BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN MINH GIANG KHAI THÁC DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA β-XYLOSIDASE TỪ VI SINH VẬT RUỘT MỐI Coptotermes gestroi Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 62 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, tháng 01 năm 2018 Công trình hồn thành tại: Tổ Di truyền học, khoa Sinh học, Trường ĐHSP Hà Nội Phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Trƣơng Nam Hải PGS.TS Đặng Hữu Lanh Phản biện 1: GS.TS Phan Hữu Tồn Phản biện 2: GS.TS Chu Hoàng Mậu Phản biện 3: PGS.TS Lê Huy Hàm Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi 00 ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Lignocellulose thành phần sinh khối thực vật tự nhiên thải với khối lượng lớn Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn sinh khối từ phế phẩm nơng nghiệp rơm, rạ, bã mía,… lên đến 50 triệu Đây nguyên liệu nhiều ngành công nghiệp để tạo sản phẩm có giá trị cồn sinh học, chất dinh dưỡng bổ sung cho người vật nuôi, Hiện biện pháp xử lý phế phẩm chủ yếu đốt gây lãng phí lớn, ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống sức khoẻ người Trong phương pháp xử lý sinh khối thực vật, phương pháp sử dụng tác nhân vật lý hóa học có nhiều nhược điểm hiệu suất tạo đường đơn thấp, yêu cầu thiết bị chuyên dụng phù hợp với giá thành cao, dung môi tồn dư sản phẩm gây vấn đề mơi trường,… Phương pháp xử lý enzyme có nhiều ưu điểm vượt trội chủ động điều khiển phản ứng sản phẩm giai đoạn chuyển hóa, khơng tồn dư hóa chất nên thân thiện với mơi trường,… Vì việc tìm kiếm sản xuất nguồn enzyme thủy phân sinh khối thực vật, quan tâm hầu hết quốc gia giới có Việt Nam Trong thành phần lignocellulose hemicellulose có cấu trúc phức tạp không đồng nhất, gồm nhiều loại phân tử sinh học khác Do để chuyển hóa triệt để hemicellulose cần nhiều nhóm enzyme như: xylanase, β-xylosidase, arabinofuranosidase, α-glucuronidase, acetyl xylan esterase, α-galactosidase, arabinanase, … Beta-xylosidase enzyme có khả cắt vị trí đầu khơng khử mạch xylan phân tử đường đơi xylobiose thành đường đơn xylose, nên cần thiết hệ thống enzyme chuyển hóa hemicellulose Mối lồi có khả tiêu hóa lignocellulose hiệu hỗ trợ hàng loạt enzyme cellulase, hemicellulase có nguồn gốc từ vi sinh vật sống ruột mối Việc tìm kiếm lignocellulase từ vi sinh vật sống ruột mối hướng nhiều nghiên cứu quan tâm Tuy nhiên hầu hết vi sinh vật ruột mối chưa nuôi cấy được, nên việc khai thác nguồn lignocellulase trước bị hạn chế Hiện với đời kỹ thuật Metagenomics cho phép giải trình tự tồn hệ gen quần xã sinh vật thu trực tiếp từ mẫu môi trường Kết giải trình DNA đa hệ gen tạo nguồn liệu khổng lồ khó xử lý phương pháp thủ công, mà nhờ hỗ trợ hàng loạt công cụ tin sinh học đại liên tục xuất hiện, cập nhật cải tiến Đây sở thúc đẩy đời dự án nghiên cứu DNA đa hệ gen hệ vi sinh vật có khả chuyển hóa lignocellulose, có nghiên cứu DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối Từ hỗ trợ tài đề tài hợp tác Việt Nam - Nhật Bản "Phân lập gen mã hóa enzyme lignocellulolytic vi sinh vật ruột mối Việt Nam kỹ thuật Metagenomics” giai đoạn 20122015, DNA đa hệ gen vi sinh vật sống ruột mối Coptotermes gestroi tách chiết đọc trình tự Sau xử lý số liệu xác định 587 ORF mã hóa cho enzyme thủy phân lignocellulose Cách tìm kiếm lựa chọn gen mã hóa lignocellulase từ 587 ORF sử dụng phương pháp thủ công sau: Đầu tiên chọn gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose theo ước đốn ban đầu cơng ty giải trình tự Sau khảo sát vùng bảo thủ protein thiết lập sơ phát sinh loại enzyme Cuối lựa chọn ORF theo tiêu chí (1) trình tự mới, (2) trung tâm hoạt tính rõ ràng, đặc hiệu (3) trình tự đơn giản dễ biểu Tuy nhiên cách chọn gen nhiều thời gian liệu DNA đa hệ gen lớn Hơn nữa, phần lớn gen chọn khó biểu thành cơng Ví dụ, sau chọn gen để đưa vào biểu 06 gen khơng biểu biểu khơng tan có 02 gen biểu hiện, enzyme có hoạt tính yếu Những hạn chế nghiên cứu trước đặt yêu cầu phải xây dựng phương pháp hiệu quả, để tìm kiếm nhanh gen đích mã hóa lignocellulase từ liệu DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi phải có hoạt tính enzyme mục tiêu sau biểu Ngoài ra, đa dạng hệ vi khuẩn enzyme thủy phân lignocellulose ruột mối chưa nghiên cứu Đây lý để chúng tơi tiến hành đề tài: “KHAI THÁC DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA β-XYLOSIDASE TỪ VI SINH VẬT RUỘT MỐI Coptotermes gestroi Ở VIỆT NAM” Mục tiêu 2.1 Mục tiêu chung Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn enzyme thủy phân lignocellulose ruột mối C gestroi từ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen Đồng thời xây dựng phương pháp hiệu để tìm kiếm nhanh gen đích mã hóa lignocellulase từ liệu DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi phải có hoạt tính enzyme mục tiêu