểm Màu sắc Mẫu Đặc điểm Màu sắc M1 trơn bóng, khơ, lồi trắng M13 trơn bóng, khơ, lồi Vàng M2 trơn bóng, nhầy, lồi trắng M14 trơn bóng, nhầy, lồi trắng M3 trơn bóng, nhầy, lồi vàng nhạt M15 trơn bóng, khơ, lồi M4 trơn bóng, nhầy, lồi trắng đục M16 trơn bóng, nhầy, lồi trắng M5 trơn bóng, nhầy, lồi trắng đục M17 trơn bóng, nhầy, lồi vàng nhạt M6 trơn bóng, nhầy, lồi trắng đục M18 trơn bóng, nhầy, dẹp trắng đục M7 Khơ, dẹp vàng nhạt M19 trơn bóng, nhầy, lồi Vàng M8 trơn bóng, nhầy, lồi trắng đục M20 trơn bóng, khơ, lồi M9 trơn bóng, nhầy, lồi trắng đục M21 trơn bóng, nhầy, lồi trắng đục M10 trơn bóng, nhầy, lồi trắng đục M22 trơn bóng, nhầy, lồi Vàng M11 trơn bóng, nhầy, lồi vàng M23 trơn bóng, nhầy, lồi Vàng M12 trơn bóng, nhầy, lồi trắng đục M24 trơn bóng, nhầy, lồi trắng Vàng trắng đục 4.2 Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào nhuộm Gram vi khuẩn Sau làm tăng sinh khối chủng vi khuẩn thu từ nốt sần đậu xanh, chọn lọc 13 mẫu Để xác định xác chủng vi khuẩn chọn lọc Rhizobium, cấy ria khuẩn lạc sang đĩa môi trường YEMA congo red ủ 28 – 30oC 24 giờ, kết quan sát nhóm: nhóm khuẩn lạc tròn, lồi, hấp thụ thị Congo red nên khuẩn lạc có màu hồng (hình 4.2 (b)) , nhóm khuẩn lạc tròn, lồi, khơng hấp thu thị Congo red nên có màu trắng (hình 4.2 (a)) Khi tiến hành quan sát hình thái vi khuẩn kính hiển vi vật kính 100X, kết 30 quan sát hình thái vi khuẩn có nhóm nhóm có hình que (hình 4.3(a)), nhóm có hình cầu (hình 4.3 (b)) Kết nhuộm Gram: vi khuẩn Gram âm có màu đỏ (hình 4.3(a)), vi khuẩn Gram dương có màu tím (hình 4.3 (b)) Từ kết trên, chúng tơi chọn đĩa vi khuẩn có hình que khuẩn lạc không hấp thụ thị màu congo red Kết phù hợp với Irum Naz ctv (2009); Eva Gyory ctv (2010), Vi khuẩn Rhizobium sp vi khuẩn Gram âm, có hình que, kích thước từ -5 mm sau ngày ủ 28 – 30oC môi trường rắn YEMA Trên môi trường chọn lọc YEMA congo red khuẩn lạc Rhizobium sp không hấp thu thị môi trường Do sau cấy ria khuẩn lạc mơi trường YEMA congo red, quan sát hình thái, nhuộm Gram 13 chủng vi khuẩn phân lập từ thí nghiệm thu chủng vi khuẩn có đặc điểm tương đồng với Rhizobium sp Tuy nhiên, với quan sát ban đầu chưa đủ sở để khẳng định dòng vi khuẩn vừa chọn lọc Rhizobium nên chúng tơi tiến hành thử nghiệm sinh hóa Hình 4.2 Vi khuẩn mơi trường chọn lọc YEMA - Congo Red (a) khuẩn lạc có màu trắng, tròn, lồi.(b) khuẩn lạc có màu hồng, tròn, lồi Hình 4.3 Hình dạng, màu sắc quan sát kính hiển vi 100X (a) vi khuẩn Gram(-) màu đỏ, hình que.(b) vi khuẩn Gram (+) màu tím, hình cầu 31 Bảng 4.1 Kết màu sắc, hình dạng, nhuộm Gram vi khuẩn Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M12 M21 M23 Kết trên(*) Trắng Trắng Đỏ Trắng Đỏ Trắng Đỏ Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng Đỏ Hình dạng Que Que Cầu Que Que Que Cầu Que Que Que Que Que Cầu NhuộmGram + + + + + (*) kết môi trường chọn lọc YEMA congo red (+): dương tính, (-): âm tính 4.