BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CAO CHIẾT THÔ SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐẾN SỰ TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC THẦN KINH Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHAN THỊ NGỌC YÊN Niên khóa : 2008 - 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CAO CHIẾT THÔ SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐẾN SỰ TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC THẦN KINH Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS PHẠM VĂN PHÚC PHAN THỊ NGỌC YÊN Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn ba mẹ cho sống quý giá Hạnh phúc ba mẹ ln hiểu chỗ dựa vững cho vững bước đường chọn Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho em Với tất lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn thầy Phan Kim Ngọc, thầy Phạm Văn Phúc hướng dẫn, động viên, quan tâm tạo điều kiện để em hồn thành khoá luận Em xin chân thành cảm ơn anh Vương Gia Tuệ, chị Hồng Nhung giúp đỡ, quan tâm động viên em suốt trình làm khóa luận Anh chị tận tình hướng dẫn cho em vấn đề chuyên môn cho em biết nhiều điều sống Xin cảm ơn tập thể bạn phòng thí nghiệm, bạn Tuấn, H SH, cám ơn bạn sinh viên thực tập ng, Long, Triết Các bạn chia s động viên tơi suốt q trình làm khóa luận Cám ơn sống mang đến cho người bạn, chúc bạn vững bước đường Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2012 Phan Thị Ngọc ên TĨM TẮT Các bệnh thối hóa thần kinh bệnh thường gặp người lớn tuổi Trong đó, bệnh Parkinson Alzheimer ý nhiều Cho đến đầu kỉ , nhà khoa học cho tổn thương não khơng thể chữa trị cho hệ thần kinh trung ương tạo tế bào thần kinh Gần đây, nhiều nghiên cứu phát chứng minh có diện ổ tế bào gốc bên não trưởng thành Các tế bào gốc có khả biệt hóa thành tế bào thần kinh thay tế bào bị não o đó, cấy ghép tế bào hay kích hoạt tế bào gốc nội sinh tăng sinh biệt hóa hướng nghiên cứu đầy tiềm việc điều trị bệnh thối hóa thần kinh Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu sử dụng tế bào gốc thần kinh trong thử nghiệm sàng lọc sản phẩm hóa học thiên nhiên cảm ứng tăng sinh biệt hóa tế bào Phương pháp giúp xác định phân tử nhỏ có vai trò thúc đẩy phát sinh thần kinh, từ tìm loại thuốc điều trị bệnh suy thoái thần kinh người Trong nghiên cứu này, tế bào gốc thần kinh phân lập từ thai chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino) 14 ngày Các tế bào nuôi mơi trường khơng huyết có bổ sung EGF, FGF–2, B27, N2, heparin, insulin transferrin Tế bào ứng viên chứng minh có khả tự làm mới, khả biệt hóa thành astrocyte biểu marker nestin tế bào gốc thần kinh Tiếp theo, tế bào gốc thần kinh khảo sát với cao chiết thô sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) nồng độ cao chiết khác là10 µg/ml, nồng độ µg/ml, µg/ml Kết cho thấy µg/ml tỷ lệ tăng kích thước neurosphere cao Tế bào chết nồng độ dược liệu cao hàm lượng dung môi methanol cao gây độc tế bào i SUMMARY Nervous system and neurodegenerative diseases are still among the most mysteries in physiology and pathology Before the late 1900s, the central nervous system was strongly considered to be undividable But later, this point of view have changed due to a series of papers about the neurogenesis in aldult brain Many evidences showed that there was a small population of stem cells in brain that would self-renew and recover the cell loss in brain Since first described by Weiss and Reynolds in 1992, neural