sau biểu 2.2 Mục tiêu cụ thể - Khai thác liệu DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi có để nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn enzyme thủy phân lignocellulose; - Xây dựng phương pháp hiệu để tìm kiếm gen mục tiêu từ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi; - Nghiên cứu biểu gen Xbx14 tính chất enzyme tham gia thủy phân lignocellulose Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn lignocellulase theo hệ thống phân loại CAZY từ liệu DNA đa hệ gen hệ vi khuẩn ruột mối C gestroi thiết lập; - Tìm kiếm trình tự axit amin β-xylosidase nghiên cứu chi tiết tính chất lựa chọn công cụ tin sinh học đáng tin cậy để xây dựng mẫu dò Sử dụng mẫu dò để tìm kiếm nhanh gen mã hóa βxylosidase từ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi; - Biểu nghiên cứu tính chất β-xylosidase Đối tƣợng Dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật sống ruột mối C gestroi phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; số nguồn liệu khai thác CSDL công cụ tin sinh học Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm hệ vi khuẩn ruột mối C gestroi phương pháp xây dựng mẫu dò phục vụ cho việc khai thác lựa chọn gen mong muốn từ liệu đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi có Thực nghiệm biểu gen tế bào E coli Rosseta xác định đặc điểm β–xylosidase Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 6.1 Ý nghĩa khoa học Đã phân tích hệ vi khuẩn sống ruột mối C gestroi Việt Nam đa dạng lignocellulase theo phân loại CAZY; Cung cấp phương pháp hiệu cho việc tìm kiếm gen mục tiêu từ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen mẫu dò xây dựng dựa trình tự axit amin β-xylosidase công cụ tin sinh học; Đã biểu xác định hoạt tính β-xylosidase từ vi sinh vật tự ruột mối C gestroi 6.2 Ý nghĩa thực tiễn β-xylosidase enzyme mới, có hoạt tính tốt, hoạt động tối ưu mơi trường kiềm nhiệt độ cao Đây enzyme hứa hẹn mang lại hiệu cao ứng dụng thực tế thủy phân lignocellulose, đặc biệt kết hợp với phương pháp tiền xử lý sinh khối thực vật kiềm nhiệt Đóng góp luận án Đây nghiên cứu hệ vi khuẩn sống tự đa dạng enzyme thủy phân lignocellulose theo phân loại CAZY từ liệu DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi Việt Nam; Đã xây dựng ứng dụng thành cơng mẫu dò dựa phân tích trình tự axit amin thuộc nhóm βxylosidase nghiên cứu thực nghiệm Sử dụng mẫu dò tìm kiếm gen mã hóa cho β-xylosidase từ liệu trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi; β–xylosidase enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ruột mối C gestroi Việt Nam, biểu tinh chế thành cơng, với hoạt tính tốt, hoạt động tối ưu môi trường kiềm nhiệt độ cao Nơi thực đề tài luận án Luận án nghiên cứu thực nghiệm phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tổ Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội từ tháng 12 năm 2013 đến tháng năm 2017 Chƣơng TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 LIGNOCELLULOSE VÀ QUÁ TRÌNH CHUYỂN HĨA 1.1.1 Lignocellulose: Trình bày vai trò thành phần cấu tạo lignocellulose 1.1.2 Sự chuyển hóa lignocellulose: Mơ tả hệ thống enzyme tham gia chuyển hóa lignocellulose 1.2 METAGENOMICS VÀ CÔNG CỤ TIN SINH HỌC KHAI THÁC DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN 1.2.1 Metagenomics: Trình bày khái niệm chung Metagenomics, cách tiếp cận nghiên cứu ứng dụng 1.2.2 Một số công cụ tin sinh sử dụng để phân tích số liệu Mơ tả nguồn gốc, sở xây dựng liệu, cách sử dụng, độ tin cậy số công cụ tin sinh học sử dụng phân tích số liệu luận án bao gồm: BLAST, EXPASY, Phyre 2, Swiss model, TBI, Alcapred Phylogeny,… 1.2.3 Các nguồn liệu: Mô tả chi tiết bao gồm nguồn gốc, lượng liệu, cập nhật liệu độ tin cậy hai nguồn liệu sử dụng nghiên cứu gồm CAZY NCBI 1.2.4 Mẫu dò DNA ứng dụng Sơ lược chung mẫu dò DNA ứng dụng, đặc biệt nghiên cứu mẫu dò sử dụng phân tích DNA đa hệ gen 1.3 ENZYME β–xylosidase Nêu tổng quan enzyme β–xylosidase bao gồm tên gọi, mơ hình hoạt động, cấu trúc khơng gian, hoạt tính, ứng dụng nguồn cung cấp 1.4 KHU HỆ VI SINH VẬT VÀ ENZYME CHUYỂN HÓA LIGNOCELLULOSE 1.4.1 Một số khu hệ vi sinh vật chuyển hóa lignocellulose Tổng quan chung khu hệ vi sinh vật chuyển hóa lignocellulose tự nhiên 1.4.2 Hệ vi sinh vật enzyme thủy phân lignocellulose ruột mối Mô tả đặc điểm sinh học mối đa dạng vi sinh vật cộng sinh ruột mối – nguồn khai thác enzyme xử lý phân hủy lignocellulose 1.4.3 Tổng quan nghiên cứu đa dạng vi sinh vật enzyme chuyển hóa lignocellulose ruột mối C gestroi Việt Nam Tóm tắt kết nghiên cứu mối, hệ vi sinh vật, enzyme thủy phân lignocellulose ruột C gestroi Việt Nam, cách chọn gen để biểu từ liệu DNA đa hệ gen vấn đề cần giải nghiên cứu Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tƣợng Sử dụng liệu trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi thích