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa Để kiểm định khả phân giải hợp chất có nitơ vi khuẩn phân lập từ nốt sần đậu xanh Tiến hành thử nghiệm: khả dịch hóa gelatin, khả phân giải urê, khả tạo thành Indol Để kiểm định khả sử dụng nguồn hydrat carbon chủng vi khuẩn phân lập từ nốt sần đậu xanh thực phản ứng khả lên men đường, phản ứng VP (Voges – Prokauer), để khảo sát khả di động chủng vi khuẩn thu từ nốt sần đậu xanh Kết thử nghiệm sinh hóa 13 chủng vi khuẩn bảng 4.2 Bảng 4.2 Kết thử nghiệm sinh hóa Chủng VK Ure Acid(*) Indol VP Gelatin KNDĐ M2 - + - - + + M4 - + - - + + M8 - + - - + + M9 - + - - + + M10 - + - - + + M12 - + - - + + M21 - + - - + + Acid từ maltose, KNDĐ: khả di động.(+) dương tính,(-) âm tính 32 Vi khuẩn Rhizobium có enzym phân giải đường (manltose, glucose, saccharose, ) tạo thành acid hữu làm giảm độ pH mơi trường đồng thời tạo chất khí như: CO2, H2 Để phát phân giải đường, dùng chất thị màu phenol red Q trình phân giải đường tức làm pH mơi trường giảm Khi cấy vi khuẩn vào môi trường lên men đường ủ 28 - 30oC 24 giờ, thấy pH môi trường giảm tức môi trường từ màu đỏ chuyển sang màu vàng, xuất khí bề mặt dung dịch nuôi cấy Kết thử nghiệm mẫu làm môi trường chuyển màu vàng, mẫu M4, M8, M12 (hình 4.5), thấy tượng sủi bọt khí mơi trường ni cấy, vi khuẩn thu có khả phân giải đường maltose sinh Còn mẫu M2, M9, M10, M21 khơng thấy có tượng sủi bọt khí (hình 4.5), mẫu có khả phân giải đường khơng sinh Như chủng vi khuẩn phân lập từ nốt sần đậu xanh sử dụng nguồn carbon từ đường maltose Hình 4.5 Thử nghiệm khả lên men đường ĐC (-): đối chứng âm, 2, 4, 8, 9, 10, 12, 21: thứ tự mẫu Các hợp chất có nitơ thường nguồn cung cấp nitơ cho tổng hợp protein tế bào vi sinh vật Các vi sinh vật thường sản sinh loại enzyme tương ứng để phân giải hợp chất chứa nitơ thành chất dễ sử dụng ( acid amin, NH3) chất tạo q trình phân giải hợp chất có nitơ vi sinh vật chất có tính độc Indol, H2S, Do đó, để kiểm định củng vi khuẩn phân lập từ nốt sần đậu xanh tiến hành thử nghiệm khả tạo thành indol Vi khuẩn có enzym tryptophanase có khả phân giải tryptophan môi trường 33 tạo thành Indol Nếu phản ứng dương tính xuất mơi trường có màu đỏ, vi khuẩn có khả tạo Indol, Indol kết hợp với paradimethylaminobenzaldehyd có thuốc thử Kowacs tạo thành hợp chất rosindol có màu đỏ [phương pháp thực mục 3.3.3.1] Quan sát Kết Sau cấy mẫu (M2, M4, M8, M9, M10, M12, M21) vào môi trường thử nghiệm Indol (hình 4.6), vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, thị môi trường không đổi tức thử nghiệm phản ứng Indol tất cho phản ứng âm tính Như chủng vi khuẩn phân lập đươc từ nốt sần đậu xanh không tạo indol q trình phân giải hợp chất có nitơ Hình 4.6 Thử nghiệm khả tạo thành Indol ĐC (-): đối chứng âm.2, 4, 8, 9, 10, 12, 21: thứ tự mẫu Hình 4.7 Thử nghiệm khả phân giải ure ĐC(-): đối chúng âm, 2, 4, 8, 9, 10, 12, 21: thứ tự mẫu 34 Để tiến hành thử nghiệm khả phân giải hợp chất có chứa nitơ urê dùng que cấy