BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Bách khoa– Đại học Đà Nẵng, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho thực đợt thực tập Tôi gửi lời cảm ơn đến thầy, ngành tận tình dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình theo học ngành Đặc biệt cảm ơn TS Lê Lý Thùy Trâm – Giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng quan tâm, hướng dẫn để tơi hồn thành báo cáo thực tập Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Bệnh viện Phổi Đà Nẵng tạo điều kiện nhân lực vật lực để tơi hồn thành tốt q trình thực tập Tiếp đến, xin gửi lời cảm ơn đến BS Bảo Thuyết anh chị khoa xét nghiệm nhiệt tình hướng dẫn truyền đạt cho tơi nhiều kinh nghiệm quý báu thời gian thực tập Cảm ơn gia đình, bạn bè giúp đỡ tơi thời gian học tập trường hồn thành trình thực tập Đặc biệt xin cảm ơn bạn Đinh Thị Thu Hiền giúp đỡ nhiều trình thực tập Bệnh viện Phổi Đà Nẵng Trải qua trình thực tập với nhiều giúp đỡ cố gắng nỗ lực học hỏi thân, đến báo cáo thực tập hồn thành Tuy vậy, q trình thực tập tốt nghiệp nhiều kiến thức mẻ nên khơng tránh khỏi thiếu sót Vì vậy, mong cán hướng dẫn, quý thầy cô, anh chị bạn có ý kiến đóng góp để báo cáo thực tập tơi hồn thiện Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực tập SVTH[Type text] Trang BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP DANH MỤC THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT AFB Acid-fast bacillus (trực khuẩn kháng acid) ATSH An Toàn Sinh Học BSC Bio Safety Cabinet (Tủ an toàn sinh học) CSDL Cơ sở liệu DNA Deoxyribo Nucleic Acid MDR Multiple drug resistant (Đa kháng thuốc) MTB Mycobacteria Tuberculosis NTP National Tuberculosis Program (Chương trình chống lao quốc gia) PCC Probe Check Control (Đối chứng kiểm tra mẫu dò) PCR Polymerase Chain Reaction PXN Phòng Xét Nghiệm WHO Tổ chức Y tế giới RIF Rifampicin SVTH[Type text] Trang BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP UBND Ủy ban nhân dân SOP Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn) SPC Sample Processing Control (Đối chứng trình xử lý mẫu) XN Xét Nghiệm DANH MỤC BẢNG Số hiệu Bảng 2.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Tên bảng Ưu, nhược điểm số phương pháp chẩn đoán lao đa kháng Hóa chất, mẫu bệnh phẩm dụng cụ thí nghiệm nhuộm soi trực tiếp Hóa chất thiết bị dùng xét nghiệm Xpert Một số lỗi thường gặp xét nghiệm Xpert Kết tương ứng ghi phiếu xét nghiệm Hóa chất thiết bị dùng nuôi cấy môi trường lỏng Quy định trả kết mơi trường lỏng Hóa chất thiết bị dùng nuôi cấy môi trường đặc Quy định trả kết mơi trường đặc Hóa chất thiết bị dùng định danh TbcID SVTH[Type text] Trang Trang 10 11 15 20 21 22 27 29 34 36 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 1.7 Hình 1.8 Hình 1.9 Hình 1.10 Hình 2.1 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Tên hình Bệnh viện Phổi Đà Nẵng Sơ đồ tổ chức bệnh viện Phổi Đà Nẵng Tủ ATSH cấp Telstar Tủ ATSH cấp Esco Máy ly tâm Thermo Máy Vortex Ika Genius IKA Máy GenXpert Cepheid Máy MGIT BACTECH Kính hiển vi Tủ ấm Vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis Một số hóa chất dùng nhuộm soi trực tiếp Một số bước nhuộm mẫu bệnh phẩm Soi