cơng ty giải trình tự BGI, bao gồm 125.432 ORF Trong có 587 ORF mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose làm nguồn liệu để chọn trình tự gen mã số Termite 2_ GL0112518 mã hóa β–xylosidase 2.1.2 Hóa chất thiết bị máy móc Các loại hóa chất: Hóa chất sử dụng nghiên cứu đặt mua từ công ty đạt tiêu chuẩn quốc tế Bio-Lab (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức) Nghiên cứu sử dụng máy móc phòng Cơng nghệ trọng điểm, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phƣơng pháp xây dựng mẫu dò Để xây dựng mẫu dò cho enzyme β–xylosidase nghiên cứu thực theo sơ đồ hình 2.2 Hình 2.2 Sơ đồ bước xây dựng mẫu dò 2.2.2 Các phƣơng pháp xử lý số liệu phần mềm tin sinh học Phân tích đa dạng lồi vi sinh vật điển hình ruột mối C gestroi; Phân tích đa dạng ORF enzyme thủy phân lignocellulose theo phân loại CAZY; So sánh trình tự ORF liệu DNA đa hệ gen với sở liệu NCBI BLAST; Thiết kế mồi phần mềm FastPCR; Kiểm tra vị trí enzyme hạn chế gen quan tâm phần mềm trực tuyến RestrictionMapper; Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin chương trình dịch mã EXPASY; Dự đốn cấu trúc Xbx14 phần mềm Phyre2 Swiss model; Dự đốn nguồn gốc gen cơng cụ BLAST-Explorer; Xác định độ protein Xbx14 sau tinh chế phần mềm Quantity One 2.2.3 Các phƣơng pháp vi sinh: Giữ chủng E coli; cấy ria tạo khuẩn lạc đơn; nuôi cấy vi khuẩn 2.2.4 Các phƣơng pháp sinh học phân tử: Giải trình tự DNA máy giải trình tự hệ HiSeq2000 Illumina, biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E coli sốc nhiệt, tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli, cắt kiểm tra gen, điện di DNA gel agarose, đồng biểu gen 2.2.5 Các phƣơng pháp hóa sinh protein: Phương pháp điện di biến tính protein gel polyacrylamide – SDS, tinh chế protein tủa phân đoạn, định lượng axit nucleic/protein phương pháp đo mật độ quang, phương pháp xác định hoạt tính β–xylosidase, xác định ảnh hưởng nhiệt độ pH, xác định độ bền enzyme, phương pháp xác định thông số động học enzyme Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ LIGNOCELLULASE THEO HỆ THỐNG PHÂN LOẠI CỦA CAZY TỪ DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN CỦA VI SINH VẬT TRONG RUỘT MỐI C gestroi 3.1.1 Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn sống ruột mối C gestroi 3.1.1.1 Thành phần lồi vi khuẩn có số lượng ORF lớn ruột mối C gestroi Nghiên cứu trước sử dụng kỹ thuật Metagenomics giải trình tự đa hệ gen vi sinh vật sống ruột mối C gestroi Việt Nam Trên sở liệu chúng tơi tập trung vào phân tích vi sinh vật chiếm số lượng lớn theo thống kê ban đầu vi khuẩn Đây nhóm vi sinh vật tiết lignocellulase định việc thủy phân hoàn toàn lignocellulose thức ăn mối bậc thấp mối bậc cao Dựa số liệu dự đoán lồi, chúng tơi tiến hành lọc thống kê 20 lồi vi khuẩn có số lượng lớn 300 ORF (Hình 3.1) Hình 3.1 Biểu đồ thống kê 20 lồi vi khuẩn có ORF lớn ruột C gestroi 3.1.1.2 Đặc điểm loài vi khuẩn giúp C gestroi chuyển hóa Nitơ Tham gia vào trình chuyển hóa Nitơ gồm có sáu lồi Treponema primitia, Treponema azotaurricium, Candidatus Azobacteroides pseudotrichonymphae, Aminobacterium colombiense, Aminomonas paucivorans, Stenotrophomonas maltophilia Trong ba lồi Aminobacterium colombiense, Aminomonas paucivorans Stenotrophomonas maltophilia có C gestroi 3.1.1.3 Đặc điểm lồi vi khuẩn giúp C gestroi chuyển hóa lignocellulose Vi khuẩn sống ruột C gestroi có 16 loài với số lượng ORF lớn tham gia vào trình chuyển hóa lignocellulose, bao gồm: Treponema primitia, Treponema azotaurricium, Lactococcus raffinolactis, Lactococcus lactis, Lactococcus garvieae, Spirochaeta caldaria, Enterobacter cloacae, Mahella australiensis, Tannerella forsythia, Delftia acidovorans, Dethiosulfovibrio peptidovoran, Blastopirellula marina, Pseudomonas fluorescens, Yokenella regensburgei, Dysgonomonas gadei D mossii (Hình 3.1) Trong số 16 lồi điển hình tham gia chuyển hóa lignocellulose trên, lồi xuất ruột mối C gestroi bao gồm: Mahella australiensis, Blastopirellula marina, Yokenella regensburgei (Koserella trabulsii), Delftia acidovorans, Dethiosulfovibrio peptidovorans Tóm lại, dựa số lượng ORF ước đoán từ liệu DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi Việt Nam, chúng tơi tìm thấy 20 lồi vi khuẩn với số lượng ORF lớn, có 03 lồi tham gia chuyển hóa Nitơ 05 lồi tham gia thủy phân lignocellulose khơng có lồi mối khác, giúp C gestroi tồn phát triển điều kiện nguồn thức ăn giàu lignocellulose thiếu hụt Nitơ Như kết nghiên cứu đa dạng lồi vi khuẩn có số ORF lớn ruột mối C gestroi bổ sung thêm kết hệ vi sinh vật sản xuất lignocellulase khơng có động vật nguyên sinh mà vi khuẩn góp phần cung cấp enzyme cần thiết cho mối tiêu hóa hiệu thức ăn 3.1.2 Nghiên cứu đa dạng lignocellulase vi sinh vật sống ruột mối C gestroi 3.1.2.1 Đa dạng ORF mã hóa lignocellulase theo phân