Vai trò real-time PCR chẩn đốn tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp Phạm Hùng Vân* *Chủ Tịch Hội Vi Sinh Lâm Sàng TP HCM Chủ Tịch Chi Hội SHPT Y Khoa Việt Nam Trưởng Đơn Vị Vi Sinh – SHPT Lâm Sàng BV NTP Quệt MŨI SAU Phát virus QUYỆT HỌNG Không ý nghĩa ĐÀM hay BỆNH PHẨM CÓ ĐÀM CẤY DNT Màng não Máu DỊCH MÀNG PHỔI Màng phổi CẤY MÁU Thách thức cấy đàm  Phải bắt vi khuẩn gây bệnh từ mẫu tạp nhiễm, phải lấy bệnh phẩm đàm phải đánh giá để chọn vi khuẩn gây bệnh mọc mặt thạch phân lập  Có nhiều loại vi khuẩn gây bệnh khó mọc, phải cấy có đủ loại môi trường cần thiết Lấy bệnh phẩm đàm  Phải hướng dẫn bệnh nhân lấy đàm,  Phải có phương tiện phương pháp lấy đàm bệnh nhân khạc đàm  Phải lấy đàm chẩn đoán trước dùng kháng sinh  Phải đánh giá đại thể mẫu đàm rước gửi mẫu đến phòng xét nghiệm ? ? ? ? Chọn vi khuẩn gây bệnh Nguyên tắc chọn VK gây bệnh  Ưu tiên 1: Chọn vi khuẩn phù hợp với hình ảnh vi khuẩn thấy vùng bạch cầu phết nhuộm Gram mẫu đàm  Ưu tiên 2: Chọn vi khuẩn ưu (định lượng hay bán định lượng Lưu ý: Vi khuẩn có số lượng nhiều khơng phải vi khuẩn gây bệnh mà VK quần cư, vi khuẩn thường trú hầu họng (Streptococci tiêu huyết ) Song cầu Gram [+] giống S pneumoniae Trực khuẩn Gram [-] nhỏ giống H influenzae Song cầu Gram [-] giống M catarrhalis Trực khuẩn Gram [-] nhỏ giống H influenzae LÝ DO NUÔI CẤY THẤT BẠI  S pneumoniae, H influenzae chủ yếu khơng dễ ni cấy, đòi hỏi mơi trường phân lập có sẵn  Bệnh phẩm cấy  Bệnh nhân dùng kháng sinh trước  Mẫu không tin cậy lẫn nước bọt (tạp khuẩn hầu họng)  Không biết cách đánh giá kết nuôi cấy để chọn VK gây bệnh Cấy máu Thách thức cấy máu  Cấy máu phương tiện tốt xác định tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi (CAP), nhiên tất trường hợp CAP cấy máu [+] (Tối đa 14-16%)  Coi chừng ngoại nhiễm cấy máu Kết [+] 24 giờ, hay chai cấy [+] loại VK thường ngoại nhiễm  Kết cấy máu phải kịp thời, muống phải dùng phương tiện thích hợp phải có qui trình trả kết nhanh PCR so với nuôi cấy phát tác nhân vi khuẩn Nuôi cấy S pneumoniae H Influenzae M catarrhalis Pos Neg Pos Neg Pos 43 62 Pos Neg PCR Neg 201 185 234 Takahashi et al BMC Infectious Diseases 2013, 13:296 Tỷ lệ phát tác nhân gây bệnh ĐỊNH LƯỢNG >105/ml 124 bệnh nhân VPCĐ nhập viện 1/14-4/14 khoa hô hấp bv NTP 64.5% Trần thị Thanh Vy (2013) Luận văn ThS vi sinh Tác nhân gây bệnh ĐỊNH LƯỢNG CAO NHẤT VÀ >105/ml Influenzavirus A 1% B pertussis 4% VKKĐH 38% Parainfluenzavirus 1% Parainfluenzavirus 1% Respiratory Syncitial Virus 1% Chlamydia 13% S pneumoniae 39% Mycoplasma 21% H influenzae 14% M catarrhalis 5% Trần thị Thanh Vy (2013) Luận văn ThS vi sinh Tỷ lệ phối hợp VK khơng điển hình với tác nhân gây bệnh S pnemoniae H influenzae Nnghiên cứu 124 trường hợp viêm phổi cộng đồng nhập viện BV NTP 45.45 29.03 S pneumoniae (N=30) H influenzae (N=11) Trần thị Thanh Vy (2013) Luận văn ThS vi sinh Real-time PCR so với nuôi cấy phát tác