stem cells have gradually attracted many researchers from all over the world Many reports have demonstrated existence of neural stem and progenitor cells’ niches in subventricular zone and subgranular zone in adult brains Fetal brains are another promising source of neural stem cells Stem cells from fetus are more proliferative and easier to propagate than those from adult brains Therefore, isolation and cultivation of neural stem cells are not only important to understand cell fates and characteristics of NSCs but also to provide potential materials in futher experiments in cell therapy and screening drugs Vietnam is a tropical nation, remarkably characterized by a diverse popularity of herbs Many substances from them have been proven to good for health They have been widely and safely used as herbal medicines among the population It is believed that Panax vietnamensis has better ingredients than Korean and Chinese ginseng Therefore, it would promote proliferation of neural cell better than Korean and Chinese ginsengs in other results described before This research is carried out to evaluate the effect of raw extract from Panax vietnamensis on proliferation of neural stem cells Firstly, we isolate and cultivate neural stem cells from 14 – day mouse fetus as floating neurospheres in serum – free medium The serum – free medium with mitogens, N2 and B27 supplements are appropriate for NSCs culture Under these conditions, only NSCs and highly undifferentiated progenitors can proliferate, whereas committed precursors and terminally differentiated cells are gradually eliminated from the culture To characterize candidate cells, we assessed pluripotency and cell marker via sphere – formation assay, differentiation assay and immunocytochemistry Effect of different ii concentrations of Panax vietnamensis raw extract is evaluated through increasing of cell number Result shows that NSCs can be cultured as floating neurospheres in serum – free medium These spheres can give rise to secondary, tertiary spheres during cultivation and can be maintained in an undifferentiated and homogeneous state in culture for over months Candidate cells were shown to be nestin – positive, able to generate new spheres and differentiate into astrocytes Effect of Panax vietnamensis on proliferation of neural stem cells is promising Concentration of µg/ml and 500 µg/ml raw extract give the higher effect than the control and their effects on NSC proliferation are the same Meanwhile, 1000 µg/ml concentration leads to cell degeneration due to high amount of solvent in raw extract Keyword: neural stem cell, neurosphere, culture, Panax vietnamensis, proliferation iii MỤC LỤC Tóm tắt i Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng biểu đồ viii anh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.1 cầu đề tài 1.2 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tế bào gốc 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Ứng dụng tế bào gốc 2.1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc Việt Nam 2.2 Tế bào gốc thần kinh 2.2.1 Định nghĩa 2.2.2 Các vị trí thu nhận tế bào gốc thần kinh 2.2.3 Sự phát sinh thần kinh (neurogenesis) 2.2.4 Các nguồn thu nhận tế bào gốc thần kinh 10 2.2.5 Ứng dụng tế bào gốc thần kinh 11 2.3 Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh 14 2.3.1 Nuôi cấy neurosphere 15 2.3.2 Nuôi cấy lớp đơn 16 2.3.3 Nuôi cấy neurosphere cải