tiêu kính hiển vi Hình ảnh mô tả probe A, B, C, D, E để xác định tính kháng Rifampicin vi khuẩn lao Các bước xử lý mẫu bệnh phẩm cho xét nghiệm GeneXpert SVTH[Type text] Trang Trang 3 5 7 11 13 13 14 17 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 Hình 3.15 Cartridge Cartridge sau mở nắp Quét mã ID Cartridge Khoang đặt Cartridge Một số hóa chất dùng ni cấy Nhập ống MGIT vào máy Môi trường nuôi cấy đặc Khuẩn lạc MTB Tuýp cấy bị ngoại nhiễm Kết test định danh TbcID SVTH[Type text] Trang 17 18 19 20 23 25 32 33 33 37 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP CHƯƠNG GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CƠ SỞ THỰC TẬP 1.1 Bệnh viện Phổi Đà Nẵng 1.1.1 Quá trình hình thành phát triển Hình 1.1 Bệnh viện Phổi Đà Nẵng Bệnh viện Phổi Đà Nẵng bệnh viện chuyên khoa hạng II lĩnh vực Lao bệnh Phổi, trực thuộc Sở Y tế Thành phố Đà Nẵng Bệnh viện thành lập theo định số 91/2005/QĐ-UBND ngày 28 tháng năm 2005 Chủ tịch UBND Thành phố Đà Nẵng Trụ sở bệnh viện xây dựng phường Hòa Minh, Quận Liên Chiểu, Thành phố Đà Nẵng Tên gọi thành lập Bệnh viện Lao Bệnh Phổi Đà Nẵng, sau đổi tên thành Bệnh viện Phổi Đà nẵng vào ngày 16/08/2016 [3] SVTH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP 1.1.2 Chức nhiệm vụ Bệnh viện có chức nhiệm vụ khám, cấp cứu, chữa bệnh, phục hồi chức lĩnh vực chuyên ngành Lao bệnh Phổi; đào tạo tham gia đào tạo nhân lực y tế, đạo tuyến tham gia phòng – chống dịch bệnh; nghiên cứu khoa học, triển khai ứng dụng khoa học công nghệ, kỹ thuật đại phục vụ người bệnh phục vụ cơng tác chăm sóc sức khỏe nhân dân Bên cạnh bệnh viện chủ động thiết lập mối quan hệ, hợp tác khám- chữa bệnh, cung cấp thiết bị, đào tạo, nghiên cứu khoa học với tổ chức quốc tế; xây dựng, tổ chức đề án liên doanh, liên kết với tổ chức cá nhân nước ngoài, kể tổ chức phi phủ cử cán học tập nghiên cứu nước ngoài; mời chuyên gia nước đến nghiên cứu, trao đổi kinh nghiệm học tập đơn vị [3] SVTH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP 1.1.3 Cơ cấu tổ chức Tổ chức bệnh viện gồm 11 khoa phòng: Hình 1.2 Sơ đồ tổ chức bệnh viện Phổi Đà Nẵng 1.2 Khoa Xét nghiệm Khoa xét nghiệm thuộc Bệnh viện Phổi Đà Nẵng, có chức hỗ trợ chuẩn đốn thơng qua kiểm tra sinh hóa, huyết học, ni cấy tế bào, sinh học phân tử Khu làm việc khoa xét nghiệm gồm có tầng, đó:  Tầng chia làm khu vực nhỏ: khu vực hành chính, khu vực xét nhiệm sinh hóa - huyết học, khu vực nuôi cấy trùng, khu vực kho dụng cụ- thiết bị SVTH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP  Tầng khoa nơi dùng để xét nghiệm phân tử bao gồm phòng phòng tách chiết DNA, phòng điện di, phòng Xpert, phòng Mix Phòng tách chiết DNA có nguy lây nhiễm cao nên bố trí tách với phòng khác 1.3 Thiết bị phòng thí nghiệm 1.3.1 Tủ an tồn sinh học Hình1.3 Tủ ATSH cấp Telstar Hình 1.4 Tủ ATSH cấp Esco • Mục đích sử dụng: Tủ an tồn sinh học thiết bị hỗ trợ cho thao tác xử lí mẫu bệnh, tách chiết DNA vi khuẩn lao, xử lí, thao tác mẫu GenXpert Đảm bảo thuận lợi an toàn cho người thao tác • Nguyên tắc hoạt động B1: Tháo chắn tủ ( tủ Telstar), kéo kính chắn tủ lên tủ ( tủ Esco) , lau cồn toàn bề mặt tủ B2: Bật quạt, bật đèn, bật nguồn điện