MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ii DANH MỤC BẢNG iii BÀI 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT BÀI 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG – TÁCH VI SINH VẬT 11 BÀI 4: QUAN SÁT VI SINH VẬT NÓI CHUNG TRÊN 15 BÀI 5: QUAN SÁT NẤM MEN 24 BÀI 6: QUAN SÁT VI KHUẨN .30 BÀI 7: QUAN SÁT NẤM MỐC .39 BÀI 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DỊ HOÁ CARBONHYDRATE 49 BÀI 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG .55 DANH MỤC HÌNH Hình Một số dung cụ kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn Hình Mẫu cấy ziczac cấy song song Hình Cấy gạc môi trường đĩa petri Hình Cách cấy truyền môi trường đĩa thạch Hình Các kiểu cấy đĩa thạch .7 Hình Trình tự cấy truyền Hình Qui trình pha lỗng mẫu Hình Trình tự pha lỗng mẫu 12 Hình Các kiểu cấy ria 13 Hình 10 Cấu tạo kính hiển vi quang học 17 Hình 11 Cách làm tiêu giọt ép 19 Hình 12, cách làm tiêu giọt treo 19 Hình 13 Nấm men (trái) Bacillus Subtilis (phải) kính hiển vi 21 Hình 14 Vi khuẩn Lactose Bacillus 21 Hình 15 Dưa cải muối chua, nem chua .23 Hình 16.chế phẩm vi sinh từ Bacillus Subtilis 23 Hình 17.Hình vẽ nấm men .24 Hình 18 Cách pha lỗng mẫu hình ảnh buồng đếm 28 Hình 19: Cấu tạo buồng đếm vùng đếm 28 Hình 20 ứng dụng nấm men sản xuất bánh mì, rượu, bia 30 Hình 21 Các bước nhuộm Gram VSV 33 Hình 22 Hình VSV kính hiển vi: bacillus subtilis, E.coli, Lactic 34 Hình 23 Mẫu nhuộm Gram Bacillus Subtilis, E.coli, Lactic 35 Hình 24 Hình ảnh quan sát 36 Hình 25 Sản phẩm thạch dừa 37 Hình 26 Probiotic với vai trị hang rào phịng ngự bảo vệ niêm mạc ruột 39 Hình 27 Chao từ nấm Mucor 43 Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | ii Hình 28 Phomat Camembert 44 Hình 29 Tempeh ăn làm từ 45 Hình 30 Nước tương lên men tự nhiên 46 Hình 31 Nấm mốc tân công nông sản, trái 48 Hình 32 Mẫu nấm men hiếu khí (bên trái) yếm khí (bên phải) so với mẫu chuẩn 52 Hình 33 Mẫu hơ hấp hiếu khí (bên trái) yếm khí (bên phải) 52 Hình 34 Mẫu Lacto bacillus hơ hấp hiếu khí (bên trái) yếm khí (bên phải) 53 Hình 35 Mẫu A.oryzae hơ hấp hiếu khí (bện trái) yếm khí (bên phải) 54 Hình 36 Mẫu trước sau nhỏ luygol 54 Hình 37 Nấm men môi trường Sacarose-lactose-maltose-glucose (trái) 56 Hình 38 L.acidophillus mơi trường theo thứ tự S-L-M-L 57 Hình 39 Acetobacterxylium trong môi trường theo thứ tự S-L-M-L 57 DANH MỤC BẢNG Bảng Kết thí nghiệm tìm số tế bào/1ml mẫu 14 Bảng Nhóm phương pháp định lượng vi sinh vật 14 Bảng Cấu tạo kính hiển vi quang học 16 Bảng So sánh tiêu giọt ép giọt treo 18 Bảng Kết quan sát nấm men, vi khuẩn 20 Bảng 6.Tỷ lệ nảy chồi nấm men 26 Bảng Tỷ lệ chết nấm men .27 Bảng Số VSV ba vùng quan sát tổng số VSV TB 1ml mẫu 29 Bảng So sánh vi sinh vật Gram (-) (+) 31 Bảng 10 Kết quan sát sống mẫu VSV 34 Bảng 11 Kết quan sát sau nhuộm Gram 35 Bảng 12 Kết quan sát nhuộm màng nhày 35 Bảng 13 So sánh hô hấp lên men 49 Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | iii BÀI 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I Mục đích thí nghiệm - Tạo mơi trường khiết để nuôi cấy vi sinh vật - Biết cách chuẩn bị dụng cụ cần cho q trình ni cấy - Biết cách bao gói đĩa petri, pipet, ống nghiệm vô khuẩn chúng để đảm bảo môi trường đủ sách cho việc ni cấy II Sơ lược lí thuyết Định nghĩa Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp chất dinh dưỡng (những chất tham gia vào trình nội bào), chất trì oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định pH môi trường Phân loại Phân loại theo trạng thái lý hóa: · Môi trường lỏng: lên men, nhân giống, nghiên cứu số đặc tính · Mơi trường rắn(mơi trường đặc): môi trường lỏng kết hợp với chất tạo đặc agar (2-2.5%), gelatin (10-15%)-để phân lặp, định lượng, gieo giống giữ giống vi sinh vật · Môi trường bán rắn: hàm lượng chất tạo độ đặc mơi trường rắn thường dùng (0.3-0.7% agar) – dùng để quan sát khả chuyển động số vi sinh vật ( tạo nên đường bề mặt môi trường) Phân loại theo thành phần: · Môi trường tổng hợp: · Mơi trường tự nhiên: · Mơi trường hịa tan chuẩn bị sẵn Yêu cầu môi trường dinh dưỡng Có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết Có pH thích hợp Khơng chứa yếu tố độc hại Có độ nhớt định Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Tuyệt đối vô trùng III Cách tiến hành thi nghiệm Th Dd đ ng H p ti t trùng Xay nhuy n n i autoclave Cân 60g malt Đun cách thu (1) L c tinh H2O Nâng nhi t (2) Đo đ đ K tt a ng, Vdd Ch nh đ đ ng (3) Th liugon B sung agar 2-2,5% L c thô bã Đun cách thu Dd đ ng Đ ng hoá Phân ph i (4) ng nghi m H p ti t trùng (5) Đ nh hình M u Ghi chú: (1) Đun cách thuỷ: nhiệt độ: 42-450C, thời gian 30 phút (2) Nâng nhiệt: 68-700C, thời gian 1h (3) Chỉnh độ đường: dùng balling kế đưa dung dịch đường 70 (4) Phân phối: ống nghiệm 1/4, ống nghiệm ½ (5) Hấp tiệt trùng: 15-20p Môi trường thạch nghiêng: cho vào 1/4 ống nghiệm sau để nghiêng định hình Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Môi trường thạch đứng: cho vào ½ ống nghiệm sau để thẳng đứng Thao tác phân phối phải nhanh, khéo léo để mơi trường khơng dính vào miệng ống nghiệm, đĩa petri hay nút cần thực trước môi trường bị đông đặc Môi trường thạch phải phẳng, nhẵn IV Kết Ta có cơng thức V1 N1 = V2 N2 V2= V1 N1 / N2 Trong · V1 Thể tích mơi trường sau lọc tinh · N1 Độ đường sau lọc tinh · N2 Độ đường cần điều chỉnh = 70 Balling Thể tích nước cần thêm vào = V2 – V1 N1(0) 11 V N2 (0) V1(ml) 127 V2(ml) VH2O thêm vào 200 73 Một số ý tiến trình thí nghiệm: - Dụng cụ bao gói phải đảm bảo khơ - Bao gói phải thật kín cẩn thận để dụng cụ sau khử trùng đảm bảo vô trùng lớp giấy gói lấy sử dụng dễ dàng - Đầu nút tròn, độ chặt vừa phải - Lấy nút hay đóng vào dễ dàng - Phần giấy bao gói phải chặt kín VI Bàn luận mở rộng Đánh giá chất tạo đặc cho môi trường: Gelatin làm đông môi trường môi trường tan chảy 37 0C, nhiệt độ tối ưu vi khuẩn gây bệnh cho động vật, ngồi nhiều vi sinh vật phân hủy gelatin làm lỏng môi trường Agar không đông đặc tốt nhiệt độ 400C mà cịn khơng bị vi sinh vật phân giải làm biến tính Giữ giống mơi trường thạch