BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUẨN PHÁT HIỆN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS VÀ STREPTOCOCCUS SUIS TYPE BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Họ Tên sinh viên: CAO ANH THI Ngành: BQCBNS VÀ VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2007 - 2011 Tháng 8/2010 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUẨN PHÁT HIỆN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS VÀ STREPTOCOCCUS SUIS TYPE BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Tác giả CAO ANH THI Khóa luận đƣợc đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp kỹ sƣ ngành Bảo Quản Chế Biến Nông Sản Và Vi Sinh Thực Phẩm Giáo viên hƣớng dẫn: Ths Uông Nguyễn Đức Ninh Tháng năm 2010 LỜI CẢM ƠN  Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM tạo kiện cho em suốt thời gian học tập trƣờng Tồn thể Thầy, Cơ khoa Công Nghệ Thực Phẩm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM trang bị cho em kiến thức quý báu Ban Giám Đốc Viện Pasteur TP.HCM tạo điều kiện thuận lợi để em thực đề tài tốt nghiệp  Đặc biệt em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến: Bs Nguyễn Thị Kim Hoàng, Ths Uông Nguyễn Đức Ninh chị Võ Thị Trang Đài phịng Vi khuẩn hơ hấp, Khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur TP.HCM tận tình hƣớng dẫn, đóng góp ý kiến chân thành suốt thời gian thực báo cáo tốt nghiệp  Xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ tất ngƣời thân gia đình, bạn bè ln nguồn động viên, khích lệ to lớn giúp em vƣợt qua khó khăn suốt thời gian qua TP.HCM, ngày 30 tháng năm 2011 Cao Anh Thi TÓM TẮT LUẬN VĂN Sinh viên thực hiện: Cao Anh Thi, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Ngƣời hƣớng dẫn: Bs Nguyễn Thị Kim Hoàng, Ths ng Nguyễn Đức Ninh Đề tài: “Xây dựng quy trình chuẩn phát Streptococcus suis Streptococcus suis type kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR)” đƣợc thực phịng xét nghiệm Vi Khuẩn Hơ Hấp – Khoa Vi Sinh Miễn Dịch – Viện Pasteur TP.HCM từ tháng 03/2011 đến tháng 07/2011 Đề tài thực phản ứng PCR với cặp mồi 16S-195(s), 16S-489(as) để phát S.suis Mồi đƣợc xây dựng dựa gen mã hóa thành phần câu tạo tiểu đơn vị 30S ribosome S.suis Để phát S.suis type 2, phản ứng PCR sử dụng mồi cps2JF cps2JR để khuếch đại đoạn thuộc gen cps2J mã hóa cho vách tế bào S.suis type Bên cạnh đó, đề tài thử nghiệm kỹ thuật Multiplex PCR để tìm S.suis type so sánh chất lƣợng DNA đƣợc tách chiết kit thƣơng mại từ phƣơng pháp tách nhanh theo quy trình CDC Kết thúc đề tài, chúng tơi có ghi nhận sau đây: Phản ứng PCR có tổng thể tích 25 µl với thành phần nhƣ sau: 1x PCR Buffer, 2,5 units Taq DNA Polymerase, 200 µM cho loại dNTP, 0,4 µM 16S-195(s) 16S489(as), 0,26 µg DNA S.suis Đây quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát S.suis Đối với S.suis type 2, phản ứng thay đổi dùng 0,26 µg DNA S.suis type 2, 0,4 µM cps2JF cps2JR Qua khảo sát với 10 chủng đối chứng S.suis type 9, type 16, nhận định: Mồi cps2JF cps2JR đặc hiệu cho S.suis type với kích thƣớc sản phẩm PCR 236 bp Cặp mồi 16S-195(s), 16S-489(as) đặc hiệu cho S.suis, sản phẩm PCR có kích thƣớc 294 bp Giới hạn cho phản ứng PCR phát S.suis l: LOD (àg DNA/25àl) = 0,00144 ữ 0,00446 So vi phƣơng pháp tách nhanh