nối với máy Vortex SVTH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP • Lưu ý sử dụng: + Vệ sinh trước sau làm việc + Bật đèn UV trước sau làm việc 15 phút + Quạt gió phải chạy phút trước sau thực XN + Dụng cụ vật liệu tủ phải giữ mức tối thiểu, khơng che chắn lỗ thơng gió + Mọi thao tác nên tiến hành khoảng 2/3 không gian bên tủ + Hạn chế di chuyển ngồi tủ để tránh bị nhiễu dòng khí + Khơng nên dùng đèn cồn BSC, sức nóng làm đổi hướng dòng khí, làm hỏng lọc + Tủ cần hiệu chuẩn định kỳ 1.3.2 Máy ly tâm Hình1.5 Máy ly tâm Mikro 200R Hettich • Mục đích sử dụng: - Máy ly tâm Mikro 200R Hettich: Dùng để phân tách dịc đờm khỏi vi khuẩn dựa tỷ trọng chúng( tỷ trọng vi khuẩn 1,07-0,79); mặt khác nhằm tách DNA, lắng DNA vi khuẩn Lao • Nguyên tắc hoạt động B1 : Cho bệnh phẩm xử lý vào cối ly tâm B2 : Đậy nắp thết độ tốc độ ly tâm, thời gian ly tâm SVTH Trang 10 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP • Làm tiêu trứng nhuộm ZN  Chuẩn bị tiêu gắn albumin trứng Rửa trứng gà, lau cồn Đập lỗ nhỏ đầu trứng, chắt lấy lòng trắng trứng cho vào tuýp Hút ml lòng trắng trứng, ml nươc muối sinh lý (NACl 0,9 %) vào tuýp có nắp xoáy Votex nhẹ mức thấp khoảng -5 phút Nhỏ giọt huyền dịch trứng lên lam kính Dàn tạo tiêu có kích thước 1x2 cm Để tiêu khơ hồn tồn, xếp vào hộp tiêu Bảo quản nhiệt độ phòng sử dụng tuần tránh nhiễm nấm  Phết tiêu trứng nhuộm ZN tìm Cord factor Hút cặn đáy (+), nhỏ giọt lên albumin, dàn nhẹ Để khô tự nhiên tủ ATSH Cố định tiêu Nhuộm tiêu theo quy trình nhuộm ZN  Quan sát tiêu nhuộm ZN - Soi định danh vật kính x 10 tìm Cord factor Soi vật kính x 100 cần quan sát chi tiết Trên tiêu gặp hình ảnh sau biện pháp xử lý: + AFB có dạng cuộn thừng, vụn thành đám, kết dải nhỏ sắc nét rải rác vi trường Tiến hành định danh phương pháp sắc ký miễn dịch tìm kháng nguyên MPT64 + AFB lẫn với vi khuẩn khác nấm: phải khử nhiễm, cấy chuyền sang LJ để theo dõi định danh SVTH Trang 36 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP + Vi khuẩn khác nấm: tuýp cấy ngoại nhiễm, xin lại ống khác để cấy lại + Các loại tế bào: ủ ấm theo dõi tiếp + Khơng thấy gì: Có thể tiêu bị bong trôi, làm lại tiêu khác, máy báo sai dương, ủ ấm theo dõi tiếp Bảng 3.6 Quy định trả kết môi trường lỏng [2] Máy báo Soi ZN Dương Vi khuẩn, Định danh MTB nấm Trả kết Ngoại nhiễm AFB (-) Dương Cuộn thừng Dương tính Cuộn thừng, kết Dương M.Tuberculosi dải nhỏ, rải rác s AFB vụn Âm tính (lần 1) NTM Cấy thêm mẫu Âm tính (lần 2) Dương AFB lẫn vi khuẩn Dương tính M.Tuberculosi khác, phân lập s Khơng thấy  ủ Âm tính ấm theo dõi tiếp  SVTH NTM Trang 37 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP làm lại tiêu  Khơng thấy Âm tính Âm tính • Lưu ý - Khi xử lý mẫu cấy: Với tuýp bệnh phẩm có nhiều đờm > 5ml , cần bỏ bớt để tránh xử lý khơng hồn - tồn dễ gây ngoại nhiễm Khơng xử lý mẫu đờm > ml nồng độ NaOH cấy cao, máy báo dương sai Ghi số XN, tên bệnh nhân vào tp, mơi trường, lam kính …trước cấy kiểm tra đối chiếu thông tin bước Khi máy báo dương - Máy báo dương cần lấy tube dương ra, in báo cáo tube dương lấy ghi mã số bệnh nhân lên tờ báo cáo, ghi ngày báo dương tube dương vừa lấy để tiện việc theo