vòng lấy cấy chủng vi khuẩn vào mơi trường [phương pháp thực mục 3.3.3.3] Kết quan sát mẫu M2, M4, M8, M9, M10,M21) làm cho môi trường không đổi màu so với đối chứng âm Như mẫu vi khuẩn phân lập từ nốt sần đậu xanh ure không tạo enzyme urease để phân giải urê Điều có nghĩa việc bón thêm phân đạm cho họ đậu giai đoạn sau gieo đến 35 ngày không bị vi khuẩn sử dụng nên không cạnh tranh dinh dưỡng đạm với Còn giai đoạn vi khuẩn cộng sinh phát triển bên ký chủ chuyên biệt vi khuẩn có khả cố định nitơ khí để cung cấp cho cây, họ đậu, việc bón đạm giai đoạn gần thu hoạch khơng cần thiết lúc vi khuẩn có khả cung cấp lượng đạm cho Hình 4.8 Thử nghiệm khả di động ĐC (-): đối chứng âm.2, 4, 8, 9, 10, 12, 21: thứ tự mẫu Để kiểm định khả di động vi khuẩn phân lập từ nốt sần đậu xanh, tiến hành thử nghiệm khả di động [phương pháp thực mục 3.3.3.6] Kết quan sát mẫu M4, M8, M10, M21 thấy vi khuẩn phát triển khỏi đường cấy thẳng xung quanh, mẫu M2, M9, M12, vi khuẩn phát triển theo dọc đường cấy Như chủng vi khuẩn có khả di động dễ dàng tìm thấy cấy ký chủ phát triển với khu vực phân bố rộng so với chủng vi khuẩn khơng có khả di động Sau trình xác định hình thái vi khuẩn, nhuộm Gram, tiến hành thử nghiệm sinh hóa chủng vi sinh vật phân lập từ 24 mẫu nốt sần đậu xanh thu mẫu (M2, M4, M8, M9, M10, M12, M21) có 35 đặc điểm tương đồng với vi khuẩn cộng sinh cố định đạm Rhizobium Để kiểm định lại kết tiến hành phát vi khuẩn Rhizobium kỹ thuật PCR (polymerase Chain Reaction) 4.4 Thí nghiệm 4: Phát vi khuẩn Rhizobium sp phương pháp PCR 4.4.1 Ly trích DNA tổng số vi khuẩn phân lập từ nốt sần đậu xanh DNA vật chất nghiên cứu di truyền phân tử Do đó, phải ly trích DNA tách khỏi tế bào chất RNA, protein,…Có nhiều phương pháp ly trích DNA, giai đoạn tách chiết DNA đóng vai trò vơ quan trọng DNA tổng số thu phải tinh sạch, không làm sản phẩm PCR bi sai lệch không đặc hiệu Chúng tiến hành ly trích DNA tổng số mẫu (M2, M4, M8, M9, M10, M12, M21) theo phương pháp [mục 3.3.4.1] Sau ly trích, để kiểm tra DNA ly trích được, điện di DNA tổng số gel 1.5% agarose dung dịch MOSP 1X, có hiệu điện 100 V, thời gian 30 phút Mẫu trộn với tỉ lệ 3μl mẫu: μl loading dye Kết điện di quan sát chụp hình tia UV (hình 4.9) mẫu cho band tương đối rõ chứng tỏ DNA tổng số ly trích kit Promega tương đối tinh Hình 4.9 Điện di kiểm tra mẫu 4.4.2 Phản ứng PCR 2, 4, 8, 9, 10,12, 21: thứ tự mẫu Theo Gisele Laguerre ctv, 1996, sử dụng cặp primer FGPS 1490 FGPS 132 kỹ thuật PCR để khuếch đại, sau dùng kỹ thuật RFLP để phân tích đặc tính 43 chủng Rhizobium leguminosarum biovars viciae, R trifolii, R phaseoli 36 Kesara Anamthawat- Jonsson ctv, 2000, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp primer FGPS 1490 FGPS 132 để khuếch đại vùng bảo tồn 16S - 23S vi khuẩn nốt sần sau dùng kỹ thuật RFLP để phân lập loài vi khuẩn nốt sần băng đảo Nadia Elboutahiri ctv, 2008, để nghiên cứu đặc tính di truyền Sinorhizobium meliloti