tiến 16 2.4 Marker tế bào gốc thần kinh tế bào thần kinh trưởng thành 17 2.4.2 Các marker tế bào gốc thần kinh 17 2.4.2 Các marker cho tế bào tiền thân thần kinh 18 2.4.3 Marker cho tế bào neuron 18 iv 2.4.4 Marker cho tế bào astrocyte 19 2.4.5 Marker cho tế bào oligodendrocyte 19 2.5 Giới thiệu sâm Ngọc Linh 20 2.5.1 Giới thiệu chung sâm Ngọc Linh 20 2.5.2 Giá trị dược liệu sâm Ngọc Linh 21 2.6 Các phương pháp đánh giá khả tăng sinh NSC 22 2.6.1 Phương pháp đếm tế bào tự động 22 2.6.2 Phương pháp flow cytometery 22 2.6.3 Phương pháp khử muối tetrazolium 23 2.6.4 Phương pháp khảo sát khả tăng sinh tế bào qua thay đổi kích thước đường kính neurosphere 23 2.6.5 Phương pháp dựa theo công nghệ đo điện trở tế bào 24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 25 3.2 Vật liệu 25 3.2.1 Mẫu vật 25 3.2.2 Dụng cụ 25 3.2.3 Thiết bị 26 3.2.4 Hóa chất 27 3.3 Qui trình thí nghiệm 30 3.4 Phương pháp nghiên cứu 31 3.4.1 Nội dung 1: Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột nhắt trắng 14 ngày thai phương pháp nuôi cấy neurosphere cải tiến 31 Hình 3.4 Thao tác thu nhận tế bào từ não chuột 32 3.4.2 Nội dung 2: Chứng minh tế bào ứng viên tế bào gốc thần kinh 33 3.4.3 Nội dung 3: Phương pháp flow cytometry xác định thành phần tế bào gốc thần kinh quần thể tế bào ứng viên 36 3.4.4 Nội dung 4: Khảo sát tác động kích thích tăng sinh cao chiết thô sâm Ngọc Linh năm tuổi lên tế bào gốc thần kinh 36 3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 37 4.1 Kết phân lập, nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột nhắt trắng 14 ngày thai 38 v 4.1.1 Kết nuôi cấy tế bào môi trường chuyên biệt tế bào gốc thần kinh 38 4.1.2 Kết cấy chuyền tế bào 42 4.2 Kết chứng minh tế bào ứng viên tế bào gốc thần kinh 42 4.2.1 Kết đánh giá khả tự làm tế bào ứng viên 42 4.2.2 Kết đánh giá biểu marker chuyên biệt tế bào gốc thần kinh tế bào ứng viên 43 4.2.3 Kết đánh giá khả biệt hóa tế bào ứng viên thành astrocyte 44 4.3 Kết flow cytometry 46 4.4 Kết tác động kích thích tăng sinh cao chiết thơ sâm Ngọc Linh đến tế bào gốc thần kinh 46 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Đề nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Phụ lục vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumin CNS Central nervous system ctv Cộng tác viên DMEM ulbecco’s Modified Essential Medium EGF Epidermal Growth Factor ES Embryonic stem cell FBS Fetal bovine serum FGF Fibroblast Growth Factor FITC Fluorescein isothiocyanate GABA Gamma aminobutyric acid GFAP Gial fibrillary acidic protein iPS Induced Pluripotent stem NSC Neural stem cell PBS Phosphate buffer saline SC Stem Cell SGZ Subgranular zone SVZ Subventricular zone vii TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Huy Bích ctv Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập NXB Khoa học kỹ thuật 1254 trang Đỗ Tất Lợi 2004 Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học 1294 trang Lâm Thiên Ngọc 2010 Nghiên cứu thu nhận tế bào tiền thân nội mơ từ máu cuống rốn người Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận Nguyễn Thị Thu Hương Sâm Việt Nam số thuộc họ nhân sâm NXB Khoa học kỹ thuật Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc Công nghệ tế bào gốc NXB Gia Định 555 trang Tài liệu tiếng Anh Abbott B.D et al 1995 Cell death in rat and mouse embryos exposed to methanol in whole embryo culture 1995 Toxicology 97: 159–171 Abrous D.N et al 2005 Adult neurogenesis: from precursors to network and physiology Physiol Rev 85: 523–569 Altman J and Das G.D 1965 Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats J Comp Neurol 124: 319–335 Ben–Hur T et al 1998 Growth and fate of PSA-NCAM+ precursors of the postnatal brain J Neurosci 18: 5777–5788 10 Bovetti S et al 2007 Subventricular zone – derived neuroblast migration to the olfactory bulb is modulated by matrix remodeling Eur J Neurosci 25: 2021– 2033 11 Cai J et al 2002 Properties of a fetal multipotent neural stem cell (NEP cell) Dev Biol 251: 221–240 12 Cassimeris L and Spittle C 2001 Regulation of microtubule-associated proteins Int Rev Cytol 210:163–226 13 Crews F.T and Nixon K 2003 Alcohol, Neural stem cell and adult neurogenesis Alcohol Research and Health vol 27 pp 197–204 14 Deng W et al 2009 Aldult – born hippocampal dentate granule cells undergoing maturation moduleta learning and memory in brain J Neurosci 17: 5046–5061 15 Doetsch F et al 1997 A molecular and cellular theory of dimension organization of subventricular germinal zone in the adult mammalial brain J Neurosci 17: 5046–5061 16 Doyle K.L et al 2001 Expression of the intermediate filament protein nestin by sustentacular cells in mature olfactory neuroepithelium J Comp Neurol 437:186–195 17 Duc N.M et al 1996 New saponins from Vietnamese ginseng: Highlights on biogenesis of dammarane triterpenoids Advances in Experimental Medicine and Biology 404 18 Feng Y et al 2006 Biological properties of neural progenitor cells isolated from the hippocampus of aldult cynomolgus monkeys Chin Med J 119: 110–116 50 19 Gage F.H and Praag H.V 2002 Neurogenesis in aldult brain Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress Davis K.L., Charney D., Coyle J.T (eds) Lippincott Williams & Wilkins pp 109–115 20 Galli R et al Neural Stem Cells: An Overview 2003 Circulation Research 92: 598–608 21 Goldman S.A and Nottebohm F 1983 Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain Proc Natl Acad Sci USA: 2390–2394 22 Götz M and Huttner W.B The cell biology of neurogenesis Nature Reviews Molecular Cell Biology 6: 777–778 23 Gritti A et al 2001 Cultures of stem cells of central nervous system Protocols for Neural Cell Cuture Fedorrof S and Richardson A (eds) Humana Press pp 173 –198 24 Hartfuss E et al 2001 Characterization of CNS precursor subtypes and radial glia Dev Biol 229: 15–30 25 Kaneko Y et al 2000 Musashi 1: an evolutionally conserved marker for CNS progenitor cells including neural stem cells Dev Neurosci 22:139–153 26 Kim H.J and Jin C.Y 2012 Stem Cells in Drug Screening for Neurodegenerative Disease Korean J Physiol Pharmacol vol 16: 1–9 27 Kornblum H.I 2007 Introduction to neural stem cell Stroke 38: 810–816 28 Lazzari M and Franceschini V 2001 Glial fibrillary acidic protein and vimentin immunoreactivity of astroglial cells in the central nervous system of adult Podarcis sicula (Squamata, Lacertidae) J Anat 198: 67–75 29 Louis S.A and Reynolds B.A 2010 Neurosphere and neural colony–forming cell assays Protocols for Neural Cell Culture 4th edition Doering L.C (eds) pp:1– 28 30 Luskin M.B 1993 Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone Neuron 11: 173–189 31 Markakis E., Gage F.H 1999 Adult-generated neurons in the dentate gyrus send axonal projections to the field CA3 and are surrounded by synaptic vesicles J Comp Neurol 406: 449 – 460 32 Nakano I and Kornblum H.I 2004 Stage-Specific and