dõi Tờ báo cáo in cần lưu vào hồ sơ máy MGIT có xem xét - trưởng khoa Với mẫu dương nhuộm soi khơng thấy cần ủ ấm , theo dõi tiếp, 25 ngày làm smear để kiểm tra lại, nên làm đủ lần trước trả kết cuối 3.5 Nuôi cấy môi trường đặc 3.5.1 Nguyên lý [3] Bệnh phẩm phải xử lí trước cấy để loại bỏ vi khuẩn khơng phải Mycobacteria Sau xử lí bệnh phẩm cấy vào môi trường, ủ ấm theo dõi nhiệt độ thời gian thích hợp - Mycobacteria có phát triển thành khuẩn lạc quan sát thấy bề mặt môi trường - Kỹ thuật nuôi cấy có độ nhạy cao, giới hạn phát 10-100 vi khuẩn /ml bệnh phẩm Ni cấy xác định xác vi khuẩn lao thu thập chủng để phát tính kháng thuốc SVTH Trang 38 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP 3.5.2 Hóa chất, mẫu bệnh phẩm, trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm Bảng 3.7 : Hóa chất bệnh phẩm, vật liệu &trang thiết bị mơi trường đặc Hóa chất,bệnh phẩm Vật liệu, trang thiết bị thiết bị Bệnh phẩm : Đờm: – ml có chất Vật liệu: - Tuýp ly tâm: loại 50 ml có nắp xốy nhày mủ, dịch: 20–40 ml, dịch não - Pipet : loại thủy tinh (dùng lại) nhựa tủy, màng tim (5 – 10 ml) Chứa (dùng lần) túyp vô trùng 50 ml, vặn chặt nắp - Lam kính, hộp tiêu Hóa chất : - Dụng cụ bảo hộ lao động cá nhân áo choàng, trang, găng tay… - NaOH (khử tạp tan đờm) - Các vật liệu khác khay để mẫu, dụng - Natri citrat (giữ lại ion kim loại nặng cụ đựng chất thải… để phát huy tác dụng NALC) Bút viết kính, sổ sách, biểu mẫu cần thiết - NALC: N-acetyl L-cystein: Làm tan Trang thiết bị: đờm - Tủ an toàn sinh học cấp II - Máy lắc (votex) - KH2PO4, Na2HPO4 - Hệ thống MGIT BACTEC - Tủ lạnh, tủ mát - Nồi hấp ướt (02 cái: hấp bẩn hấp ) - Nước cất, băng thử pH - Cân (đĩa phân tích) - Máy ly tâm: đạt lực ly tâm 3000 x g, cối - Hóa chất sát khuẩn: cồn 70%, ly tâm rời có nắp đậy, thích hợp cho ly Presept, Javel 5% phenol tâm 50 ml, đáy hình chữ V - Mơi trường lỏng ml gồm: Approximate Foomura, Middlebrook 7H9, nước tinh khiết… - Growth Supplement gồm hợp chất dinh dưỡng thích hợp cho phát triển vi SVTH Trang 39 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP khuẩn lao gồm: Oleic acid, Albumin, Dextrose and Catalase - PANTA: hỗn hợp kháng sinh gồm Polymyxin B, Amphotericin Nalidixic Acid, B, Trimethoprim, Azlocillin Môi trường đặc LJ 3.5.3 Quy trình tiến hành a Chuẩn bị mơi trường nuôi cấy đặc -Tuýp môi trường phải dán nhãn rõ ràng, ghi đủ thông tin: số cấy, tên bệnh nhân, ngày cấy -Số cấy thống từ tuýp bệnh phẩm, phiếu xét nghiệm, sổ xét nghiệm, tuýp môi trường cấy tiêu -Tp mơi trường có nhiều nước phải hút bỏ nước trước cấy -Mỗi mẫu bệnh phẩm cấy vào tuýp môi trường đặc LJ, (hoặc Ogawa phương pháp đơn giản) -Mỗi mẫu cấy làm tiêu nhuộm soi để đánh giá kĩ thuật cấy b Xử lý bệnh phẩm • Đối với bệnh phẩm đờm + Lấy - ml đờm (ít 2ml, không ml) vào tuýp li tâm, thêm lượng ngang dung dịch NALC – NaOH xoáy chặt nắp + Lắc đảo tuýp đờm tan hồn tồn (khơng q 20 giây làm bất hoạt NALC) + Lộn ngược tuýp đờm để hóa chất khử nhiễm tiếp xúc với toàn mặt tuýp SVTH Trang 40 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP + Để đứng tuýp nhiệt độ phòng 15 phút + Thêm dung dịch đệm đến vạch 40 ml, trộn + Li tâm 3000g/15 phút