DNA theo quy trình CDC dùng kit thƣơng mại cho chất lƣợng DNA tốt Phản ứng Multiplex PCR đƣợc xây dựng nhƣ sau: 1x Multiplex PCR Master Mix, 0,4 µM 16S-195(s) 16S-489(as), 0,4 µM 16S-195(s) 16S-489(as), 0,26 µg DNA S.suis type MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT LUẬN VĂN iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC BẢNG vi DANH SÁCH CÁC HÌNH vii CHƢƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nhiễm Streptococcus suis ngƣời giới Việt Nam 2.1.1 Trên giới 2.1.2 Tại Việt Nam 2.2 Tổng quan Streptococcus suis 2.2.1 Hình thể 2.2.2 Tính chất ni cấy 2.2.3 Tính chất sinh hóa 2.2.4 Các yếu tố độc lực 2.2.5 Cƣ trú đƣờng lây truyền 2.2.6 Khả gây bệnh 2.2.6.1 Gây bệnh lợn 2.2.6.2 Gây bệnh ngƣời 2.2.7 Chẩn đoán vi sinh 2.3 Điều trị dự phòng bệnh liên cầu lợn 2.3.1 Điều trị 2.3.2 Dự phòng 2.3.2.1 Phòng bệnh cho lợn 2.3.2.2 Phòng bệnh cho ngƣời 2.4 Giới thiệu kỹ thuật PCR 2.4.1 Lịch sử hình thành 2.4.2 Phản ứng PCR 10 2.4.3 Phân tích sản phẩm PCR điện di gel agarose 11 2.4.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 11 2.4.5 Ƣu điểm hạn chế kỹ thuật PCR 13 2.4.5.1 Ƣu điểm 13 2.4.5.2 Hạn chế 14 2.5 Tổng quan nghiên cứu S.suis 14 CHƢƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 17 3.2 Vật liệu thí nghiệm 17 3.3 Thiết bị dụng cụ 17 3.4 Mơi trƣờng, hóa chất sinh phẩm 19 3.4.1 Môi trƣờng 19 3.4.2 Hóa chất sinh phẩm 19 3.5 Nội dung đề tài 20 3.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 3.6.1 Nuôi cấy 20 3.6.2 Tách chiết DNA 21 3.6.2.1 Tách DNA kit thƣơng mại 21 3.6.2.2 Phƣơng pháp tách DNA nhanh theo quy trình CDC 21 3.6.3 Quy trình thực phản ứng PCR 22 3.6.4 Xây dựng quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát S.suis 23 3.6.4.1 Khảo sát nồng độ mồi tối ƣu 23 3.6.4.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ƣu 23 3.6.4.3 Khảo sát lƣợng DNA tối ƣu 23 3.6.5 Xác định độ đặc hiệu 24 3.6.6 Xác định giới hạn phát (LOD – Limit of Detection) 24 3.6.7 So sánh chất lƣợng DNA từ hai phƣơng pháp tách chiết 24 3.6.8 Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát S.suis type 24 3.6.9 Phản ứng Multiplex PCR phát S.suis type 25 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Xây dựng quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát S.suis 26 4.1.1 Khảo sát nồng độ mồi tối ƣu 26 4.1.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ƣu 26 4.1.3 Khảo sát lƣợng DNA tối ƣu 27 4.2 Xác định độ đặc hiệu 28 4.3 Xác định giới hạn phát (LOD – Limit of Detection) 29 4.4 Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát S.suis type 30 4.5 So sánh chất lƣợng DNA từ hai phƣơng pháp tách chiết 31 4.6 Phản ứng Multiplex PCR phát S.suis type 32 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1: Các mồi dùng cho phản ứng PCR phát S.suis type 1, 2, ½, 16 Bảng 2.2: Cặp mồi đƣợc dùng đề tài 16 Bảng 4.1: Xác định giới hạn phát cho phản ứng PCR phát S.suis 29 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADH : arginine dihydrolase ATCC : American Type Culture Collection bp : base pair ctv : cộng tác viên CDC : Centers for Disease Control and Prevention DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA : Enzym – Linked Immunosorbent Assay LOD : Limit of detection PCR : Polymerase chain