loại CAZY Theo ước đốn ban đầu cơng ty giải trình tự BGI có 587 ORF mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose từ liệu trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi Để đánh giá đa dạng enzyme này, tiến hành xếp chúng vào hệ thống GH bảng phân loại CAZY Dựa vào kết phân tích CAZY, dễ dàng so sánh với kết nghiên cứu tương tự từ loài mối khác Kết chi tiết trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 So sánh họ enzyme thủy phân lignocellulose (GH) vi sinh vật cộng sinh ruột mối C gestroi với số loài mối khác GH C gestroi (sinh vật cộng sinh)1 Nasutitermes (sinh vật cộng sinh)2 R speratus (sinh vật cộng sinh)3 R flavipes (sinh vật cộng sinh)4 R flavipes (sinh vật nội sinh)5 GH1 GH2 187 36 22 23 – – – GH3 GH4 GH5 GH6 GH7 GH8 GH9 GH10 GH11 GH12 GH13 GH16 GH17 GH18 GH20 GH23 GH25 GH26 GH27 GH28 GH30 GH31 GH32 GH35 GH36 GH37 GH38 GH39 GH42 GH43 GH44 GH45 GH47 GH51 GH52 GH53 GH55 GH57 GH58 GH62 GH65 GH67 GH68 GH70 GH74 GH76 GH77 GH78 GH79 GH82 GH85 GH86 GH87 GH88 205 116 136 21 20 13 16 39 52 10 – – – 24 2 16 44 – 50 30 60 – – 50 – – – – 20 – – – 1 18 – – 69 14 56 – – 46 14 – 48 – 17 15 52 15 – 26 – – 11 24 16 – 18 12 – 17 – 10 – – – 14 – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – 10 – 11 – 35 – 10 – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – 10 – 10 – – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – GH91 – – – – GH92 – – – GH93 – – – – GH94 68 – – – GH95 – 12 – – – GH97 – – – – GH98 – – – – GH10 – – – – GH10 – – – – GH10 – – – – GH11 – – – – GH11 – – – – GH11 – – – – GH11 40 – – – – GH11 – – – – GH12 – – – – GH12 – – – – GH13 10 – – – – Do et al., 2014 (số liệu giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi phương pháp Metagenomics Warnecke et al (số liệu giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật cộng sinh ruột mối Nasutitermes phương pháp Metagenomics việc lập ngân hàng DNA đa hệ gen) Todaka et al (số liệu giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật cộng sinh ruột mối R speratus phương pháp lập ngân hàng cDNA) Tartar et al (số liệu giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật cộng sinh ruột mối R flavipes phương pháp lập ngân hàng cDNA) Tartar et al (số liệu giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật nội sinh ruột mối R flavipes phương pháp lập ngân hàng cDNA) * GH sử dụng theo phân loại theo liệu CAZY trang web: http://www.CAZY.org/ Dấu -: khơng có; dấu • khơng xác định số lượng gen Từ kết so sánh cho thấy đa dạng số họ GH số lượng ORF thuộc họ GH ruột C gestroi Chúng đặc biệt quan tâm đến họ GH xuất ruột mối C gestroi để xác định khả phân giải thành phần lignocellulose, từ đưa hướng khai thác chọn gen từ liệu DNA đa hệ gen có sẵn Trong họ GH theo phân loại CAZY, họ GH117 GH130 tham gia thủy phân chuỗi nhánh hemicellulose Hai họ enzyme xuất ruột mối C gestroi với số lượng ORF lớn 40 (GH117) 10 ORF (GH130) Điều chứng tỏ, ruột mối C gestroi có khả thủy phân mạch nhánh dimer có nguồn gốc từ hemicellulose hiệu Sự phong phú hemicellulase từ liệu DNA đa hệ gen mối C gestroi sở thuận lợi để lựa chọn gen mã hóa enzyme phân hủy hemicellulose nghiên cứu thực nghiệm 3.1.2.2 Đa dạng ORF mã hóa β-xylosidase theo phân loại CAZY Trong nghiên cứu quan tâm đến nhóm hemicellulase enzyme có ý nghĩa lớn q trình thủy phân hemicellulose β–xylosidase Theo ước đốn cơng ty giải trình tự BGI, ruột mối C gestroi, có 48 ORF mã hóa β–xylosidase, 23 ORF phân loại vào 13 lồi, số lại chưa loại đến loài Các ORF xếp vào GH khác chiếm ưu GH43, 51, 116 Trong số họ GH chứa β–xylosidase họ GH43 xuất nhiều loài vi khuẩn khác Đặc biệt loài Treponema primitia chứa ORF GH (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Đa dạng ORF GH β–xylosidase ruột mối C gestroi Loài Số ORF GH Loài Số ORF GH Bacteroides eggerthii 43 Lactococcus raffinolactis 43, 116 Clostridium hathewayi 51 Leeuwenhoekiella blandensis 1 Coprococcus eutactus 43 Marvinbryantia formatexigens 1, 43, 116 Paenibacillus 1, 3, 5, 10, 39, 1 Treponema primitia mucilaginosus 43, 51, 116 Enterobacter mori 43, Treponema azotonutricium 51 116 Mahella australiensis Dysgonomonas gadei 43, 51, 116 Mitsuokella multacida 1, 51 3.2 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP TÌM KIẾM GEN MÃ HÓA β–XYLOSIDASE TỪ DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN CỦA VI SINH VẬT TRONG RUỘT MỐI C gestroi Chúng tiến hành xây dựng phương pháp để chọn gen từ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen có mẫu dò Phương pháp xây dựng mẫu dò dựa lý thuyết trình tự axit amin loại enzyme có vùng trình tự bảo thủ gốc hoạt tính bảo tồn giống Khi có mẫu dò tìm nhanh trình tự gen đích từ liệu DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi Gen chọn mã hóa enzyme đích sau biểu có hoạt tính tốt Cụ thể bước xây dựng mẫu dò tiến hành