Chắt bỏ + Thêm 0,5-1ml dung dịch đệm, lắc tạo huyền dịch để cấy • Các dịch khác ( dịch não tủy, dịch màng phổi, màng bụng ) - Dịch nhiều, thêm dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:1, trộn - Ly tâm 3.000 x g / 15 phút - Chắt bỏ nước - Thêm 0,5-1ml dung dịch đệm, lắc tạo huyền dịch để cấy - Nếu nghi ngờ ngoại nhiễm, xử lý cặn phương pháp NALC-NaOH Lượng dịch < 2ml (thường gặp dịch màng tim, dịch não tủy) không cần li tâm, dịch vô trùng cấy trực tiếp vào môi trường, nghi ngờ ngoại nhiễm, xử lí theo phương pháp NALC-NaOH c.Cấy vào môi trường (huyền dịch bệnh phẩm khử nhiễm cặn dịch vô trùng sau ly tâm) ủ ấm - Sử dụng riêng pipet nhựa vô trùng chia vạch (hoặc pasteur) cho mẫu cấy - Nhỏ vào tuýp môi trường 0,1 ml huyền dịch (tương đương 2-3 giọt) - Đồng thời nhỏ giọt huyền dịch lên lam kính, làm tiêu để nhuộm ZN - Láng huyền dịch bề mặt môi trường - Để tuýp môi trường nghiêng khay, vặn nắp lỏng - Ủ ấm 35-37 0C SVTH Trang 41 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Hình 3.12 Mơi trường ni cấy đặc 3.5.4 Báo cáo kết • Quy định thời gian theo dõi định kỳ - Kiểm tra nhiễm trùng : sau 24 – 48h - Sau tuần ủ nghiêng tủ ấm, vặn chặt nắp cấy để ống cấy thẳng đứng - Theo dõi vòng ngày phát Mycobacteria mọc nhanh - Đọc kết cấy hàng tuần đến tuần • Tính chất khuẩn lạc - Khuẩn lạc M tuberculosis điển hình dạng R xốp, màu trắng, mọc chậm sau ngày - Khuẩn lạc nhóm Mycobacteria khơng phải lao (NTM) dạng S trơn bóng, nhày, có (hoặc khơng) sắc tố, mọc nhanh vòng ngày • Vấn đề ngoại nhiễm + Nhiễm vi khuẩn: Thường xảy vòng 24 - 48h , thường gặp ống cấy, khử tạp chưa đạt, nhiễm trùng rầm rộ mặt mơi trường nhày, nhớt chí vữa tồn mơi trường Khi nhiễm khuẩn tồn mơi trường chuyển màu, chuyển hóa vi khuẩn sinh acid làm pH môi trường giảm, chất thị Malachalit đổi màu xanh tối, độ đậm màu xanh phụ thuộc vào lượng vi khuẩn mơi trường Khi nhiễm tồn ống cấy M.tuberculosis mọc điều kiện pH thấp, phải hủy bỏ ống cấy Hiếm gặp nhiễm khuẩn muộn, thường nhiễm phần ống cấy, tiếp tục q trình ủ ấm, có khuẩn lạo lao cần phân lập cấy chuyển chủng + Nhiễm nấm : Thường xảy trình tuần ủ ấm ( tủ ấm, buồng ấm) phát sớm nấm mọc rải rác phân lập chủng vi khuẩn lao mọc lẫn môi trường, phát muộn thường chủng, nấm mọc kín mơi SVTH Trang 42 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP trường Nhiễm nấm sớm thường bệnh phẩm bị nhiễm nấm công cụ thao tác, nấm mọc phong phú sau vài ngày đến tuần, phả hủy ống Hình khuẩn 3.13 Khuẩn lạc MTB Hình 3.14 Tuýp cấy bị ngoại nhiễm Bảng 3.8 Quy định trả kết Môi trường đặc [3] Kết cấy Kết định Trả kết danh MTB Ngoại nhiễm ống cấy SVTH Ngoại nhiễm Trang 43 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP khơng phân lập khuẩn lạc lao Dương tính Dương tính M.tuberculosis Âm tính NTM (số lượng khuẩn lạc) ( lần 1) Cấy thêm mẫu Âm tính NTM ( mẫu có KQ (lần 2) giống nhau) Âm tính Âm tính - Mẫu cấy âm tính trả kết sau tuần - Mẫu cấy ngoại nhiễm trả kết phát ngoại nhiễm - Mẫu cấy dương tính phải định danh trước trả kết - Mẫu cấy nghi NTM yêu cầu cấy thêm mẫu khác, mẫu có loại NTM kết cấy có giá trị Lưu ý - Để đảm bảo chất lượng cấy XNV phải thực nghiêm ngặt qui trình