Rhizobium sullae kỹ thuật rep-PCR, RAPD, phân tích ARDRA Trong sử dụng cặp primer FGPS 1490 FGPS 132 Vì chọn cặp primer FGPS 1490 FGPS 132 để sử dụng thí nghiệm phát Rhizobium sp vùng bảo tồn (IGS) 16S – 23S rDNA Hình 4.10 Sản phẩm PCR M: ladder 2, 4, 8, 9, 10, 12, 21: thứ tự mẫu Kết sử dụng cặp primer FGPS 1490 FGPS 132 với nhiệt độ bắt cặp 57oC, mẫu M4, M21 cho band có kích thước 550 bp Mẫu M8, M9, M10, M12, band bị đứt khúc primer bắt cặp không đặc hiệu, tạp nhiễm nên sản phẩm PCR quan sát tia UV mờ (hình 4.10), mẫu M2 cho sản phẩm PCR có kích thước khoảng 380 bp Để xác định xác chủng vi khuẩn vừa phân lập Rhizobium Chọn chủng cho band đậm mẫu M2 có band 380 bp mẫu M4 có kích thước khoảng 550 bp để giải trình tự Cơng ty Nam Khoa Kết sau giải trình tự hai chiều mẫu M2, M2 có trình tự: >TCCGGGTTTCCCCATTCGGACATCGCCGGGTCAAAGGTTCATATCACCTCGCCGG CGCTTTTCGCAGATTAGCACGTCCTTCATCGCCTCTGACTGCCAGGGCATCCACCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTCACAACCCGAAGATGTTTCTTTC GATTCACCATCGGTTTGCGAAAATTTGAGAGACTCGAACACACATAACATGTGTG TCGTTTCAATTTTCAGCTTGATCCAGATTTTTAAAGAGCAAAACTTCTTAATGCAC TCAAAAGTACATTCAGAAGTTCATCATTCATCAGACAATCTGTGGAGCACTACAA AGGCAGGTTCTTTAAGGTAAGGAGGT 37 Để tìm tương đồng chuổi trình tự với chuỗi trình tự khác ngân hàng gen (genebank) chúng tơi sử dụng chương trình BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAM S=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=b lasthome) NCBI Kết thu được: Kết nhận trình tự có độ tương đồng 99% với Klebsilla pneumoniae subsp Kết sau giải trình tự hai chiều mẫu M4, chúng tơi nhân đoạn gene có trình tự: >TCCGGGTTTCCCCATTCGGACATCGCCGGTTATAACGGTTCATATCACCTTAC CGACGCTTTTCGCAGATTAGCACGTCCTTCATCGCCTCTGACTGCCAGGGCATCCA CCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTCACAACCCGAAGATGTTTCACTTCGTGTCGC GAAAATTTGAGAGACTCGAACACACATTAACTGTGTGTCGTTTCAATTTTCAGCTT GATCCAGATTTTTAAAGAGCAAAATTTCACAATGCACTTTGCAGTACATTTTGAA ATTTATTATTTATCAAACAATCTGTGTGAGCA Để tìm tương đồng chuổi trình tự với chuỗi trình tự khác ngân hàng gen (genebank) chúng tơi sử dụng chương trình BLAST 38 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAM S=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=b lasthome) NCBI Kết thu được: Chuỗi trình tự có độ tương đồng cao 99% với Klebsiella pneumoniae subsp Như kết giải trình tự mẫu Klebsiella pneumoniae subsp Klebsiella vi khuẩn cố định nitơ tương tác Theo Klucas (1991), cố định nitơ tương tác trình trung gian trình cố định nitơ cộng sinh tự Và vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm vi khuẩn sống tự vùng lân cận rễ họ Đậu đến vi khuẩn sống nội sinh mô tế bào thực vật Như số mẫu vi khuẩn phân lập từ nốt sần đậu xanh bị tạp nhiễm, dựa vào vùng bảo tồn (IGS) 16S – 23S rDNA vi khuẩn cố định đạm nên cặp primer chọn không đặc hiệu bắt cặp với Rhizobium sp phân lập 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 24 dòng vi khuẩn nốt sần phân lập từ vùng khác chọn lọc 