Cell Fate Markers Neural stem cells: development and Transplantation Bottenstein J.E (eds) Kluwer Academic Publishers pp: 95–126 33 Pastrana E et al 2011 Eyes wide open: A critical review of sphere-formation as an assay for stem cells Cell Stem Cell 8: 486–498 34 Pfeiffer B et al 1992 Immunohistochemical co-localization of glycogen phosphorylase with the astroglial markers glial fibrillary acidic protein and S100 protein in rat brain sections Histochemistry 97: 405–412 35 Quan Le Tran et al 2001 Triterpene saponin from Vietnamensis ginseng (Panax vietnamensis) and their hepatocytoprotective activity J Nat Prod 64: 456–461 36 Ray J and Gage F.H 2011 Neural stem cell isolation, characterization and transplantation Modern techniques in neuroscience research Windhorst U and Johansson H (eds) Springer pp 339–360 37 Reynolds B.A and Rietze R.L 2005 Neural stem cells and neurosphere – reevaluating the relationship Nature Methods 2: 333–336 51 38 Reynolds B.A and Weiss S 1992 Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system Science 255: 1707–1710 39 Rietze R.L et al 2001 Purification of pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain Nature 412: 736-739 40 Schumacher A 2003 Calculation of cell densities and cell layers in the outer shell of staurosporine induced “ovoid” – like neurospheres Res Teleghraph: 1–7 41 Sipione S and Cattaneo E 2002 Modeling brain pathologies using neural stem cells Neural Stem Cells – Methods and Protocols, vol 198 Zigova T et al (eds) Humana Press pp 245–262 42 Suslov O.N et al 2002 Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenoltyping of clonal neurospheres PNAS 99 : 145056–14511 43 Temple S 2001 The development of neural cells Nature 414: 112–117 44 Tsai R.Y and McKay R.D 2002 A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells Genes Dev 16: 2991–3003 45 Weiner L.P 2008 Neural Stem Cells - Methods and Protocols Humana Press 46 World Health Organization 2006 Neurological Disorders public health challenges 47 Yobimoto K et al 2000 Suppressive efects of Vietnamensis ginseng saponin and its major component majonoside – R2 on Psychological stress – induceded enhancement of lipid peroxidation in the mouse brain Pharmacology biochemistry and behavior 66: 661–665 48 Zheng X.S et al 2007 A novel method for culturing neural stem cells In vitro cell dev biol 43:155 –158 49 Zhou Q and Anderson D.J 2002 The bHLH transcription factors OLIG2 and OLIG1 couple neuronal and glial subtype specification Cell 109: 61–73 Tài liệu từ Internet 50 http://www.nature.com/neuro/poster/neuralstemcells/index.html Truy cập ngày 05/03/2012 51 http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/neuralstem-cells.Par.0001.Image.548.gif Truy cập ngày 7/04/2012 52 http://www.nihbt.org.vn/?vi-vn/ghep-te-bao-goc/6205-ghep-te-bao-goc-tao-mautai-vien-huyet-hoc truyen-mau-trung-uong.htm Truy cập ngày 15/ 5/2 12 53 http://vi.wikipedia.org/wiki/S%C3%A2m_Ng%E1%BB%8Dc_Linh Truy cập ngày 16/05/2012 54 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/stem-cell-biology/neural-stemcells.html Truy cập ngày / 6/2012 55 https://www.roche-applied-science.com/sis/xcelligence/index.jsp?id=XC010000 Truy cập ngày 17/07/2012 52 PHỤ LỤC Kết khảo sát thay đổi kích thước neurosphere mơi trường không bổ sung cao chiết (đối chứng) Bảng gia tăng đường kính neurosphere sau ngày (µm) Nhóm Đường kính nhỏ Đường kính từ -4 Đường kính lớn µm µm µm D0 D1 D2 