kỹ thuật, phải đào tạo, có kĩ cần kinh nghiệm - Phải phân loại mẫu trước xử lí: dịch vơ trùng, dịch lẫn máu, đờm tươi, đờm bảo quản, nguồn mẫu từ địa khác MDR, bệnh nhân thường để xử lí thích hợp - Xử lí mẫu sớm tốt Mẫu bảo quản - 0C không 72 giờ, dịch dày, nước tiểu xử lí sớm trước kể từ lấy mẫu - Mỗi mẻ xử lí - mẫu + Ly tâm đủ 3000g/15-20 phút, nhiệt độ 10 C, máy ly tâm thường, nên có khoảng chờ lần ly tâm để nhiệt độ máy giảm xuống + Tn thủ qui trình xử lí: nồng độ hóa chất, thời gian tiếp xúc Xử lí mạnh làm chết vi khuẩn lao, xử lí khơng đạt tăng tỉ lệ ngoại nhiễm Trường hợp đặc biệt tăng thể tích nồng độ hóa chất, khơng kéo dài thời gian khử nhiễm SVTH Trang 44 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tránh nhiễm chéo nhầm lẫn, không mở đồng thời tuýp mẫu Chia nhỏ + lượng dung dịch khử nhiễm dung dịch đệm, không chắt trực tiếp dung dịch khử nhiễm hay dung dịch đệm vào bệnh phẩm + Mơi trường, hóa chất, sinh phẩm dụng cụ hạn sử dụng vô trùng + Kiểm tra cẩn thận hành từ khâu nhận bệnh phẩm, vào sổ, trả kết để tránh nhầm lẫn 3.6 Phương pháp định danh vi khuẩn lao test TbcID 3.6.1 Nguyên lý [2] Thử nghiệm sắc kí miễn dịch phát kháng nguyên MPT 64 đặc trưng M tuberculosis complex cách nhỏ mẫu cấy dương tính vào giếng thử, kháng ngun MPT 64 (nếu có mẫu cấy) kết hợp với kháng thể kháng MPT 64 gắn thử tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên, phức hợp di chuyển tới vùng phản ứng giữ lại kháng thể cố định thứ Nếu mẫu cấy có mặt kháng nguyên MPT 64, vùng phản ứng xuất vạch màu hồng - đỏ Cấu tạo thử: Trên bề mặt thử có giếng thử “S” để nhỏ mẫu, cửa sổ đọc kết có ký tự T “Test Line -vạch thử nghiệm” C “Control Line – vạch chứng” Cả vạch T C không xuất trước thực thử nghiệm Sau thử nghiệm vạch chứng ln xuất tiến trình xét nghiệm thực thử tình trạng tốt Vạch thử nghiệm xuất có đủ kháng nguyên MPB64 vi khuẩn lao Nếu mẫu thử khơng có kháng ngun MPT64 có hàm lượng thấp khơng có vạch màu xuất vùng T 3.6.2 Hóa chất, mẫu bệnh phẩm , trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm Bảng3.9 Hóa chất trang thiết bị định danh TbcID Trang thiết bị & dụng cụ thí nghiệm Hóa chất, mẫu bệnh phẩm SVTH Trang 45 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP + Tp MGIT dương tính có AFB tiêu nhuộm ZN (hình ảnh AFB cuộn thừng khơng) + Kít MTB 64 + MicroPipette pipette nhựa vơ trùng + Đầu côn vô trùng + Giá đựng + Tp vơ trùng + Thùng rác có nắp đậy Bảo hộ cá nhân: áo choàng, găng tay, trang N 95 + Tủ an toàn sinh học cấp 3.6.3 Quy trình tiến hành a Đối với tuýp MGIT(+) - Lấy sinh phẩm khỏi tủ bảo quản, để nhiệt độ phòng khoảng 15 – 30 phút - Lấy thử khỏi túi, đặt mặt phẳng tủ ATSH - Ghi số xét nghiệm lên thử - Trộn nhẹ nhàng canh khuẩn ống MGIT (+) pipet nhựa vô trùng - Nhỏ giọt (hoặc 100 µl) huyền dịch MGIT(+) vào giếng thử “S” Huyền dịch thấm từ giếng thử qua vùng T vùng C - Đọc kết sau 15 phút b Đối với khuẩn lạc môi trường đặc - Lấy sinh phẩm khỏi tủ bảo quản, để nhiệt độ phòng khoảng 15 – 30 phút - Lấy thử khỏi túi, đặt mặt phẳng tủ ATSH - Dùng túyp thủy tinh vơ trùng có nắp vặn 16x 125mm - Ghi số xét nghiệm lên thành túyp thử - Dùng pipet hút 0.2 ml (200 µl) dung