reation RT-PCR : Real time PCR RNA : Ribonucleic acid S.suis : Streptococcus suis TP.HCM : Thành phố Hồ Chí Minh TE buffer : Tris-EDTA buffer TBE : Tris Borate EDTA UV : Ultra Violet µg : microgram µl : microliter µm : micrometer µM : micromole/liter mm : milimeter mM : milimole/liter nm : nanometer 16S rDNA : 16S Ribosomal nucleic acid 16S rRNA : 16S Ribosomal ribonucleic acid DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1: S.suis sau nhuộm Gram mẫu bệnh phẩm Hình 2.2: Nuôi cấy S.suis thạch máu tạo tiêu huyết α Hình 2.3: Hình ảnh triệu chứng lâm sàng bệnh nhân nhiễm liên cầu lợn Hình 2.4: Một chu kỳ phản ứng PCR 10 Hình 2.5: Cấu trúc phân tử dNTP 12 Hình 2.6: Các mồi dựa gen cps S.suis type 15 Hình 2.7: Các mồi sử dụng cho phản ứng PCR phát S.suis type 15 Hình 3.1: Bể ủ nhiệt 18 Hình 3.2: Máy ly tâm lạnh 18 Hình 3.3: Máy PCR 18 Hình 3.4: Tủ cấy vi sinh 18 Hình 3.5: Máy chụp hình gel 19 Hình 3.6: Máy điện di 19 Hình 4.1: Khảo sát nồng độ mồi tối ƣu 26 Hình 4.2: Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ƣu 27 Hình 4.3: Khảo sát lƣợng DNA tối ƣu 27 Hình 4.4: Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát S.suis 28 Hình 4.5: So sánh chất lƣợng DNA từ hai phƣơng pháp tách chiết 32 Hình 4.6: Xác định độ đặc hiệu cho S.suis type 33 Hình 4.7: Phản ứng Multiplex PCR phát S.suis type 34 - Primer (hãng Invitrogen):  16S-195 (s); 16S-489(as2)  cps 2JF; cps 2JR 3.5 Nội dung đề tài Nuôi cấy S.suis 10 chủng đối chứng Tách chiết DNA Đối với S.suis type 2, type type 16, tách DNA theo hai phƣơng pháp:  Sử dụng kit tách DNA  Tách nhanh theo quy trình CDC Đối với 10 chủng đối chứng, dùng kit để tách DNA Thực phản ứng PCR  Dùng cặp mồi 16S-195(s) 16S-489(as) - Xây dựng quy trình tối ƣu cho phản ứng PCR phát S.suis - So sánh hai phƣơng pháp tách chiết DNA - Xác định độ đặc hiệu - Xác định giới hạn phát  Dùng cặp mồi cps2JF cps2JR - Xác định độ đặc hiệu - Xác định độ đặc hiệu cho S.suis type Thực phản ứng Multiplex PCR để phát S.suis type  Dùng cặp mồi 16S-195(s), 16S-489(as) cps2JF, cps2JR 3.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.6.1 Nuôi cấy - Nuôi cấy S.suis chủng đối chứng thạch máu (Columbia + 5% máu cừu), riêng Haemophilus influenzae nuôi cấy thạch chocolate có bổ sung polyvitex - Ủ 24 bình nến 370C - Định danh phƣơng pháp sinh hóa (Api Strep) 3.6.2 Tách chiết DNA 3.6.2.1 Tách DNA kit ROCHE (thành phần kit xem phụ lục 4) - Tạo huyền trọc vi khuẩn độ đục 0,5 McFarland nƣớc vô khuẩn pha tiêm - Hút 200 µl chuyển vào eppendorf loại 1,5 ml - Bổ sung 200 µl Binding buffer 50 µl proteinase K → trộn - Ủ 10 phút 720C - Trộn với 100 µl binding buffer, sau hút tồn dịch cho vào cột lọc (High Pure Filter tube) đƣợc gắn cột góp (Collection tube) - Ly tâm 8000 vịng/phút phút - Đổi cột góp (giữ lại cột lọc) cho vào 500 µl Inhibitor Removal buffer - Ly tâm 8000 vịng phút - Đổi cột góp (giữ lại cột lọc) cho vào 450 µl Wash buffer - Ly tâm 8000 vịng phút - Đổi cột góp (giữ lại cột lọc) cho vào 450 µl Wash buffer - Ly tâm 8000 vịng phút, sau ly tâm 14000 vòng 10 giây - Bỏ cột góp, giữ lại cột lọc, gắn vào eppendorf loại 1,5 ml; cho vào 50 µl Elution buffer - Ly tâm 8000 vòng phút - Bỏ cột lọc, ta có đƣợc 50 µl DNA tinh eppendorf Bảo quản DNA -150C đến -250C 