D3 D4 120 129 138 148 191 151 160 - 171 186 158 193 222 252 283 208 306 369 447 567 341 377 417 509 639 362 410 460 562 663 520 565 646 731 788 648 672 698 748 794 D0: kết ghi nhận ban đầu D1: kết ghi nhận sau ngày D2: kết ghi nhận sau ngày D3: kết ghi nhận sau ngày D4: kết ghi nhận sau ngày Bảng tỷ lệ tăng đường kính neurosphere sau ngày (%) Nhóm Đường kính nhỏ Đường kính từ -4 Đường kính lớn µm µm µm D0 D1 D2 D3 D4 7,5 15 23,3 59,2 40,5 13,2 23,2 22,2 - 59,5 79,1 9,3 29,1 59,6 102,5 10,6 22,3 49,3 87,4 13,3 27,1 55,2 83,1 8,7 24,2 40,6 51,5 3,7 7,7 15,4 22,5 Kết xử lý thống kê tỷ lệ tăng đường kính neurosphere sau ngày nhóm đối chứng (%) Đường kính nhỏ 200 µm Mean 11,9 Standard Error 5,16817 Median 7,5 Mode #N/A Standard Deviation 8,95154 Sample Variance 80,13 Kurtosis #DIV/0! Skewness 1,6775 Range 16,2 Minimum Maximum 22,2 Sum 35,7 Count Confidence Level(95,0%) 22,2368 CV 75,22 Đường kính lớn 400 µm Mean 6,2 Standard Error 2,5 Median 6,2 Mode #N/A Standard Deviation 3,53553 Sample Variance 12,5 Kurtosis #DIV/0! Skewness #DIV/0! Range Minimum 3,7 Maximum 8,7 Sum 12,4 Count Confidence Level(95,0%) 31,7655 CV 57,02 Đường kính từ 200 - 400 µm Mean 11,07 Standard Error 1,17803 Median 10,6 Mode #N/A Standard Deviation 2,04042 Sample Variance 4,1633333 Kurtosis #DIV/0! Skewness 0,97536166 Range 4 Minimum 9,3 Maximum 13,3 Sum 33,2 Count Confidence 5,06869617 CV 18,444 Level(95,0%) Kết xử lý thống kê tỷ lệ tăng đường kính neurosphere sau ngày nhóm đối chứng (%) Đường kính nhỏ 200 µm Mean 27,75 Standard Error 12,75 Median 27,75 Mode #N/A Standard Deviation 18,0312 Sample Variance 325,125 Kurtosis #DIV/0! Skewness #DIV/0! Range 25,5 Minimum 15 Maximum 40,5 Sum 55,5 Count Confidence Level(95,0%) 162,004 CV 64,98 Đường kính lớn 400 µm Mean 15,95 Standard Error 8,25 Median 15,95 Mode #N/A Standard Deviation 11,6672 Sample Variance 136,125 Kurtosis #DIV/0! Skewness #DIV/0! Range 16,5 Minimum 7,7 Maximum 24,2 Sum 31,9 Count Confidence Level(95,0%) 104,8261 CV 73,15 891 Đường kính từ 200 - 400 µm Mean 26,16667 Standard Error 2,017699 Median 27,1 Mode #N/A Standard Deviation 3,494757 Sample Variance 12,21333 Kurtosis #DIV/0! Skewness -1,11608 Range 6,8 Minimum 22,3 Maximum 29,1 Sum 78,5 Count Confidence Level(95,0%) 8,6814 CV 13,36 Kết xử lý thống kê tỷ lệ tăng đường kính neurosphere sau ngày nhóm đối chứng (%) Đường kính nhỏ 200 µm Đường kính 200 - 400 µm Mean 32 Mean 54,7 Standard Error 14,0557 Standard Error 2,9838 Median 23,3 Median 55,2 Mode #N/A Mode #N/A Standard Deviation 24,3452 Standard Deviation 5,1681 Sample Variance 592,69 Sample Variance 26,71 Kurtosis #DIV/0! Kurtosis #DIV/0! Skewness 1,4027 Skewness 0,4312 Range 46,3 Range 10,3 Minimum 13,2 Minimum 49,3 Maximum 59,5 Maximum 59,6 Sum 96 Sum 164,1 Count Count Confidence Level(95,0%) 60,4768 Confidence Level(95,0%) 12,8384 CV 76,08 CV 9,45 Đường kính lớn 400 µm Mean 28 Standard Error 12,6 Median 28 Mode #N/A Standard Deviation 17,8190 Sample Variance 317,52 Kurtosis #DIV/0! Skewness #DIV/0! Range 25,2 Minimum 15,4 Maximum 40,6 Sum 56 Count Confidence Level(95,0%) 160,098 CV 63,64 Kết xử lý thống kê tỷ lệ tăng đường kính neurosphere sau ngày nhóm đối chứng (%) Đường kính nhỏ 200 µm Mean 53,8333 Standard Error 16,3588 Median 59,2 Mode #N/A Standard Deviation 28,3337 Sample Variance 802,8033 Kurtosis #DIV/0! Skewness -0,8217 Range 55,9 Minimum 23,2 Maximum 79,1 Sum 161,5 Count Confidence Level(95,0%) 70,3850 