13 dòng Kết phân lập thu dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc Rhizobium sp: Khuẩn lạc vi khuẩn có màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng Kết thử nghiệm sinh hóa với 13 dòng thu dòng có đặc điểm vi khuẩn Rhizobium sp: dương tính với thử nghiệm khả lên men đường, âm tính với khả tạo Indol, dương tính với khả di động, âm tính với khả phân giải ure, âm tính với phản ứng VP (Voges-Prokauer), dương tính với khả dịch hóa Gelatin Kết phản ứng PCR với cặp primer FGPS 1490 FGPS 132 chưa phát Rhizobium sp Mà khuếch đại đoạn DNA có kích thước khoảng 380 pb, 550 pb vùng bảo tồn (IGS) 16S -23S rDNA Klebsilla pneumoniae subsp 5.2 Đề nghị - Cần có mẫu đối chứng dương điều quan trọng cần thiết - Thiết lập lại quy trình PCR, định danh phân loại đến lồi cho Rhizobium sp nốt sần đậu xanh (Vigna radiata) hồn thiện quy trình 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lê Duy Hoàng Chương 2008 Phân lập định danh vi khuẩn cố định nitơ họ Đậu, Luận văn tốt nghiệp Thư viện trường đại học Nơng lâm Tp Hồ Chí Minh (chưa xuất bản) Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng NXB Nông Nghiệp Tp HCM Trang 195 - 238 Đường Hồng Dật, Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đường, Nguyễn Thị Thanh Phụng, Trần thị Cẩm Vân, Hồng Lương Việt ,1979, Giáo trình vi sinh vật học trồng trọt, NXB Nông nghiệp, trang 152 - 174 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty 2010 Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, trang 320 - 353 Hồ Huỳnh Thùy Dương 2008 Sinh học phân tử NXB Giáo dục Trang 196 - 208 Trịnh Đình Đạt 2006 Cơng nghệ sinh học - Tập bốn Công nghệ di truyền NXB Giáo dục Trang 15 - 61 Nguyễn Minh Hiếu 2003 Giáo trình cơng nghiệp.NXB Nông nghiệp Trang 310 - 322 Nguyễn Ngọc Hải, Nguyễn Thị Kim Loan 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật NXB Nông nghiệp, trang - 65 Trần Cẩm Vân 2001 Giáo trình vi sinh vật học môi trường NXB Đại học quốc gia, Hà Nội, trang 88 - 108 TIẾNG NƯỚC NGOÀI Aegir Thor thorsson, Halldor Sverrisson, Kesara Anamthawat – Jonsson 2000 Genotyping Icelandic isolates of rhizobia based on rDNA-RFLP ICEL AGR SCI 13, pp: 17 - 25 Anton Hartmann And Jose Ivo Baldani 2006 The Genus Azospirillum Prokaryotes, pp:115 - 140 Alan Gibson 4/1995 Tài liệu tập huấn Rhizobium hội thảo quốc tế kỹ thuật Rhizobium Quảng Châu- Trung Quốc Ben Romdhane, Hafedh Nasr Samba-Mbaye, Neyra, Ghorbal 2005 Diversity of Acacia tortilis rhizobia revealed by PCR/PFLP on crushed root nodules in Tunisia Annals of Microbiology, 55 (4), pp: 249 - 258 Balasundaran M 1996 Key Issues in Mycorrhizae and Nitrogen fixing symbionts research, Kerala forest research Institute, Peechi, Trichur 680653, India Beringer J 1974 R factor transfer in Rhizobium leguminosarum Journal of General Microbiology, pp: 188 - 198 Dracourt M.C.Bollet C.,Carta A.and Rousselier P 2001 Phylogentic analyses of Klebsiella species delineate