3.6.2.2 Phƣơng pháp tách nhanh DNA theo quy trình CDC - Tạo huyền trọc vi khuẩn với độ đục 0,5 McFarland nƣớc muối sinh lý (0,85% NaCl) hấp khử trùng, cho vào eppendorf loại 1,5 ml - Ủ 15 phút 700C - Ly tâm 14000 vòng phút, loại bỏ dịch - Bổ sung 40 µl TE buffer, 20 µl mutanolysin (1500 U/µl) µl hyaluronidase (30 mg/ml) → trộn - Ủ 370C 30 phút đến 24 Sau đun 10 phút nƣớc sơi 1000C - Ly tâm 14000 vịng phút - Lấy dịch chuyển vào eppendorf 1,5 ml, ta đƣợc DNA tinh Bảo quản DNA -200C sử dụng khơng q 2,5 µl DNA phản ứng PCR (http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/files/pcr-DNA-extraction-culture-May2009.pdf) 3.6.3 Quy trình thực phản ứng PCR Tổng thể tích phản ứng 25 µl Pha trộn thành phần hệ đệm cho phản ứng PCR vào eppendorf loại 200 µl nhƣ sau: Thành phần Thể tích Nồng độ PCR Buffer 10 µl dNTP µl 200µM DNA Polymerase 0,5 µl 2,5 units 1x (Tris HCl, KCl, (NH4)2SO4 1,5 mM MgCl2) Sau bổ sung vào phản ứng MgCl2 (nếu cần muốn tăng nồng độ Mg2+), mồi RNase-free water Lƣợng RNase-free water sử dụng cho phản ứng đƣợc tính theo cơng thức sau: VRNase-free water = 25 – (VTopTaq PCR Buffer + VdNTP + VTopTaq DNA Polymerase + VMgCl2 + Vmồi + VDNA) Bƣớc cuối hịa trộn µl DNA vào phản ứng tủ an toàn sinh học khác Chỉ sử dụng DNA S.suis tách theo phƣơng pháp nhanh để so sánh chất lƣợng DNA từ hai phƣơng pháp Tất phản ứng PCR sử dụng DNA tách kit thƣơng mại Đối với DNA S.suis đƣợc tách kit, nồng độ DNA thu đƣợc 1300 µg/ml thể tích mẫu Các tube chứa thành phần phản ứng DNA đƣợc giữ đá suốt trình thực Khi thực phản ứng PCR cần có chứng âm Chứng âm có đầy đủ thành phần phản ứng PCR nhƣng không chứa DNA mà đƣợc thay RNase-free water Mục đích chứng âm kiểm tra thành phần phản ứng PCR nhƣ thao tác q trình có bị nhiễm khơng Để eppendorf vào phận ủ máy PCR chạy chu trình nhiệt nhƣ sau: Khi sử dụng cặp mồi 16S-195(s) 16S-489(as2) để phát S.suis 940C phút 940C 30 giây 600C 30 giây 940C phút 40 chu kỳ (Nguồn: Bin Chang, Akihito Wada, 2008) Sử dụng cặp mồi cps 2JF cps 2JR để phát S.suis type 940C phút 940C 30 giây 630C 30 giây 720C phút 720C 10 phút 35 chu kỳ Pha gel agarose nồng độ 2% TBE nồng độ 0,5x nhuộm với Ethidium bromide Đổ gel vào khn có gắn lƣợc để tạo giếng gel Khi gel đông cứng, bỏ gel vào máy điện di có chứa TBE 0,5x làm dung dịch đệm điện di Trộn µl sản phẩm PCR với µl “Loading dye” giấy parafilm, sau cho vào giếng gel Điện di 50 phút điện 100V Đọc kết máy chụp hình gel 3.6.4 Xây dựng quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát Streptococcus suis 3.6.4.1 Khảo sát nồng độ mồi tối ƣu Thực phản ứng PCR tƣơng ứng với nồng độ cho cặp mồi 16S-195(s), 16S-489(as2) là: 0,8 µM; 0,4 µM; 0,24 µM 0,16 µM Phản ứng không bổ sung thêm MgCl2 sử dụng 0,26 µg DNA S.suis (không quan tâm đến serotype) cho phản ứng Ghi nhận kết phản ứng dƣơng tính hay âm tính, so sánh vạch sản phẩm PCR Với phản ứng PCR dƣơng tính, chọn nồng độ mồi thấp mà cho hình ảnh vạch sản phẩm rõ nét 3.6.4.