để tìm kiếm gen mã hóa β–xylosidase từ liệu trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi sau: 3.2.1 Xác định họ GH chứa β–xylosidase theo CAZY Nghiên cứu sử dụng bảng phân loại CAZY để xác định β–xylosidase thuộc họ GH, với đặc điểm chi tiết cấu trúc không gian, thành phần axit amin cho nhận proton trình hoạt động enzyme Dựa bảo tồn cao cuộn gấp cấu trúc không gian protein, xếp vào nhóm lớn “clan” Kết enzyme thuộc bốn “clan” GH-A, GH-D, GH-F, GH-O xếp vào 11 họ GH1, 3, 30, 31, 39, 43, 51, 52, 54, 116, 120 Các thông tin chi tiết họ tổng hợp bảng 3.3 Bảng 3.3 Các họ GH chứa β–xylosidase theo CAZY Chất cho điện tử Chất cho Mã E.C GH Clan Mơ hình cấu trúc khơng gian Cơ chế xúc tác xúc tác proton xúc tác 3.2.1.37 GH-A (β/α)8 Glu Glu Giữ nguyên 3.2.1.8 Asp Glu Giữ nguyên 3.2.1.8 30 GH-A (β/α)8 Glu Glu Giữ nguyên 3.2.1.8 31 GH-D ( β / α ) barrel Asp Asp Giữ nguyên 3.2.1.8 39 GH-A (β/α)8 Glu Glu Giữ nguyên 3.2.1.37 43 GH-F 5-fold β-propeller Asp Glu Đảo ngược 3.2.1.37 51 GH-A (β/α)8 Glu Glu Giữ nguyên 3.2.1.37 52 GH-O Asp Glu Giữ nguyên 3.2.1.37 54 Giữ nguyên 3.2.1.37 116 GH-O Asp Glu Giữ nguyên 3.2.1.37 120 Asp Glu Giữ nguyên 3.2.2 Tìm kiếm trình tự axit amin β–xylosidase đƣợc nghiên cứu thực nghiệm Bảng 3.4 Tổng hợp liệu nghiên cứu chi tiết β–xylosidase Số thứ tự Mã số GENBANK CAD20872.1 CAD48309.1 ABX45137.1.1 CAA29235.1.1 AAC97375.1 AAC27699.1 BAA02527.1 BAC879411 AFZ7887.1 Vi khuẩn GH1 bacterium enrichment culture clone P11-6 GH3 C stercorarium GH30 Bifidobacterium breve GH43 Bacillus pumilus Bacillus pumilus PLS bacterium Bacillus sp KK-1 Clostridium stercorarium Clostridium stercorarium Enterobacter sp enrichment culture clone Số axit amin pH hoạt động tối ƣu Nhiệt độ hoạt động tối ƣu (oC) 464 40 715 50 448 45 535 535 533 473 497 536 40 45 55 65 80 40 3,5 Hình 3.2 Kết so sánh tương đồng 11 trình tự mã hóa β–xylosidase xây dựng mẫu dò cho β–xylosidase thuộc họ GH43 Ghi chú: Mức độ bảo thủ gốc axit amin đánh dấu từ dấu “*” đến dấu “:” dấu “.” không đánh dấu Các vị trí gạch chân trình tự Prim cons dùng làm mẫu dò Trình tự 1,2 3,… trình tự từ Bảng 3.4 thuộc họ GH43 từ số thứ tự đến 11 Dựa vào mức độ bảo tồn vị trí axit amin, so sánh 11 trình tự cho thấy: có vị trí axit amin bảo tồn cao nhất, hồn tồn giống (màu đỏ), 32 vị trí bảo tồn mức trung bình, giống đa số trình tự (màu xanh lục) 30 vị trí bảo tồn thấp hơn, giống số trình tự (màu xanh lam) Ở vị trí axit amin lại so sánh giống vị trí Kết so sánh có 71 vị trí axit amin giống từ đến 10 trình tự (màu cam), 102 vị trí giống từ đến trình tự (màu hồng), vị trí khác loại axit amin chiếm tỷ lệ lớn giữ lại (màu đen) Trong trường hợp số lượng loại axit amin trình tự cuối để số - đại diện cho số lượng loại axit amin lặp lại nhiều (Ví dụ số 2, nghĩa 11 trình tự có 02 loại axit amin có số lượng lớn nhau) Những vị trí axit amin có 50% trình tự đánh dấu màu tím Kết cho thấy trình tự axit amin β–xylosidase thuộc họ GH43 vi khuẩn bảo tồn cao, đảm bảo cho số liệu mẫu dò đáng tin cậy 3.2.4 Xây dựng mẫu dò giá trị tham chiếu Hình 3.3 Trình tự mẫu dò β–xylosidase thuộc họ GH43 Căn vào kết so sánh 11 trình tự thuộc họ GH43 lựa chọn vị trí bảo tồn (màu đỏ, màu xanh lục, màu xanh lam), vị trí đa số axit amin giống (màu cam màu hồng), vị trí chiếm tỷ lệ lớn (màu đen) vị trí có loại axit amin (số) để đảm bảo độ dài để xây dựng mẫu dò Những vị trí khác (màu tím) loại bỏ Mẫu dò so sánh lại với 11 trình tự để xác định mức độ bao phủ tương đồng BLASTP Mẫu dò họ GH43 xây dựng bao gồm có 464 axit amin Trong chứa tồn axit amin màu đỏ, 32 vị trí màu xanh lục, 30 vị trí màu xanh lam, 71 vị trí axit amin màu cam, 102 vị trí màu hồng, 165 vị trí màu đen 57 vị trí số (Hình 3.2) Trình tự mẫu dò thu cho họ GH43 hình 3.3 Kết so sánh mức độ tương đồng mẫu dò với trình tự cho thấy trình tự mã hóa β– xylosidase GH43 phải có điểm tối đa 17, độ bao phủ độ tương đồng tối thiểu 60% 30% so với mẫu dò (Bảng 3.5) Tuy nhiên, kết so sánh cho thấy mẫu dò phù hợp với trình tự số 1, 2, 3, 6, 7, 8, 10, 11 (chỉ số điểm tối đa 200, độ tương đồng 37% độ bao phủ 99%) không đại diện tốt cho trình tự số 4, 5, số điểm tối đa độ tương đồng thấp Tìm hiểu sâu trình tự 4, cho thấy: trình tự mã hóa enzyme hai chức β-xylosidase/α-arabinofuranosidase với hoạt tính α-arabinofuranosidase mạnh trình tự mã hóa cho β–xylosidase Do để kiểm chứng xác hoạt tính trình tự axit amin 4, lần sử dụng công cụ Swiss model Kết cho thấy cấu trúc không gian 03 trình tự tương đồng cao với cấu trúc β-xylosidase/αarabinofuranosidase (Bảng 3.6) Kết giả định trình tự 4, sử dụng làm mẫu dò có điểm tối đa thấp chúng thực đồng thời 02 chức năng, chức alphaarabinofuranosidase hoạt động mạnh hơn, với trình tự nghiên cứu chưa thử hoạt tính alphaarabinofuranosidase Bảng 3.5 So sánh mức độ tương đồng mẫu dò với trình tự thuộc họ GH43 Trình tự Điểm tối đa Tổng điểm Độ bao phủ (%) Giá trị E Độ tƣơng đồng (%) Trình tự 608 608 100 72 Trình tự 603 603 99 71 Trình tự 596 596 99 71 Trình tự 547 547 99 66 Trình tự 444 444 99 5E-155 56 Trình tự 10 358 377 98 9E-122 51 Trình tự 11 351 351 99 4E-119 49 Trình tự 231 248 99 2E-73 37 Trình tự 101 134 83 3E-27 30 Trình tự 25.8 76.2 61 0.003 33 Trình tự 17.3 113 60 1.2 46 Bảng 3.6 Ước đoán cấu trúc bậc ba trình tự 4, 5, Swiss model Độ bao phủ Độ tƣơng đồng Phƣơng pháp Cấu trúc Phối tử Trình tự 4nov.1.A Xylosidase/arabinofuranosidase Xsa43E 0,6 30,28 X-ray, 3Å monomer x CA Trình tự 3c2u.1.A Xylosidase/arabinofuranosidase 0,94 27,08 X-ray, 3Å homotetramer 4x B3P 0,56 36,84 X-ray, 1.7Å monomer None Trình tự Khn Trình tự Hoạt tính 5glk.1 β-xylosidase/α-arabinofuranosidase A Để khai thác tối đa trình tự gen mã hóa enzyme có hoạt tính β–xylosidase, sử dụng mẫu dò trình tự có điểm tối đa, độ tương đồng độ bao phủ tối thiểu 17, 30% 60% Tuy nhiên để đảm bảo chắn trình tự gen lựa chọn đưa vào thực nghiệm thành cơng, nên chọn trình tự có điểm tối đa, độ tương đồng độ bao phủ tối thiểu 200, 37% 99% 3.2.5 Khai thác trình tự gen mã hóa β–xylosidase mẫu dò từ số liệu DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi Công ty BGI giải trình tự dựa vào CSDL KEGG giải 46 trình tự có hoạt tính β–xylosidase thuộc họ GH43 Khi sử dụng mẫu dò, sử dụng số điểm tối đa 17, độ bao phủ độ tương đồng tối thiểu 60% 30% chúng tơi lựa chọn 25 trình tự, có 20 trình tự trùng với dự đốn BGI Tuy nhiên có 05 trình tự sử dụng mẫu dò tìm kiếm lại khơng nằm dự đốn BGI (Bảng 3.7) Bảng 3.7 So sánh số lượng trình tự khai thác mẫu dò với dự đốn BGI Kết khai thác mẫu dò Kết dự Điểm tối Độ bao phủ Giá trị Độ tƣơng đồng đoán BGI Mã gen Tổng điểm đa (%) E (%) GL0104795 GL0104795 382 382 99 1e-130 48 GL0020896 GL0020896 285 285 62 3e-96 54 GL0117445 GL0117445 285 285 62 3e-96 54 GL0076106 GL0076106 243 259 85 2e-77 38 GL0006405 GL0006405 227 271 68 7e-75 57 GL0044986 GL0044986 225 256 87 7e-72 37 GL0077826 GL0077826 216 265 67 9e-70 48 GL0112518 GL0112518 216 265 67 9e-70 56 GL0001262 GL0001262 214 266 82 8e-67 35 GL0095948 GL0095948 213 213 63 3e-53 39 GL0015489 GL0015489 201 201 67 2e-49 42 GL0088906 GL0088906 154 193 62 2e-48 53 GL0016592 GL0016592 130 160 64 8e-40 49 GL0021333 GL0021333 99,8 117 77 2e-27 30 GL0090776 GL0090776 54,7 119 63 4e-12 37 GL0083296 GL0083296 43,9 58,1 67 4e-09 35 GL0091901 GL0091901 40,4 54,3 64 3e-08 35 GL0079004 GL0079004 37,0 85.1 65 5e-07 36 GL0050001 GL0050001 35,8 112 67 8e-07 36 GL0106540 GL0106540 34,7 72.0 66 2e-06 35 GL0119754 93,2 156 61 3e-26 38 GL0039878 55,8 103 69 2e-13 36 GL0122352 27,3 102 69 4e-04 32 GL0068837 24,6 115 66 0.002 35 GL0042431 22,7 84.3 61 0.011 31 Hình 3.4 Kết dự đốn tương đồng đặc hiệu trình tự gốc hoạt động trình tự lựa chọn mẫu dò GH43 Chú thích: GH43_XYL: họ glycosyl 43 có khả phân hủy cấu trúc beta-Dxyloside; XynB2: enzyme beta-xylosidase Khảo sát lại vùng bảo thủ BLASTP tất trình tự dự đốn mã hóa β–xylosidase BGI mẫu dò dự đốn cho thấy: Tất 25 trình tự lựa chọn mẫu dò, cho thấy chúng chứa vùng đặc thù cho β–xylosidase (specific hit) có vị trí hoạt động (active sites) (Hình 3.4) Trong nhiều trình tự gen mã hóa β–xylosidase BGI dự đốn khơng mã hóa cho enzyme Điều chứng tỏ việc xây dựng mẫu dò để tìm kiếm lựa chọn trình tự gen so với dự đốn BGI, xác 3.2.6 Khảo sát cấu trúc bậc trình tự β–xylosidase khai thác mẫu dò Để xác định mức độ xác trình tự lựa chọn mẫu dò, chúng tơi tiếp tục kiểm tra lại cấu trúc không gian công cụ Swiss model Kết cho thấy đa số trình tự lựa chọn mẫu dò ước đốn có cấu trúc tương đồng cao với β–xylosidase Tuy nhiên số trình tự có giá trị điểm tối đa (Max score) thấp 100, hoạt tính khác β–xylosidase hoạt tính arabinofuranosidase xylanase (Bảng 3.8) Kết cho thấy, số điểm tối đa quan trọng để xem xét tính xác thực gen, protein sử dụng công cụ tin sinh học để ước đoán Kết lần giúp khẳng định việc chọn số điểm tối đa 200 làm giá trị tham chiếu sử dụng mẫu dò giúp cho độ xác cao chọn gen đưa vào thực nghiệm Bảng 3.8 Ước đốn cấu trúc bậc ba trình tự Swiss model Mã gen Điểm tối đa Khuôn Hoạt tính Độ bao phủ Độ tƣơng đồng Phƣơng pháp GL0104795 382 3c2u.1.A Xylosidase/ Arabinosidase 0,95 54,77 X-ray, 1.3Å x B3P GL0020896 285 3c2u.1.A beta-D-xylosidase 0,93 52,11 X-ray, 1.3Å x B3P GL0117445 285 2exj.1.A beta-D-xylosidase 0,96 55,34 X-ray, 2.2Å GL0076106 243 2exk.1.A beta-D-xylosidase 0,94 37,55 X-ray, 2.2Å GL0006405 227 2exk.1.A beta-D-xylosidase 0,98 59,53 X-ray, 2.2Å GL0044986 225 2exj.1.A beta-D-xylosidase 0,94 40,29 X-ray, 2.2Å GL0077826 216 1yrz.1.A beta-D-xylosidase 0,96 57,85 X-ray, 2.0Å monomer Không GL0112518 216 1yrz.1.A beta-D-xylosidase 0,93 58,86 X-ray, 2.0Å monomer Không GL0001262 214 2exk.1.A beta-D-xylosidase 0,94 36,73 X-ray, 2.2Å x XYS-XYS, x CA, x MES GL0095948 173 1yi7.1.A beta-D-xylosidase 0,93 46,52 X-ray, 1.9Å GL0015489 161 2exh.1.A beta-D-xylosidase 0,98 46,56 X-ray, 1.9Å homotetramer homotetramer homotetramer GL0088906 154 1yrz.1.A beta-D-xylosidase 0,96 64,1 X-ray, 2.0Å monomer Không GL0016592 130 1yi7.1.A beta-D-xylosidase 0,98 48,9 X-ray, 1.9Å homotetramer x CA GL0021333 99,8 1yrz.1.A beta-D-xylosidase 0,96 31,65 X-ray, 2.0Å monomer Không GL0090776 54,7 2exj.1.A 0,42 24,22 X-ray, 2.2Å homotetramer x XYS-XYS, x CA, x MES GL0083296 43,9 3c7g.1.A 0,93 33,88 X-ray, 2.0Å monomer x XYP, x CA GL0091901 40,4 3c7g.1.A 0,91 31,94 X-ray, 2.0Å monomer x XYP, x CA GL0079004 37 1yrz.1.A 0,94 18,62 X-ray, 2.0Å monomer Không GL0050001 35,8 3qee.1.A 0,99 56,51 X-ray, 1.6Å monomer x CA GL0106540 34,7 4nov.1.A 0,93 55,74 X-ray, 1.3Å monomer x CA GL0119754 93,2 2exh.1.A 0,81 42,77 X-ray, 1.9Å homotetramer x CA, x MES GL0039878 55,8 1yrz.1.A 0,94 31,09 X-ray, 2.0Å monomer Không Endo-1,4-betaxylanase Endo-1,4-betaxylanase Endo-1,4-betaxylanase xylan beta-1,4xylosidase β-xylosidase/α-Larabinofuranosidase β-xylosidase/αarabinofuranosidase xylan beta-1,4xylosidase xylan beta-1,4xylosidase Cấu trúc homotetramer Phối tử x XYS-XYS, x CA, x MES x XYS-XYS, x CA, x MES x XYS-XYS, x CA, x MES x XYS-XYS, x CA, x MES x CA x CA, x MES GL0122352 27,3 3kst.1.A GL0068837 24,6 2exk.1.A GL0042431 22,7 3c7f.1.A Endo-1,4-betaxylanase Endo-1,4-betaxylanase Endo-1,4-betaxylanase 0,9 36 X-ray, 1.7Å monomer x CA 0,89 25,68 X-ray, 2.2Å homotetramer x XYS-XYS, x CA, x MES 0,82 32,08 X-ray, 1.5Å monomer x CA Chú thích: B3P:2-[3-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]propylamino]-2-hydroxymethyl) propane-1,3-diol; XYS: xylopyranose; CA: Ca++; MES: 2-morpholin-4-ium-4-ylethanesulfonate Theo kết bảng 3.7 dựa điểm tối đa 200, độ tương đồng tối thiểu 37% độ bao phủ thấp 99% kiến nghị để chọn gen đưa vào thực nghiệm, 01 trình tự đạt yêu cầu số tham chiếu Do để có nhiều lựa chọn gen đưa vào thực nghiệm, sử dụng mẫu dò họ GH43 với số tham chiếu độ bao phủ 60%, độ tương đồng 30% điểm tối đa phải 200 Như với số này, lọc 11 mã gen từ liệu trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi mẫu dò là: GL0104795, GL0020896, GL0117445, GL0076106, GL0006405, GL0044986, GL0077826, GL0112518, GL0001262, GL0095948, GL0015489 3.2.7 Dự đoán cấu trúc chức gen mã hóa β–xylosidase số công cụ tin sinh học Việc lựa chọn gen để thực nghiệm ưu tiên trình tự từ kết lựa chọn mẫu dò ước đốn ban đầu ORF hồn thiện Trong số 11 mã gen, có 04 mã gen hồn thiện gồm GL0104795, GL0076106, GL0001262 GL0112518 có mức độ bao phủ tương đồng với mẫu dò bảng 3.9 Bảng 3.9 Độ bao phủ tương đồng với mẫu dò gen mã hóa β–xylosidase STT Mã gen Mức độ bao phủ (%) Mức độ tƣơng đồng (%) Gen hoàn thiện GL0104795 99 48 X GL0020896 62 54 GL0117445 62 54 GL0076106 85 38 X GL0006405 68 57 GL0044986 87 37 GL0077826 67 48 GL0112518 67 56 X GL0001262 82 35 X 10 GL0095948 63 39 11 GL0015489 67 42 Nếu theo tiêu chí tốt để chọn gen đưa vào thực nghiệm điểm tối đa 200, độ tương đồng độ bao phủ 37% 99%, 04 mã gen hồn thiện có mã gen GL0104795 thỏa mãn tiêu chuẩn Tuy nhiên, ngồi việc chọn gen mã hóa β–xylosidase biểu thành công thực nghiệm, đặc biệt quan tâm đến khả enzyme hoạt động tối ưu môi trường kiềm nhiệt độ cao Do sử dụng cơng cụ Alcapred TBI để tiếp tục chọn lọc 04 gen hoàn thiện dự đoán pH nhiệt độ hoạt động tối ưu Bảng 3.10 Kết dự đoán pH nhiệt độ hoạt động mã gen β–xylosidase STT Mã gen Số axit amin pH hoạt động Nhiệt độ hoạt động GL0104795 561 0,217171 55℃~65℃ GL0076106 553 0,871792 55℃~65℃ GL0001262 555 0,509051 55℃~65℃ GL0112518 359 0,984522 55℃~65℃ Sử dụng phần mềm TBI dự đoán nhiệt độ hoạt động tối ưu enzyme cho thấy: enzyme có khả hoạt động tối ưu nhiệt độ từ 55℃ đến 65℃ Khi dự đoán pH hoạt động tối ưu phần mềm Alcapred, kết cho thấy mã gen GL0104795; GL0001262; GL0076106 GL0112518 với số dự đoán 0,217171; 0,509051; 0,871792 0,984522 (Bảng 3.10) Theo kết dự đoán phần mềm số gần với giá trị 1, pH hoạt động tối ưu mơi trường kiềm cao ngược lại gần với pH hoạt động tối ưu mơi trường axit Như mã gen GL0112518 dự đoán với kết chịu kiềm cao ưu tiên lựa chọn để đưa vào thực nghiệm Tóm lại, sử dụng mẫu dò enzyme β–xylosidase họ GH43, với độ dài 446 axit amin, giá trị tham chiếu mức độ tương đồng, độ bao phủ điểm tối đa tối thiểu 60%, 30% 200, lựa chọn 11 mã gen mã hóa β–xylosidase từ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen có sẵn Trong có mã gen GL0112518 hồn thiện, dự đốn có khả hoạt động tối ưu nhiệt độ cao pH kiềm 3.2.8 Một số dự đoán chi tiết gen GL0112518 mã hóa β–xylosidase (Xbx14) 3.2.8.1 Kết dự đoán chức Xbx14 BLASTP Mã gen GL0112528 có chiều dài 1077 bp Kết dự đốn BLASTP cho thấy mã gen mã hóa cho Xbx14 thuộc họ GH43, dự đoán ban đầu lựa chọn mẫu dò (Hình 3.6) Hình 