Klebsiella and Raoultella gen.nov.,with description of Raoultella ornithinolytica comb.nov.,Raoultella terrigena comb Nov and Raoultella planticola comb.nov international journal of systematic and Evolutionary Microbiology, vol.51,pp: 925 - 932 Donald A.phillips2,John G Torrey 1972 Studies on Cytokinin Production by Rhizobium Plant Physiol, pp: 11 - 15 41 Etesami, Hossein Ali Alikhani and Nahid Saleh Rastin 2008 The Effect of Superior IAA Producing Rhizobia and Their Combination with Ag and Trp on Wheat Growth Indices World Applied Sciences Journal (3), pp : 272 - 275 25 El-Sheikh E.A.E & Wood M 1990 Effect of salinity on growth, nodulation and nitrogen yield of chickpea (Cicer arietinum L.) Journal of Experimental Botany, pp: 1263 - 1269 10 G Laguerre, Patrick Mavingui,M.Allard, M.Charnay, P Louvrier, S.Mazurier, Lionel.R,N Amarger 1996 Typing of Rhizobia by PCR DNA Fingerprinting and PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of Chromosomal and Symbiotic Gene Regions: Application to Rhizobium leguminosarum and Its Different Biovars Applied and environmental microbiology, Vol 62, No 6, pp: 2029 - 2036 11 Hameed, S., S Yasmin, K.A Malik, Y Zafar and F.Y Hafeez 2004 Rhizobium, Bradyrhizobium and Agrobacterium strains isolated from cultivated legumes Biol Fertil Soils, pp: 179 - 85 12 Howieson, J.G., Malden J., Yates R.J and O’Hara G.W 2000c Techniques for the selection and development of elite inoculant strains of Rhizobium leguminosarum in southernnAustralia Symbiosis 28: 33-48 13 Irum Naz, Asghari Bano and Tamoor – UL – Hassan 2009 Morphological, Biochemical and Molercular characterization of Rhizobia form Halophytes of range salt Khewra and Attock Pak J Bot:., 41 (6), pp: 3159-3168 14 Kristina.L, Endalkachew.W, Zewdu.T, Asa.F 2005 Genetic diversity and phylogeny of rhizobia isolated from agroforestry legume species in southern Ethiopia International juornal of systermatic Evolutionary Microbiology, pp: 1439 - 1452 15 Loon L.C 2007 Plant respones to plant growth-promoting rhizobacteria Springer Euro journal plant pathology, vol.119, pp: 243 - 254 16 Lindemann W.C.,Glover C.R 2008 Nitrogen fixation by legumes Cooperative Extension Service College of Agriculture and Home Economics pages 17 Moulin, L., Munive, A., Dreyfus, B., Biovin-Masson, C 2001 Nodulation of legumes by members of the bold beta -subclass of Proteobacteria, Nature 411, pp: 948 - 950 18 Neeraj, S.S Gaurav, S.C Chatterjee ,Sachin ,Mahesh Chandra 2009 Efficient Nitrogen Fixing Rhizobial Isolate Infecting Vigna radiata l Asian Journal of Agricultural Sciences 1(2), pp: 62-65 29 Nadia Elboutahiri, Imane Thami-Alami, Elhoussine Zaïd and Sripada M.Udupa 2008 Genotypic characterization of indigenous Sinorhizobium meliloti and Rhizobium sullae by rep-PCR, RAPD and ARDRA analyses African Journal of Biotechnology Vol 8, pp: 979 – 985 20 Pinto, F.G.S., Hungariaa, M., Mercante, F.M 2007 Polyphasic