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ƣu Sử dụng nồng độ mồi tối ƣu chọn 3.6.4.1 0,26 µg DNA để thực phản ứng PCR khảo sát với nồng độ MgCl2 nhƣ sau: 1,5 mM; mM; 2,5 mM; mM; 3,5 mM; mM; 4,5 mM; mM So sánh hình ảnh vạch sản phẩm PCR, nhận xét mức độ ảnh hƣởng nồng độ Mg2+ đến lƣợng sản phẩm lựa chọn nồng độ MgCl2 tối ƣu cho phản ứng 3.6.4.3 Khảo sát lƣợng DNA tối ƣu Pha loãng DNA S.suis RNase-free water thành dãy nồng độ thập phân (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7) Các mẫu pha loãng đƣợc đo số OD với bƣớc sóng 260 nm Giá trị mật độ quang bƣớc sóng 260 nm (OD260nm) mẫu cho phép xác định nồng độ nucleic acid mẫu đơn vị OD260nm tƣơng ứng với nồng độ 50 µg/ml Nồng độ DNA mẫu đƣợc tính theo cơng thức sau: CDNA (µg/ml) = OD260nm x 50 x Độ pha loãng Thực phản ứng PCR, sử dụng µl DNA bậc pha loãng nồng độ mồi, nồng độ MgCl2 tối ƣu chọn 3.6.4.1 3.6.4.2 Nhận xét ảnh hƣởng lƣợng DNA đến kết phản ứng PCR Qua lựa chọn lƣợng DNA cần dùng để có kết hình ảnh sản phẩm tốt Từ 3.6.4.1, 3.6.4.2 3.6.4.3, đƣa thành phần tối ƣu cho phản ứng PCR phát S.suis Xây dựng quy trình chuẩn, sử dụng quy trình để xác định giới hạn phát độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát S.suis hay S.suis type 3.6.5 Xác định độ đặc hiệu Sử dụng DNA S.suis 10 chủng đối chứng để thực 11 phản ứng PCR Phản ứng có nồng độ thành phần dựa quy trình chuẩn đƣợc xây dựng 3.6.4 Đọc kết điện di, ghi nhận phản ứng PCR dƣơng tính hay âm tính Kết luận cặp mồi 16S-195(s) 16S-489(as2) có đặc hiệu cho S.suis hay không 3.6.6 Xác định giới hạn phát (LOD – Limit of Detection) DNA S.suis đƣợc pha loãng bậc 10 thành dãy nồng độ RNase-free water Với nồng độ, thực phản ứng PCR lặp lại lần Thành phần phản ứng dựa quy trình chuẩn phát S.suis Sau tính tỷ lệ phần trăm cho số lƣợng phản ứng dƣơng tính độ pha lỗng, từ xác định giới hạn phát dựa theo định nghĩa sau: Giới hạn phát (LOD) nồng độ gây nhiễm nằm hai nồng độ mà có nhiều 50% kết dƣơng tính phát ghi nhận đƣợc (Theo Trung tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lƣờng Chất Lƣợng 3) 3.6.7 So sánh hai phƣơng pháp tách chiết DNA Đối với DNA phƣơng pháp tách chiết, ta pha loãng thành dãy nồng độ thập phân Dựa quy trình chuẩn để thực phản ứng PCR tƣơng ứng với bậc pha loãng Xác định nồng độ pha loãng thấp mà cho kết phản ứng PCR dƣơng tính so sánh chất lƣợng DNA từ hai phƣơng pháp 3.6.8 Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát S.suis type Dƣa quy trình chuẩn phát S.suis kỹ thuật PCR để thực phản ứng phát S.suis type Tuy nhiên thay mồi 16S-195(s) 16S-489(as2) cặp mồi cps2JF, cps2JR Để xác định độ đặc hiệu, ta khảo sát với 10 chủng đối chứng, S.suis type type 16 Đọc kết điện di, ghi nhận phản ứng PCR dƣơng tính hay âm tính Kết luận cặp mồi cps2JF cps2JR có đặc hiệu cho S.suis type hay không 3.6.9 Phản ứng Multiplex PCR phát S.suis type Sử dụng kit Multiplex PCR Master Mix để thực phản ứng đa mồi phát S.suis type Ta pha trộn thành phần phản ứng eppendorf loại 200 µl theo thứ tự sau: Buffer PCR nồng độ 1x (Taq DNA Polymerase, với mM MgCl2, dNTP Mix) 0,4 µM 16S-195(s) 16S-489(as2) 0,4 µM cps 2JF cps 2JR RNase-free water Sau hịa trộn µl DNA S.suis type vào phản ứng tủ an toàn sinh học khác Phản ứng PCR đƣợc thực với chu trình nhiệt nhƣ sau: 940C 30 giây 600C 30 giây 720C phút 40 chu kỳ (Nguồn: C Marois ctv, 2004) Đọc kết phản ứng dƣơng hay âm tính với sản phẩm PCR có kích thƣớc 294 bp 236 bp So sánh hình ảnh vạch sản phẩm kết dƣơng tính Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xây dựng quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát S.suis 4.1.1 Khảo sát nồng độ mồi tối ƣu M (-) 294 bp Hình 4.1: Khảo sát nồng độ mồi tối ƣu M: Maker (Ladder 100 bp + Loading dye + RNase free water); ( - ): chứng âm; 1: nồng độ mồi 0,8 µM; 2: nồng độ mồi 0,4 µM; 3: nồng độ mồi 0,24 µM; 4: nồng độ mồi 0,16 µM Nhận xét: Phản ứng thứ cho kết gần nhƣ âm tính Vạch sản phẩm PCR phản ứng thứ mờ So sánh kết phản ứng : lƣợng mồi dùng cho phản ứng thứ mà cho hình ảnh sản phẩm tốt nên chúng tơi chọn nồng độ mồi tối ƣu 0,4 µM 4.1.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ƣu Nhận xét: Xem hình 4.2, từ phản ứng đến cho kết hình ảnh rõ nét Riêng phản ứng thứ 8, nồng độ Mg2+ cao ức chế phản ứng PCR làm hình ảnh sản phẩm không tốt, bị đứt gãy Chúng chọn nồng độ Mg2+ 1,5 mM làm nồng độ tối ƣu, phản ứng sử dụng mức nồng độ thấp mà cho hình ảnh sản phẩm tốt Khi tiến hành xét nghiệm mẫu bệnh phẩm kỹ thuật PCR, thay đổi nồng độ Mg2+ để tăng khả phát M 294 bp Hình 4.2: Khảo sát nồng độ MgCl2 M: Maker; Giếng 1,2,3,4,5,6,7,8 tƣơng ứng độ Mg2+ 1,5 ; ; 2,5; 3; 3,5 ;4 ; 4,5 mM 4.1.2 Khảo sát lƣợng DNA tối ƣu M 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 294 bp Hình 4.3: Khảo sát lƣợng DNA tối ƣu M: Maker; 1: DNA khơng pha lỗng 100 (0,26 µg DNA/phản ứng); 2: DNA độ pha loãng 10-1; 3: DNA độ pha loãng 10-2; 4: DNA độ pha loãng 10-3; 5: DNA độ pha loãng 10-4 ; 6: DNA độ pha loãng 10-5; 7: DNA độ pha loãng 10-6 Nhận xét: Tại độ pha loãng 10-4, phản ứng PCR cho kết gần nhƣ âm tính, vạch sản phẩm mờ Mặc dù kết phản ứng PCR dƣơng tính độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3 nhƣng hình ảnh vạch sản phẩm khơng rõ nét Do khơng pha lỗng DNA, sử dụng µl DNA S.suis đƣợc tách chiết từ huyền dịch vi khuẩn có độ đục 0,5 McFarland hay lƣợng DNA tối ƣu 0,26 µg DNA/phản ứng M Từ kết mục 4.1.1, 4.1.2 4.1.3, chúng tơi xây dựng đƣợc quy trình chuẩn phát S.suis kỹ thuật PCR Phản ứng với tổng thể tích 25 µl có thành phần nhƣ sau: 1x PCR Buffer (Tris HCl, KCl, (NH4)2SO4 1,5 mM MgCl2) 2,5 units DNA Polymerase 200 µM cho loại dNTP 0,4 µM 16S-195(s) 16S-489(as2) 0,26 µg DNA/phản ứng 4.2 Xác định độ đặc hiệu 10 11 (-) M 294 bp Hình 4.4: Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát S.suis M: Maker; (-): chứng âm; 1: Haemophilus influenzae ATCC 10211, 2: Staphylococcus epidermis ATCC 12228; 3: Staphylococcus aureus ATCC 25923; 4: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619; 5: Escherichia coli ATCC 35218; 6: Acinetobacter baumannii ; 7: Neisseria meningtidis ATCC 13077; 8: Klebsiella pneumoniae ATCC 35657; 9: Streptococcus agalactiae ATCC 13813; 10: Streptococcus pyogenes ATCC 19615; 11: S.suis Nhận xét: Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 16S-195(s) 16S-489(as) cho kết dƣơng tính S.suis Nhƣ qua khảo sát với 10 chủng đối chứng, kết luận cặp mồi 16S-195(s) 16S-489(as) đặc hiệu cho S.suis 4.3 Xác định giới hạn phát (LOD – Limit of Detection) Độ pha lỗng Dƣơng tính Âm tính Tỉ lệ % dƣơng tính 100 100% 10-1 100% 10-2 80% 10-3 40% 10-4 20% 10-5 0% 10-6 0% 10-7 0% Bảng 4.1: Xác định giá trị LOD cho phản ứng PCR phát S.suis Nhận xét: Từ kết bảng 4.1, ta lựa chọn độ pha loãng 10-2 10-3 để tìm giới hạn phát Nồng độ DNA dung dịch mẫu độ pha lỗng 10-2, 10-3 có giá