nghiêng Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Phương pháp phổ biến đơn giản tiện lợi, nhiên thời gian giữ giống nên kéo dài tháng , sau phẩi cấy truyền lại mơi trường Do tốn nhiều cơng sức dễ bị đặc tính di truyền ban đầu Phương pháp tiến hành sau: Thuần khiết chủng vsv môi trường agar đĩa petri, chọn khuẩn lạc điển hình cấy lên mơi trường thạch nghiêng thích hợp, sau ni cấy tủ ấm để vsv phát triển bình thường, lấy ống giống cho vào tủ lạnh giữ 4oC, hàng tháng cấy truyền lại vào môi trường Nên cho thêm vào môi trường 0,1 M citrat natri 0,3M Oxalat để chống nhiễm Bacteriophage Hấp tiệt trùng Ngoài cách tiệt trùng sử dụng nước bão hồ (nồi autoclave) tuỳ loại mơi trường mà có thêm số phương pháp khác như: · Phương pháp pasture: đun cách thuỷ nhiệt độ thấp 65-700C, thời gian 15-30p · Phương pháp Tyndal: Nhiệt độ tiệt khuẩn phương pháp từ 70-800C/1 làm lần, lần cách 24giờ dùng nhiệt độ 60-650C/1 làm lần Thời gian nghĩ để nhiệt độ 370C Phương pháp thường áp dụng tiệt khuẩn ōNjō,ŝảŘ,ŚŒẩŗ,Ŏễ,Ōị,ŒỏŘő,ở,ŘŒœệŞ,độ,ōŋřĘ Tyndall cho nhiệt độ 60-650C hay 70-800C, vi khuẩn thể ding dưỡng bị chết nha bào sống, để nguội đến 370C, nha bào chuyển sang thể hoạt động (thể dinh dưỡng) lại bị tiêu diệt lần hấp sau · Nhược điểm: kéo dài thời gian tiệt khuẩn, độ tiệt khuẩn không chắn Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | BÀI 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP I Gieo cấy Định nghĩa Gieo cấy trình chuyển canh trường vi sinh vật từ môi trường sang môi trường khác với mục đích nhân giống giữ giống Mơi trường đảm bảo thích hợp cho sinh vật sinh trưởng phát triển Canh trường: môi trường có vi sinh vật Yêu cầu gieo cấy Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối khu vực xung quanh, gieo cấy phải thực lửa đèn cồn hay tủ cấy Dụng cụ: Que cấy nhọn, móc vịng, pipet, que trang, Hình Một số dung cụ kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn Kỹ thuật gieo cấy - Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang ống chứa môi trường lỏng: nhân giống cấp 1-2-3 để lên men - Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang môi trường đặc: phân lập, tạo khuẩn lạc - Cấy chuyền từ canh trường đặc sang môi trường đặc: giữ giống Các cách cấy truyền Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Phương pháp cấy thạch nghiêng: · Hình Mẫu cấy ziczac cấy song song Hiếu khí: cấy điểm, cấy ziczac, cấy song song · Yếm khí: đuổi khí, cấy đâm sâu vào ống nghiệm Nếu cấy chuyền vi khuẩn hay nấm men di que cấy bề mặt thạch theo hình chữ chi vạch song song Cấy chuyển nấm mốc cần chạm que cấy lên bề mặt thạch - Cấy mặt thạch đứng - Cấy đĩa petri - Cấy gạt: cho mẫu vào mơi trường thạch petri sau dùng que trang dàn vi sinh vật bề mặt thạch hộp Hình Cấy gạc mơi trường đĩa petri - Cấy trộn: phối trộn dịch cấy với thạch (500C) sau lắc đổ vào hộp petri khử trùng Xoay tròn đĩa để thạch phân bố đều, để yên cho môi trường đặc lại cuối bao gói ni tủ ấm (có thể cho dịch cấy vào petri trước đổ thạch vào đĩa petri) - Cấy ria: việc sử dụng que cấy có chứa mẫu sau lướt que cấy lên mặt thạch theo hình chữ chi hay đường song song theo góc Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Hình Cách cấy truyền mơi trường đĩa thạch Hình Các kiểu cấy đĩa thạch Tiến hành thí nghiệm (gieo cấy môi trường thạch nghiêng ống nghiệm) Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Hình Trình tự cấy truyền Mơ tả qui trình: a) Một tay cầm ống nghiệm: ống canh trường ống môi trường (ống canh trường nằm bên ngồi, ống mơi trường nằm bên trong) Tay lại cầm que cấy đốt đỏ que cấy lửa đèn cồn Dùng ngón út áp út rút nút bơng ống canh trường b) Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm c) Đợi que cấy nguội, lấy vi sinh vật từ ống canh trường đưa sang ống môi trường d) Nhẹ nhàng lướt que cấy mặt thạch theo kiểu hình chữ chi e) Rút que cấy đốt nóng que cấy Khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng ống nghiệm đậy nút bong II Phân lập Định nghĩa Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Phân lập trình phân tách vi sinh vật từ quần thể ban đầu tạo thành khuẩn lạc riêng lẻ, có hoạt tính cao Các phương pháp phân lập vi sinh vật Phương pháp trực tiếp Phương pháp gián tiếp Mẫu Mẫu Pha loãng Pha loãng Tạo khuẩn lạc mt Làm tiêu Soi kính Một tế bào riêng rẻ Chọn chủng khiết đinh danh tb có hình dạng khác Làm tiêu Soi kính Một tế bào riêng rẻ Định danh Giống (giữ) Giống (giữ) Tiến hành thí nghiệm a Pha lỗng mẫu Hình Qui trình pha lỗng mẫu Mơ tả qui trình: Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | o Chuẩn bị sẵn 95ml nước vơ khuẩn bình tam giác ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn o Dùng pipet 10ml hút 5ml vi sinh vật cho vào bình tam giác có chứa sẵn 95ml nước vơ khuẩn lắc (bình mẫu) o Dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh vật từ bình mẫu cho vào ống nghiệm thứ có chứa sẵn 9ml nước vơ khuẩn (độ pha lỗng 10-1) o Tiếp tục dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh vật từ ống nghiệm cho vào ống nghiệm thứ có chứa sẵn 9ml nước vơ khuẩn (độ pha loãng 10-2) o Lần lượt ta làm tương tự ống thứ 3, thứ thứ 5(độ pha loãng 10-3, độ pha loãng 10-4, độ pha loãng 10-5) b Phân lập: mẫu có độ pha lỗng: ống 10-3, ống 10-4, ống 10-5 · Hấp cách thủy, rã đơng mơi trường ½ · Tháo bao gói petri vơ khuẩn, hơ quanh hộp petri lửa đèn cồn · Tay trái cầm hộp petri, dùng ngón tay mở nắp dùng tay phải đổ thạch rã đông vào hộp petri · Xoay để thạch phân bố hộp bề mặt phẳng, nhẵn Để nguội cho thạch đông lại · Dùng pipet lấy mẫu ống nghiệm có độ pha lỗng 10-3 cho vào hộp petri (vẫn dùng tay để nắp hộp petri) · Vơ khuẩn que trang cồn hơ nóng, sau để nguội dàn mẫu bề mặt thạch để nấm men phát triển khắp bề mặt thạch III · Để ổn định phút, lật ngược hộp petri lại tiến hành bao gói · Để nguội tủ ấm nhiệt độ thích hợp (28-300C), vòng 48-72 Bàn luận mở rộng Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 10 BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG – TÁCH VI SINH VẬT I Sơ lược lược lý thuyết Khái niệm Định lượng vi sinh vật q trình pha lỗng mẫu sau cấy chuyền