dịch đệm (cung cấp sinh phẩm) cho vào tuýp - Lấy ăng khuẩn lạc môi trường đặc cho vào túyp trộn đều, đậy nắp túyp vortex tạo thành huyền dịch, - Để yên phút để cặn lắng xuống SVTH Trang 46 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP - Hút phần huyền dịch phía nhỏ giọt (100 µl) vào giếng thử “S” Huyền dịch thấm từ giếng thử qua vùng T vùng C - Đọc kết sau 15 phút Hình 3.15 Kết định danh test TbcID 3.6.4 Báo cáo kết - • Đọc kết Dương tính: Xuất vạch màu vùng “C” vùng “T” Vạch màu hồng đỏ với đậm độ khác tùy thuộc nồng độ kháng nguyên MPT 64 - Âm tính: Chỉ xuất vạch màu vùng “C”, khơng có vạch màu vùng “T” - Khơng có vạch màu vùng “C”, khơng phân tích kết quả, phải làm lại xét nghiệm - • Báo cáo kết Thử nghiệm dương tính trả kết MTB complex (MTBc) - Thử nghiệm âm tính trả kết AFB, non – MTBc (NTM) Lưu ý SVTH Bảo hộ cá nhân thích hợp: Khẩu trang hơ hấp (N95) áo chồng, găng tay Trang 47 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP - Làm thử nghiệm tủ an toàn sinh học loại 2, vận hành tủ qui trình - Thao tác nhẹ nhàng cẩn thận theo quy trình chuẩn - Sử dụng hóa chất sát khuẩn phù hợp với vi khuẩn lao - Xử lý tất đồ thải bỏ nhiễm khuẩn theo qui định CHƯƠNG QUY TẮC AN TOÀN & VỆ SINH TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM 4.1 Quy tắc quản lý phòng thí nghiệm Để trì điều kiện vơ khuẩn bên phòng thí nghiệm cần có quy tắc quản lý phòng thí nghiệm chặt chẽ - Chỉ cán có nhiệm vụ, chun mơn thao tác phòng thí nghiệm vào phòng Sinh viên thực tập người ngồi vào phòng cần có hướng dẫn cán - Tất vật dụng mang vào phòng thí nghiệm cần lau phun cồn sát trùng - Không tự ý mang vật dụng phòng thí nghiệm ngồi - Trước vào phòng thí nghiệm cần vệ sinh thể, bỏ lại vật dụng cá nhân bên ngoài, mặc áo blouse đeo trang y tế - Mang găng tay trước thực thao tác phòng thí nghiệm - Sau thực xong thí nghiệm trước rời khỏi phòng phải rửa tay xà phòng nước rửa tay sát khuẩn - Phân loại rác thải cho vào thùng chứa theo loại chất thải 4.2 Quy tắc an toàn lao động Khi làm việc Bệnh viện, cần tuyệt đối tuân thủ quy tắc an toàn lao động để tự bảo vệ người xung quanh Các quy tắc an toàn sau: - Ln ưu tiên phòng tránh tai nạn giải hậu sau tai nạn xảy - Sử dụng trang bị, dụng cụ bảo hộ cá nhân công việc - Tuân thủ hướng dẫn an toàn sử dụng máy móc, thiết bị dụng cụ Tuân thủ qui tắc an toàn sử dụng điện dụng cụ điện - Kiểm tra chất lượng dụng cụ thiết bị sử dụng trước làm việc - Đảm bảo khu vực làm việc gọn gàng, khơng có vật hay yếu tố gây nguy hiểm q trình làm việc - Khơng hút thuốc khu vực Bệnh viện - Tuân thủ quy tắc an tồn phòng chống cháy nổ Bệnh viện SVTH Trang 48 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Trong trường hợp mẫu thực xét nghiệm lỗi thiết bị, điện, hóa chất : Xem quy trình gián đoạn dịch vụ, mã… KẾT LUẬN Sau thời gian thực tập tìm hiểu phương pháp xét nghiệm chẩn đoán lao Bệnh viện phổi Đà Nẵng, thu nhận kết sau: • Về kiến thức: - Biết cấu tạo, nguyên lí, chức cách sử dụng loại máy móc, thiết bị sở thực tập - Hiểu quy trình kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn lao như: phương pháp nhuộm soi trực tiếp, phương pháp xét nghiệm GENE XPERT, phương