trị lần lƣợt 22,3 µg/ml 7,2 µg/ml Tổng thể tích phản ứng PCR 25 µl lƣợng DNA đƣợc sử dụng cho phản ứng µl Vậy giới hạn phát cho phản ứng PCR phát S.suis là: LOD (µg DNA/25µl) = 0,00144 ÷ 0,00446 4.4 So sánh hai phƣơng pháp tách chiết DNA Nhận xét:  Xem hình 4.4 A, ta nhận thấy với độ pha loãng 10-4 DNA S.suis đƣợc tách kit thƣơng mại, kết phản ứng PCR mờ, gần nhƣ âm tính Hình ảnh vạch sản phẩm PCR rõ nét từ độ pha loãng 10-1 đến 10-3  Trong hình 4.4 B, phản ứng PCR phát S.suis cho kết dƣơng tính từ độ pha loãng 10-1 đến 10-3  DNA S.suis đƣợc chiết tách từ huyền dịch vi khuẩn có độ đục 0,5 McFarland phƣơng pháp Phản ứng PCR sử dụng DNA tách kit cho kết dƣơng tính độ pha lỗng 10-4 Phƣơng pháp tách nhanh cho kết dƣơng tính từ độ pha lỗng 10-1 đến 10-3  Nhƣ vậy, sử dụng kit thƣơng mại để tách chiết cho dung dịch mẫu có nồng độ DNA cao so với phƣơng pháp tách nhanh Điều có nghĩa chất lƣợng DNA đƣợc tách từ kit tốt Đối với mẫu bệnh phẩm nên sử dụng kit thƣơng mại để tách chiết DNA  Trong quy mơ phịng thí nghiệm, phƣơng pháp tách nhanh đƣợc sử dụng phổ biến lợi ích mặt kinh tế Và kỹ thuật áp dụng cho việc tách DNA vi khuẩn từ môi trƣờng nuôi cấy A 100 M 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 294 bp B M 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Hình 4.4: So sánh chất lƣợng DNA từ hai phƣơng pháp tách chiết Hình 4.4 A: Phản ứng PCR sử dụng DNA S.suis tách kit Hình 4.4 B: Phản ứng PCR sử dụng DNA S.suis tách theo phƣơng pháp nhanh M: Maker; 1: DNA khơng pha lỗng; 2: DNA độ pha loãng 10-1; 3: DNA độ pha loãng 10-2; 4: DNA độ pha loãng 10-3; 5: DNA độ pha loãng 10-4 ; 6: DNA độ pha loãng 10-5; 7: DNA độ pha loãng 10-6 4.5 Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát S.suis type A (-) M 236 bp B 10 11 M 236 bp Hình 4.7: Xác định độ đặc hiệu cho S.suis type Hình 4.7 A: M: Maker; (-): chứng âm; 2: S.suis type 2; 3: S.suis type 9; 4: S.suis type 16 Hình 4.7 B: M: Maker; 1: S.suis type 2; 2: Streptococcus pyogenes ATCC 19615; 3: Streptococcus agalactiae ATCC 13813; 4: Klebsiella pneumoniae ATCC 35657; 5: Neisseria meningtidis ATCC 13077; 6: Acinetobacter baumannii; 7: Escherichia coli ATCC 35218; 8: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619; 9: Staphylococcus aureus ATCC 25923; 10: Staphylococcus epidermis ATCC 12228; 11: Haemophilus influenzae ATCC 10211 Nhận xét: Trong hình 4.7 A, có giếng xuất vạch sản phẩm 236 bp Tƣơng tự, hình 4.7 B, có S.suis type cho kết PCR dƣơng tính Do có số hạn chế nên khảo sát S.suis type 2, type 9, type 16 10 chủng đối chứng Qua kết kết luận cặp mồi cps 2JF cps 2JR đặc hiệu cho S.suis type Kết tƣơng tự với báo cáo Wisselink ctv (2002) 4.6 Phản ứng Multiplex PCR phát S.suis type M 294 bp 236 bp Hình 4.8: Phản ứng Multiplex PCR phát S.suis type M: Maker; : Phản ứng Multiplex PCR (dùng DNA S.suis type cặp mồi 16S-195(s), 16S-489(as); cps2JF, cps2JR) Nhận xét: Vào năm 2004, C Marois ctv phát triển kỹ thuật Multiplex PCR phát S.suis type hai cặp mồi 16S-195(s), 16S-489(as) cps 2J-s, cps 2J-as Chúng tham khảo sử dụng chu trình nhiệt từ báo để thực phản ứng Multiplex PCR với mục đích phát S.suis type Tuy nhiên thay cặp mồi cps 2J-s, cps 2J-as cps 2JF cps 2JR Phản ứng cho kết dƣơng tính, hình ảnh vạch sản phẩm rõ nét kích thƣớc 236 bp 294 bp Cơng thức phản ứng đƣợc xem quy trình chuẩn để phát S.suis type kỹ thuật Multiplex PCR Ƣu điểm kỹ thuật vừa phát S.suis, đồng thời định danh đƣợc serotype chúng (nếu thay đổi cps 2JF cps 2JR cặp mồi đặc hiệu riêng cho type) Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đề tài chúng tơi hồn thành mục tiêu đề thu đƣợc kết nhƣ sau: Xây dựng đƣợc quy trình chuẩn để phát S.suis kỹ thuật PCR Kích thƣớc sản phẩm PCR 294 bp Phản ứng đƣợc thực với công thức sau: Thành phần Thể tích/phản ứng Nồng độ PCR Buffer 10 µl 1x DNA Polymerase 0,5 µl 2,5 units dNTP mix µl 200 µM 16S-195(s) 0,5 µl 0,4 µM 16S-489(as) 0,5 µl 0,4 µM RNase-free water 6,5 µl - DNA S.suis µl 0,26 µg/phản ứng Tổng thể tích 25 µl - Cơng thức quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát S.suis type Tuy nhiên phản ứng dùng cặp mồi cps2JF cps2JR sản phẩm PCR có kích thƣớc 236 bp Khảo sát với 10 chủng vi sinh vật đối chứng, đề tài góp phần khẳng định tính đặc hiệu cặp mồi 16S-195(s) 16S-489(as) S.suis; cps2JF cps2JR cho S.suis type Giới hạn phát cho phản ứng PCR phát S.suis là: LOD (µg DNA/25µl) = 0,00144 ÷ 0,00446 So với phƣơng pháp tách nhanh DNA theo quy trình CDC dùng kit thƣơng mại cho dung dịch mẫu có nồng độ DNA cao hơn, nhƣ chất lƣợng tốt Thực phản ứng PCR cho S.suis type type 16 với cặp mồi cps2JF, cps2JR Thí nghiệm chứng minh tính đặc hiệu cặp mồi việc định danh serotype S.suis Xây dựng quy trình phát S.suis type kỹ thuật Multiplex PCR hai cặp mồi 16S-195(s), 16S-489(as) cps2JF, cps2JR Thành phần Thể tích/phản ứng Multiplex PCR Master Mix Nồng độ PCR buffer 12,5 µl (Taq DNA Polymerase; dNTP mix mM MgCl2) 16S-195(s) 0,5 µl 0,4 µM 16S-489(as) 0,5 µl 0,4 µM cps2JF 0,5 µl 0,4 µM cps2JR 0,5 µl 0,4 µM RNase-free water 5,5 µl - DNA S.suis type µl 0,26 µg/phản ứng Tổng thể tích 25 µl - 5.2 Đề nghị  Khảo sát thêm hai yếu tố Taq DNA Polymerase dNTP để xây dựng quy trình chuẩn phát S.suis hay S.suis type kỹ thuật PCR  Khi có điều kiện, thực thí nghiệm đề tài mẫu bệnh phẩm  Để tăng khả phát xét nghiệm mẫu bệnh phẩm kỹ thuật PCR thay đổi nồng độ Mg2+  Khảo sát thêm bậc pha loãng DNA khác để có đƣợc khoảng giới hạn phát gần  Nên sử dụng bô kit thƣơng mại tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm  Với quy mơ phịng thí nghiệm, đặc biệt làm chứng dƣơng, dùng phƣơng pháp tách nhanh DNA theo quy trình CDC lợi ích mặt kinh tế Tuy nhiên khơng nên sử dụng DNA pha lỗng bậc 10 vƣợt nồng độ 10-3  Có thể sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR cho việc xét nghiệm chẩn đoán mẫu bệnh phẩm ...XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUẨN PHÁT HIỆN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS VÀ STREPTOCOCCUS SUIS TYPE BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Tác giả CAO ANH THI Khóa luận đƣợc đệ trình để... tài: ? ?Xây dựng quy trình chuẩn phát Streptococcus suis Streptococcus suis type kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR)? ?? đƣợc thực phòng xét nghiệm Vi Khuẩn Hô Hấp – Khoa Vi Sinh Miễn Dịch – Vi? ??n... S .suis type phản ứng đa mồi 1 .2 Mục đích đề tài mục tiêu nghiên cứu 1 .2. 1 Mục đích Xây dựng quy trình phát Streptococcus suis Streptococcus suis type kỹ thuật PCR 1 .2. 2 Mục tiêu nghiên cứu - Xây