mẫu qua môi trường nhằm mục đích tạo tế bào riêng lẻ đếm tổng số tế bào có 1g hay 1ml mẫu ban đầu Phương pháp định lượng: Định lượng trực tiếp: phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có tiêu làm từ mẫu o Ưu điểm: cho kết nhanh chóng o Nhược điểm: không phân biệt tế bào sống tế bào chết o Phương pháp định lượng trực tiếp: Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu (thường dùng nhất) Định lượng gián tiếp: phương pháp định lượng thông qua môi trường cách gieo cấy lượng định mẫu lên mơi trường dinh dưỡng thích hợp, ni cấy tủ ấm, sau đếm tổng số khuẩn lạc dựa vào cơng thức để tính số tế bào có 1g hay 1ml mẫu ban đầu o Ưu điểm: kết xác o Nhược điểm: - Mất nhiều kinh phí để làm mơi trường - Mất nhiều thời gian Nguyên lý: o Phương pháp đổ đĩa: vi sinh vật pha lỗng trộn với mơi trường agar nóng chảy đổ vào hộp petri vô khuẩn Sau thời gian nuôi cấy vi sinh vật mọc thành khuẩn lạc riêng lẽ o Phương pháp cấy ria: que cấy sử dụng để cấy ria nhiều lần hỗn hợp vi sinh vật phân lập khắp bề mặt môi trường đặc petri Sau lần vi sinh vật tách dần khỏi hỗn hợp phát triển thành khuẩn lạc riêng lẽ II Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị dụng cụ: o Erlen chứa 95ml nước vô khuẩn Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 11 o ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn o pipet 10ml pipet 1ml hấp tiệt trùng o Chuẩn bị ống thạch, đun chảy cách thủy, giữ 450C-500C Pha loãng mẫu: o Chuẩn bị mẫu: lấy 5ml dịch mẫu chứa VSV cho vào erlen chứa 95ml nước vô khuẩn 100ml dịch mẫu o Pha lỗng: Hình Trình tự pha lỗng mẫu - Lưu ý: o Sử dụng ống nghiệm chứa 9ml nước vơ khuẩn o Giữa lần pha lỗng nên đánh máy Vortex o Pipet dùng riêng cho ống nghiệm ứng với độ pha loãng o Thao tác nên thực gần đèn cồn để đảm bảo vô khuẩn o Không nên mở nắp hộp petri lớn để tránh nhiễm khuẩn o Thao tác thực phải nhanh o Dùng nút đậy ống nghiệm để tránh nhiễm khuẩn Phương pháp đổ hộp (phương pháp trộn) o Hấp cách thủy, rã đơng mơi trường ½ giữ mơi trường nhiệt độ 500C o Cho 0.2ml mẫu với độ pha loãng tương ứng vào petri đổ ống nghiệm chứa môi trường vào o Xoay hộp petri cho mặt thạch phẳng Để môi trường đặc lại o Lật ngược petri, bao gói, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp o Sau 2-3 ngày, lấy ra, đếm số khuẩn lạc tính tốn kết Phương pháp cấy ria (phương pháp tách) Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 12 ... trường vi sinh vật từ môi trường sang môi trường khác với mục đích nhân giống giữ giống Mơi trường đảm bảo thích hợp cho sinh vật sinh trưởng phát triển Canh trường: mơi trường có vi sinh vật Yêu... TRƯỜNG NI CẤY VI SINH VẬT I Mục đích thí nghiệm - Tạo môi trường khiết để nuôi cấy vi sinh vật - Biết cách chuẩn bị dụng cụ cần cho q trình ni cấy - Biết cách bao gói đĩa petri, pipet, ống nghiệm vô... ria nhiều lần hỗn hợp vi sinh vật phân lập khắp bề mặt môi trường đặc petri Sau lần vi sinh vật tách dần khỏi hỗn hợp phát triển thành khuẩn lạc riêng lẽ II Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị dụng