CV 52,63 Đường kính lớn 400 µm Mean 37 Standard Error 14,5 Median 37 Mode #N/A Standard Deviation 20,5060 Sample Variance 420,5 Kurtosis #DIV/0! Skewness #DIV/0! Range 29 Minimum 22,5 Maximum 51,5 Sum 74 Count Confidence Level(95,0%) 184,2399 CV 55,42 Đường kính từ 200 - 400 µm Mean 91 Standard Error 5,8824 Median 87,4 Mode #N/A Standard Deviation 10,1887 Sample Variance 103,81 Kurtosis #DIV/0! Skewness 1,3914 Range 19,4 Minimum 83,1 Maximum 102,5 Sum 273 Count Confidence Level(95,0%) 25,3101 CV 11,2 Kết khảo sát thay đổi số lượng tế bào neurosphere môi trường bổ sung cao chiết sau 24 Nhóm Đối chứng 100 500 1000 D0 (µm) 280 308 341 240 307 355 237 302 349 280 300 337 D1 (µm) 306 344 377 315 383 431 302 387 431 247 268 298 N0 (tế bào) 6602 8788 11926 4158 8703 13456 4004 8284 12785 6602 8121 11511 N1 (tế bào) 8618 12243 16116 9401 16898 24080 8284 17433 24080 4532 5789 7959 N (%) 30,54 39,31 35,13 126,09 94,16 78,95 106,89 110,44 88,35 -31,35 -28,72 -30,86 Giá trị âm cho thấy số lượng tế bào giảm Kết xử lý thống kê tỷ lệ tăng tế bào kích thước trung bình neurosphere sau 24 nhóm đối chứng Kích thước (µm) Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence CV Level(95,0%) 309,6667 17,62889 308 #N/A 30,53413 932,3333 #DIV/0! 0,24489 61 280 341 929 75,85099 9,86032 Tỷ lệ tăng tế bào (%) Mean 34,99333 Standard Error 2,53260 Median 35,13 Mode #N/A Standard Deviation 4,38659 Sample Variance 19,24223 Kurtosis #DIV/0! Skewness -0,14006 Range 8,77 Minimum 30,54 Maximum 39,31 Sum 104,98 Count Confidence Level(95,0%) 10,89691 CV 12,53552 Kết xử lý thống kê tỷ lệ tăng tế bào kích thước trung bình neurosphere sau 24 nhóm nồng độ 100 µg/ml Kích thước (µm) Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95,0%) CV 300,6667 33,3483 307 #N/A 57,7610 3336,333 #DIV/0!3 -0,4874 115 240 355 902 143,4862 19,2109 Tỷ lệ tăng tế bào (%) Mean 99,73333 Standard Error 13,89054 Median 94,16 Mode #N/A Standard Deviation 24,05912 Sample Variance 578,8414 Kurtosis #DIV/0! Skewness 0,986493 Range 47,14 Minimum 78,95 Maximum 126,09 Sum 299,2 Count Confidence Level(95,0%) 59,76618 CV 24,12345 Kết xử lý thống kê tỷ lệ tăng tế bào kích thước trung bình neurosphere sau 24 nhóm nồng độ 500 µg/ml Kích thước (µm) Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence CV Level(95,0%) 296 32,47049943 302 #N/A 56,24055476 3163 #DIV/0! -0,47461652 112 237 349 888 139,709283 19,00018 Tỷ lệ tăng tế bào (%) Mean 101,8933333 Standard Error 6,84877199 Median 106,89 Mode #N/A Standard Deviation 11,86242106 Sample Variance 140,7170333 Kurtosis #DIV/0! Skewness -1,559176282 Range 22,09 Minimum 88,35 Maximum 110,44 Sum 305,68 Count Confidence 29,4678875 CV 11,64199921 Level(95,0%) 10 Kết xử lý thống kê tỷ lệ giảm tế bào kích thước trung bình neurosphere sau 24 nhóm nồng độ 1000 µg/ml Kích thước (µm) Mean 305,6666667 Standard Error 16,69663972 Median 300 Mode #N/A Standard Deviation 28,9194283 Sample Variance 836,3333333 Kurtosis #DIV/0! Skewness 0,84790489 Range 57 Minimum 280 Maximum 337 Sum 917 Count Confidence Level(95,0%) 71,83984244 CV 9,461099772 11 Tỷ lệ tăng tế bào (%) Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95,0%) CV 30,31 0,80748581 30,86 #N/A 1,398606449 1,9561 #DIV/0! - 495956921 2,63 28,72 31,35 90,93 3,474331024 4,614339984 Kết kiểm định so sánh giá trị trung bình tỷ lệ tăng số lượng tế bào nhóm nồng độ 100 µg/ml 500 µg/ml Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T