nhân VK gây HAP A baumannii S pneumoniae Mycoplasma MRSA PCR [+] PCR [-] Cấy [+] Cấy [-] Cấy [+] 0 Cấy [-] Cấy [+] 0 Cấy [-] Cấy [+] 0 Cấy [-] Đang nghiên cứu với BV NĐ1 N = 26 Tác nhân vi sinh gây viêm phổi không đáp ứng điều trị trẻ nhỏ N=32 ĐỊNH LƯỢNG >105/ml kết [+] kết [-] 87.5% Bùi Lê Hữu Bích Vân (2015) Luận văn Thạc Sĩ nhi Thực BV NĐ1 Tác nhân gây bệnh ĐỊNH LƯỢNG CAO NHẤT VÀ >105/ml Không phát tác nhân 12.5% H influenzae 6.25% E coli 3.13% K pneumoniae 6.25% RSV 3.13% Para-INF3 Virus 6.25% B pertussis 3.13% M pneumoniae 9.38% S pneumoniae 50% Xác định tác nhân gây bệnh ĐỊNH LƯỢNG >105/ml NO 12.5 KLP 3.13 Eco 3.13 RSV 3.13 BP 3.13 MP 3.13 PNE+pInf3+ADV+Eco 3.13 PNE+pInf3+KLP 3.13 PNE+InfA+KLP 3.13 PNE+pINF3+KLP+Eco 3.13 PNE+pInf3 3.13 PNE+MP 15.63 PNE 34.38 HIN+PSA 3.13 HIN 3.13 So sánh real-time nuôi cấy Nuôi cấy S pneumoniae H influenzae E coli K pneumoniae P aeruginosa PCR + - + 21 - 11 + 1 - 30 + - 29 + - 29 + - 31 Bùi Lê Hữu Bích Vân (2015); Luận văn Thạc Sĩ nhi; Thực BV NĐ1 Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thùy trẻ em  Trẻ em bị viêm phổi thùy  Mẫu NTA tin cậy qua thang điểm Barlett  Thực real-time PCR phát 28 tác nhân vi sinh (bao gồm tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện)  Vật liệu, phương pháp kiểm soát chất lượng real-time PCR nghiên cứu trước Luận văn Thạc Sĩ nhi Thực BV NĐ1 (2016) 80 70 Vi khuẩn gây bệnh 69.2 60  52 trường hợp làm nghiệm real-time PCR 55.8 50  Phát tác nhân 100% trường hợp 40  Khơng có trường hợp ni cấy [+] 30 20 13.5 7.7 10 xét N=36 N=29 N=7 N=4 3.9 3.9 N=2 N=2 Tác nhân gây bệnh Phân tích trường hợp đơn đa nhiễm Tác nhân MP MP+MRSA PNE+MRSA PNE+MP PNE+MP+MR PNE+MP+HI+MR PNE+MP+HI PNE+HI+MR PNE+HI PNE TB TB+PNE+MP Tổng cộng Số cas % 21 1 11 1 1 52 40.38 1.92 1.92 21.15 1.92 1.92 1.92 3.85 5.77 15.38 1.92 1.92 100.00 PNE: S pneumoniae, MP: M pneumoniae, HI: H influenzae, MR: M catarrhalis, MRSA: Methicillin Resistant S aueus, TB: M tuberculosis NHẬN ĐỊNH  Tác nhân vi sinh chủ yếu gây CA-LRTI S pneumoniae, H influenzae, M catarrhalis  Tuy nhiên tác nhân vi khuẩn không điển hình đóng vai trò đáng kể  Tiếp cận sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật real-time PCR cần thiết giúp lâm sàng định điều chỉnh KS bước đầu giúp điều trị thành công tránh lạm dụng kháng sinh  Giải pháp khả thi nhờ: o “streamline real-time PCR” o Giá thành chấp nhận (không 50.000USD) o Nhiều phòng thí nghiệm có real-time PCR NKARI AtypBac NKARI Virus S aureus SCN E coli K pneumoniae P aeruginosa A baumannii E faecalis E faecium ComBac Influenzavirus A Influenzavirus B Parainfluenzavirus RSV, HMPV Adenovirus NKARI B pertussis B parapertussis L pneumophila M pneumoniae C pneumoniae C psittacii C trachomatis M catarrhalis S pneumoniae H influenzae S agalactiae S pyogenes Streamline real-time PCR Bệnh phẩm lấy từ đường hô hấp Tách chiết DNA/RNA Real-time PCR Real-time RT-PCR NKARI NosoBac