characterization of Brazilian Rhizobium tropici strains effective in fixing N2 with common bean (Phaseolus vulgaris L.) Soil Biology and Biochemistry, pp: 1851 – 1864 21 Samuel S Gnamanickam 2006 Plant-Associated bacteria springer,712 pages 22 Shin Okazaki, Nuriyuki Nukui, Masayuki Sugawara, Kiwamu Minamisuwa 2004 Rhizobial strategies to enhance symbiotic interactions: Rhizobitoxine and 1aminocylopropane – 1- carboxy late deamiase Microbes environ Vol.19, No.2,pp: 99 – 11 42 23 Sikora, S., Dedzepovic, S., Bradic, M 2002 Genomic fingerprinting of Bradyrhizobium japonicum isolates by RAPD and rep-PCR Microbiological Research 157, pp: 213 - 219 24 Teaumroong.N, Boonkerd.N 1998 Detection of Bradirhizobium spp and B japonicum in Thailand by primer-based technology and direct DNA extraction Plant Soil, 204, pp: 127 - 134 25.Vincent, J.M 1970 A Manual for the Practical Study of Root Nodule Bacteria, Blackwell Scientific, Oxford 26 Zahran, H.H 1999 Rhizobium-legume symbiosis and nitrogen fixation under severe conditions and in an arid climate Microbiol Mol Biol Rev., pp: 968 - 89 27 Zribi, K., Mhamdi, R., Huguet, T., Aouani, M.E 2004 Distribution and genetic diversty of rhizobia nodulating populations of Medicago truncatula in Tunisian soils Soil Biology and Biochemistry, pp: 903 - 908 INTERNET http://en.wikipedia.org/wiki/rhizobium http://en.wikipedia.org/wiki/Rhizobia http://en.wikipedia.org/wiki/hodau 4.http://www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/daotaotuxa/reference/giaotrinh/sinhthai/ ch uong2.htm http://media-2.web.britannica.com/eb-media/38/6538-004-3E138D9.gif 34 6.http://www.bvom.com/news/vietnam/news/index.asp?.sequence=61360&.this=9 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://www.ebi.ac.uk/tool/clustalw2/index.html http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm 10 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 11 http:// sinhhocvietnam.com/ 12 http://www.phanbonvisinh.htm 13 http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrogen_fixation 14 http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/sinh-ly-hoc-thuc-vat-phan-20-vi-khuan-not-san-congsinh-co-dinh-dam.504757.html 15 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/vi-khuan-not-san-cong-sinh-co-dinhdam.515026.html) 43 ... thực, thực phẩm thi t yếu nhiều biện pháp sử dụng nhằm cải thi n suất trồng, sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học ngày phổ biến Những giải pháp đem lại hiệu nhanh chóng việc cải thi n suất, gia... nitơ tương tác vi khuẩn tham gia vào trình trao đổi chất dinh dưỡng với thực vật không làm thay đổi cấu trúc rễ thực vật Để phân biệt vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh hay tương tác với thực vật... tan acid nucleic Protein bị biến tính khơng hòa tan pha nước có chứa acid nucleic sau ly tâm tủa thành lớp nằm pha nước pha phenol: chloroform Pha nước có chứa acid nucleic thu nhận lại Bước 3: