Đang tải... (xem toàn văn)
Luận văn xác định týp o virus lở mồm long móng ở việt nam bằng phương pháp RT PCR
Bộ giáo dục và đào tạo trờng đại học nông nghiệp I ------------------ phan thanh tuấn Xác định týp O virus lở mồm long móng ở Việt Nam bằng phơng pháp RT-PCR Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.62.50 Ngời hớng dẫn khoa học: TS. nguyễn viết không Hà Nội - 2006 Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- i lời cam đoan lời cam đoanlời cam đoan lời cam đoan Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả và số liệu thể hiện trong luận văn là trung thực và cha từng đợc sử dụng để bảo vệ bất cứ học vị nào. Tôi cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đợc chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Phan Thanh Tuấn Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- ii Lời cảm ơn Lời cảm ơnLời cảm ơn Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận đợc rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các cá nhân và tập thể. Nhân dịp này, cho phép tôi đợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Khoa Sau đại học, Khoa Chăn nuôi Thú y - Trờng Đại học Nông nghiệp I đã đào tạo, truyền tải kiến thức khoa học cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trờng. Ban lãnh đạo Viện Thú y cùng tập thể cán bộ, nhân viên- Bộ môn Hoá sinh- Miễn dịch- Bệnh lý, Viện Thú y, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo: TS. Nguyễn Viết Không, ngời đã trực tiếp hớng dẫn, tận tình giúp đỡ tôi thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngời thân và toàn thể bạn bè, đã luôn quan tâm, ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và tiến hành luận văn. Tác giả luận văn Phan Thanh Tuấn Phan Thanh Tuấn Phan Thanh Tuấn Phan Thanh Tuấn Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- iii Mục lục Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vii 1. Đặt vấn đề 1 2. Tổng quan tài liệu và cơ sở khoa học của đề tài 3 2.1. Khái niệm bệnh lở mồm long móng 3 2.2. Tình hình bệnh và nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng trên thế giới 3 2.3. Tình hình bệnh và nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng ở Việt Nam 19 2.4. Một số kỹ thuật chẩn đoán virus lở mồm long móng 22 2.5. Sự đa dạng sinh học của các týp virus lở mồm long móng và biến chủng 26 3. Nội dung, nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu 29 3.1. Đối tợng nghiên cứu 29 3.2. Địa điểm nghiên cứu 29 3.3. Thời gian nghiên cứu 29 3.4. Nội dung nghiên cứu 29 3.5. Nguyên liệu 29 3.6. Phơng pháp nghiên cứu 33 4. Kết quả và thảo luận 49 4.1. Kết quả phục hồi và nuôi cấy tế bào BHK-21 49 4.2. Kết quả gây nhiễm virus lở mồm long móng lên tế bào BHK-21 51 4.3. Kết quả thiết lập RT-PCR định týp virus lở mồm long móng 53 4.4. RT- PCR xác định sự có mặt của virus PV02 54 Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- iv 4.5. Kết quả RT-PCR định týp virus lở mồm long móng PV02 56 4.6. RT-PCR với týp O chuẩn và týp O PV02 58 4.7. Kết quả tách và nhân dòng sản phẩm PCR mẫu PV02 60 4.8. Kết quả giải trình tự gene virus lở mồm long móng chủng PV02 68 4.9. So sánh sequence gene m hoá protein VP1 của virus LMLM chủng PV02 với những sequence đ công bố ở ngân hàng gene thế giới (GenBank) 70 5. Kết luận và đề nghị 73 5.1. Kết luận 73 5.2. Đề nghị 73 Tài liệu tham khảo 74 Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- v Danh mục các chữ viết tắt BHK-21 : Baby Hamster Kidney line 21 (Tế bào thận chuột Hamster sơ sinh dòng 21) BSA : Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò) cDNA : Complementary DNA CPE : Cytopathogenic effect (Bệnh tích tế bào) DMEM : Dulbeccos Modified Eagle Medium DMSO : Dimethyl Sulfoxide DNA : Deoxyribonucleic acid DTT : Dithiothreitol EDTA : Ethylene- Diamine- Tetra- Acetic FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông-Lơng Liên hợp quốc) FCS : Fetal Calf Serum (huyết thanh bào thai bê) FMD : Foot and Mouth Disease (bệnh lở mồm long móng) FMDV : Foot and Mouth Disease Virus (Virus gây bệnh lở mồm long móng) FMD-WRL : Foot and Mouth Disease-World Reference Laboratory (Phòng thí nghiệm tham chiếu về bệnh lở mồm long móng) LMLM : Lở mồm long móng OIE : Office Internationale des Epizooties (Tổ chức Dịch tễ Thế giới) PBS : Phosphate- Buffered- Saline RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- vi Danh mục các bảng Bảng 2.1. Týp virus LMLM năm 2005 tại khu vực Đông Nam á 16 Bảng 2.2. Tình hình LMLM ở các nớc Nam Mỹ năm 2005 17 Bảng 3.1. Phản ứng Reverse-Transciption 37 Bảng 3.2. Thành phần premix thêm vào phản ứng 37 Bảng 3.3. Universal primer và các primer đặc hiệu với các týp virus O, A, Asia1 38 Bảng 3.4. Thành phần và thể tích cho 25 àl phản ứng 39 Bảng 3.5. Chu trình nhiệt cho PCR nhân gene FMDV 39 Bảng 3.6. Thành phần tham gia phản ứng tách DNA khỏi plasmid 46 Bảng 3.7. Các bớc kiểm tra DNA plasmid 46 Bảng 3.8. Thành phần các chất tham gia phản ứng sequencing 47 Bảng 3.9. Chu trình nhiệt cho phản ứng sequencing 47 Bảng 4.1. Thành phần tham gia phản ứng tách DNA khỏi plasmid 66 Bảng 4.2. Thành phần các chất tham gia phản ứng sequencing 69 Bảng 4.3. Chu kỳ nhiệt dùng cho phản ứng sequencing 69 Bảng 4.4. Mức độ tơng đồng của gene VP1 chủng phân lập PV02 với các chủng khác trên thế giới 71 Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- vii Danh mục các hình Hình 2.1. Bản đồ phân bố bệnh LMLM trên thế giới năm 2005 16 Hình 2.2. Sơ đồ nguyên lý phản ứng RT-PCR 23 Hình 4.1. Hình ảnh tế bào BHK-21 phục hồi và phát triển theo thời gian 50 Hình 4.2. Hình ảnh tế bào BHK-21 sau gây nhiễm virus PV02 (trớc gây nhiễm, 24 và 48 giờ sau gây nhiễm) 52 Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR sử dụng các cặp primer đặc hiệu týp đối với các mẫu virus chuẩn 53 Hình 4.4. Sản phẩm RT-PCR dùng FMD uni-primer đối với mẫu tế bào gây nhiễm virus PV02 55 Hình 4. 5. Sản phẩm RT-PCR trong định týp virus LMLM PV02 56 Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR của virus LMLM chủng phân lập PV02 và chủng tham chiếu týp O, dùng các cặp primer chung cho các týp (PuniR-F) và cặp mồi đặc hiệu cho týp O (P33/P38) 59 Hình 4.7. Sản phẩm RT-PCR sử dụng cho nhân dòng 61 Hình 4.8. Kiểm tra sản phẩm PCR đ đợc tinh khiết từ agarose gel 62 Hình 4.9. [A]- Các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng mọc sau khi nuôi cấy tế bào khả biến. [B]- Bắt khuẩn lạc cấy chuyển sang môi trờng mới 64 Hình 4.10. Sản phẩm PCR thu đợc từ môi trờng nuôi cấy các khuẩn lạc màu trắng 65 Hình 4.11. Kết quả kiểm tra DNA tách đợc từ plasmid trên agarose gel 67 Hình 4.12. Kết quả kiểm tra lợng plasmid trớc khi sequence 68 Hình 4.13. Giải trình tự gene VP1 đ đợc dòng hoá ở plasmid 70 Hình 4.14. Kết quả Blast từ GenBank của đoạn gene VP1 71 Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- 1 1. Đặt vấn đề Bệnh Lở mồm long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm xảy ra ở các loài động vật móng guốc chẵn nh trâu, bò, dê, cừu, lợn . Bệnh do virus chứa ARN thuộc họ Picornaviridae gây ra với diễn biến cấp tính và khả năng lây lan nhanh. Bệnh có các biểu hiện đặc trng là sốt cao và hình thành mụn nớc ở niêm mạc miệng, kẽ chân và da vú của gia súc cảm thụ. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế do khả năng lây lan nhanh trên nhiều loài gia súc, giảm sức sản xuất, gây ảnh hởng xấu đến năng suất, chất lợng của sản phẩm chăn nuôi. Bệnh LMLM đ đợc Tổ chức Dịch tễ Thế giới (Office Internationale des Epizooties - OIE) xếp vào một trong các bệnh đứng đầu danh mục bảng A - Bảng danh mục các bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm ở động vật. Bệnh LMLM đ xảy ra ở hầu hết các châu lục: châu Âu (bệnh đợc ghi nhận vào những năm cuối thế kỷ 17), châu á (Pakistan, ấn Độ, v.v. ), châu Phi (Nam Phi v.v.). ở Việt Nam, bệnh đợc ghi nhận lần đầu tiên tại Nha Trang, năm 1898. Theo số liệu tổng hợp của Cục thú y [5], tình hình dịch bệnh LMLM trong những năm gần đây diễn ra với số ổ dịch và số lợng gia súc mắc bệnh ngày càng tăng. Có 7 týp virus gây bệnh LMLM: O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2 và SAT3 với trên 70 subtype [25], [27]. Các týp virus LMLM gây những triệu chứng lâm sàng giống nhau, nhng không có miễn dịch chéo cho nhau [2], [16], [17]. Cho đến trớc năm 2004, virus gây bệnh LMLM ở Việt Nam chủ yếu thuộc týp O. Từ năm 2004, virus LMLM týp A lần lợt đợc phát hiện ở các tỉnh phía Nam đến Quảng Bình. Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- 2 Các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học nh kỹ thuật bổ thể kết hợp, trung hoà virus, miễn dịch huỳnh quang, ELISA thờng đợc dùng để xác định týp huyết thanh của virus. Những phơng pháp này khó phân biệt đợc các subtype của cùng 1 týp virus LMLM. Gần đây, đ có hiện tợng bệnh LMLM vẫn xảy ra trong khu vực đ đợc tiêm phòng vacxin, thí dụ Ninh Thuận - 1997, Bắc Kạn - 1999. Trong nghiên cứu định týp virus LMLM trớc đây, virus týp O của Việt Nam đôi khi RT-PCR không cho vạch đặc hiệu đối với týp O [27] khi dùng cặp mồi đặc hiệu của phòng thí nghiệm tham chiếu Pirbright. Nh vậy, đặc tính di truyền của virus LMLM týp O của Việt Nam khác với đa số các subtype O đợc nhận biết bởi cặp mồi đặc hiệu của phòng thí nghiệm Pirbright. Việc tìm ra cặp mồi đặc hiệu cho chủng virus týp O của Việt Nam sẽ có ý nghĩa lớn trong công tác chẩn đoán định týp virus. Việc xác định chính xác các subtype của virus LMLM có ý nghĩa lớn trong lựa chọn chủng vacxin phù hợp trong công tác phòng chống bệnh. Xuất phát từ những yêu cầu khoa học và thực tiễn trên đây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Xác định týp O virus lở mồm long móng ở Việt Nam bằng phơng pháp RT-PCR, với mục tiêu: Tìm đợc cặp mồi đặc hiệu dùng trong RT-PCR xác định týp O virus LMLM ở Việt Nam. . tài: Xác định týp O virus lở mồm long móng ở Việt Nam bằng phơng pháp RT- PCR, với mục tiêu: Tìm đợc cặp mồi đặc hiệu dùng trong RT- PCR xác định týp O virus. bệnh lở mồm long móng ở Việt Nam 19 2.4. Một số kỹ thuật chẩn o n virus lở mồm long móng 22 2.5. Sự đa dạng sinh học của các týp virus lở mồm long móng