nuôi cấy môi trường lỏng, nuôi cấy môi trường đặc, định danh TbcID, - Nắm bắt quy trình từ lấy mẫu bệnh phẩm đến xử lý, xét nghiệm trả kết cho bệnh nhân, - Được tiếp cận nhiều phương pháp, kỹ thuật đại chẩn đoán bệnh, • Về kỹ năng: - Đợt thực tập sở giúp vận dụng lý thuyết học vào thực tiễn cách tốt - Sử dụng thành thạo máy móc thiết bị, thực xác thao tác kỹ thuật, nhằm phục vụ cho q trình thực hành - Có khả xử lý xảy cố không mong muốn - Nâng cao kỹ tìm kiếm dịch tài liệu, mở rộng tầm kiến thức - Hình thành khả tư duy, suy nghĩ độc lập, đồng thời rèn luyện kỹ làm việc nhóm, tính chủ động, sáng tạo có trách nhiệm cơng việc • Về thái độ: - Quá trình thực tập Bệnh viện phổi Đà Nẵng giúp tơi có nhìn sâu rộng ngành Cơng nghệ sinh học nói chung chuyên ngành Sinh học phân tử nói riêng, từ tơi thêm u ngành nghề học, điểm tựa giúp tơi hướng tới dự định sau - Ngoài ra, thực tập mơi trường có tính chun mơn cao, nhiệt tình, hòa đồng cách xử giao tiếp người, cách làm việc nhóm, hỗ trợ phối hợp lẫn trình làm việc, giúp tơi rèn luyện tính chun nghiệp làm việc môi trường khác SVTH Trang 49 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Chương trình chống lao quốc gia (2009), “Hướng dẫn quản lý bệnh lao”, Bộ Y tế, NXB Y học [2] Chương trình chống lao Quốc gia (2012), Hướng dẫn quy trình thực hành chuẩn xét nghiệm vi khuẩn lao, Bộ Y tế [3] Điều lệ tổ chức hoạt động bệnh viện Lao Bệnh phổi Đà Nẵng, Ban hành kèm theo Quyết định số 378/QĐ-SYT, ngày 22/7/2014 Giám đốc Sở Y tế thành phố Đà Nẵng [4] Đinh Ngọc Sỹ (2010), Hướng dẫn kiểm soát vi khuẩn Lao sở y tế, khu vực đơng người hộ gia đình Việt Nam, Chương trình phòng chống Lao quốc gia,NXB Hà Nội [5] Nguyễn Văn Mùi, An toàn sinh học, NXB Giáo dục, 2008 [6] Quyết định việc ban hành hướng dẫn Quy trình triển khai kỹ thuật Gene Xpert Số 4921/QĐ-BYT 26/12/2011 [7] http://www.hoinongdan.org.vn/sitepages/news/54/44539/viet-nam-va-noi-lo-laokhang-da-thuoc [8] https://vi.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis [9] http://www.benhvien103.vn/vietnamese/bai-giang-chuyen-nganh/vi-sinh-vat/vikhuan-lao-vi-khuan-phong/1172/ Tiếng Anh [9] J Clin Microbiol, (2010), “Evaluation of the Analytical performance of the Xpert MTB/RIF assay”, Robert Blakemore [10] GeneXpert DX System, Operation Manual, Software version 2.1, Cepheid 2008 [11] Rapid Implementation of the Xpert MTB/RIF diagnostic test, Technical and Operational “How-to” practical considerations, WHO/HTM/TB/2011.2 SVTH Trang 50 ... xử lý vào cối ly tâm B2 : Đ y nắp thết độ tốc độ ly tâm, thời gian ly tâm SVTH Trang 10 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP B3 : Bấm starst • Lưu ý sử dụng: - Cho mẫu cần ly tâm vào m y với thể tích... nuôi c y Nhập ống MGIT vào m y Môi trường nuôi c y đặc Khuẩn lạc MTB Tuýp c y bị ngoại nhiễm Kết test định danh TbcID SVTH[Type text] Trang 17 18 19 20 23 25 32 33 33 37 BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP... Polymerase Chain Reaction PXN Phòng Xét Nghiệm WHO Tổ chức Y tế giới RIF Rifampicin SVTH[Type text] Trang BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP UBND y ban nhân dân SOP Standard Operating Procedure (Quy