3.6 Kết dự đoán chức Xbx14 BLAST 3.2.8.2 Kết dự đốn cấu trúc khơng gian Xbx14 PHYRE Hình 3.7 Mơ hình cấu trúc khơng gian (A) dựa vào khuôn c1ylfC trung tâm hoạt động (B) enzyme Xbx14 Phân tích cấu trúc bậc hai Xbx14 mã hóa mã gen lựa chọn có 41% chuỗi gấp nếp β, 1% chuỗi α 62% trình tự axit amin khơng xác định (Hình 3.7A) Mơ hình cấu trúc khơng gian cho thấy chuỗi axit amin Xbx14 cuộn gấp lại dạng hình cầu, có độ tương đồng bao phủ cao 97% so với cấu trúc beta-xylosidase Bacillus subtillis (Hình 3.7B) 3.2.8.3 Kiểm tra nguồn gốc mã gen GL0112518 công cụ Blast -Explorer Sử dụng công cụ Blast -Explorer Phylogeny.fr để kiểm tra nguồn gốc mã gen GL0112518 Kết cho thấy mã gen nằm nhánh phát sinh vi khuẩn Treponema primitia (Hình 3.8) Đây nhóm vi khuẩn chiếm số lượng ORF lớn nhất, đặc trưng ruột mối C gestroi (Hình 3.1) Tóm lại sử dụng BLASTP, chúng tơi dự đốn mã gen GL0112518 có chiều dài 1077 bp, mã hóa β–xylosidase Sử dụng công cụ kiểm tra nguồn gốc cho thấy, mã gen GL0112518 tương đồng cao với trình tự gen từ vi khuẩn Treponema primitia – vi khuẩn đặc trưng ruột mối C gestroi Hình 3.8 Sơ đồ nguồn gốc mã gen GL0112518 3.3 BIỂU HIỆN GEN Xbx14 VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA β-XYLOSIDASE 3.3.1 Biểu gen Xbx14 3.3.1.1 Kiểm tra gen Xbx14 vector pET22b(+) Kết biến nạp vector Pet22Xbx vào tế bào DH10B tách plasmid để kiểm tra hình 3.9 Sản phẩm biến nạp gen trải đĩa LBA cho thấy khuẩn lạc mọc tròn, đặc trưng vi khuẩn (Hình 3.9A) Phân tích điện di sản phẩm tách plasmid 05 khuẩn lạc đĩa biến nạp Pet22Xbx cho thấy, tất chạy cao so với vector đối chứng khơng mang gen (Hình 3.9B) Kết chứng tỏ vector Pet22b(+) có đoạn DNA chèn vào vùng đa nối, nên kích thước lớn chạy chậm Hình 3.9 Kết biến nạp vector Pet22Xbx (A) điện di đồ phân tích sản phẩm tách dòng gen Xbx14 (B) Đường chạy 1: Plasmid Pet22b(+); Đường chạy 2-6: Plasmid Pet22Xbx Nghiên cứu tiến hành kiểm tra gen Xbx14 vector Pet22Xbx phản ứng PCR, cắt kiểm tra enzyme hạn chế giải trình tự gen Sơ đồ enzyme cắt hạn chế vector pET22Xbx cho thấy enzyme XhoI, NcoI có điểm cắt, HincII có điểm cắt vector (Hình 3.10A) Kết PCR cặp mồi đặc hiệu cho băng sáng, sắc nét tương đương với kích thước gen Xbx14 (Hình 3.10B) Khi sử dụng enzyme cắt riêng rẽ HincII cho ba băng với kích thước kb, 1.8 kb 0.6 kb cắt đồng thời NcoI, XhoI cho hai băng sáng rõ với kích thước khoảng 1,1 kb 5,5 kb tính tốn lý thuyết (Hình 3.10C) Kết cắt dòng plasmid số enzyme hạn chế hồn tồn xác với tính tốn lý thuyết, chứng tỏ gen Xbx14 gắn vào vector pET22b(+) Hình 3.10 Sơ đồ vị trí cắt enzyme cắt hạn chế HincII, XhoI NcoI vector Pet22Xbx (A), điện di sản phẩm PCR (B) sản phẩm cắt Pet22Xbx NcoI XhoI, HincII (C) Đường chạy 1, 5: Thang DNA chuẩn (Fermentas), đường chạy 2: Sản phẩm PCR gen Xbx14, đường chạy 3: cắt Pet22Xbx HincII, đường chạy 4: Pet22Xbx NcoI XhoI Kết sau giải trình tự mồi xi mồi ngược đặc hiệu xử lý cho thấy trình tự gen Xbx14 gắn vào vector tách dòng pET22b(+) trình tự gốc ban đầu (Phụ lục 1) 3.3.1.2 Đồng biểu gen mã hóa Xbx14 chaperone E coli Rosetta Vector tái tổ hợp pET22Xbx biến nạp vào chủng biểu E.coli Rosetta để khảo sát biểu Kết protein Xbx14 biểu tốt, khơng tan Vì nghiên cứu tiếp tục tiến hành đồng biểu gen Xbx14 vector pET22Xbx gen tổng hợp chaperone GroEL (60 kDa), DnaK (70 kDa) DnaJ (40 kDa) vector pG - KJE8 Kết đồng biểu với chaperone sau cảm ứng, phân tích điện di gel SDS-PAGE 12,6% (Hình 3.11) Điện di đồ cho thấy tiến hành đồng biểu với chaperone DnaK, DnaJ, GroEL Xbx14 xuất dạng tan với băng to, đậm kích thước lý thuyết Mặt khác protein Xbx14 không xuất dòng đối chứng khơng cảm ứng IPTG Khi so sánh với sản phẩm biểu gen Xbx14 khơng có chaperone, protein Xbx14 hầu hết nằm pha tủa Điều chứng tỏ đồng biểu với chaperone giúp cho Xbx14 biểu tốt dạng tan Đồng thời kết thử hoạt tính thơ cho thấy ống đối chứng (ĐC) khơng có màu vàng đặc trưng pNP xúc tác chuyển hóa β-xylosidase ống có protein Xbx14 tái tổ hợp (Hình 3.12) M: Thang protein chuẩn (Fermentas); ĐC: Protein tổng số không cảm ứng IPTG; Xbx14: protein Xbx14 biểu khơng có chaperone; Xbx14-Chaperone: protein Xbx14 đồng biểu với chaperone pG-KJE8; TS: protein dạng tổng số; S: protein dạng tan; P: protein dạng tủa 3.3.1.3 Tối ưu điều kiện biểu gen Xbx14 a Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến biểu gen Xbx14 tế bào E coli Rosetta Đường chạy ĐC: đối chứng âm, protein tổng số dòng tế bào biểu mang vector Pet22Xbx không cảm ứng IPTG; đường chạy TS: protein tổng số biểu tế bào mang Pet22Xbx; đường chạy S: protein dạng tan biểu tế bào mang Pet22Xbx; đường chạy P: protein dạng không tan biểu tế bào mang Pet22Xbx; đường chạy M: protein chuẩn unstained (Thermo scientific) Trong nghiên cứu lựa chọn ba nhiệt độ thấp nhiệt độ sinh trưởng E.coli 20oC, 25oC 30oC để kiểm tra khả biểu Xbx14 Mặt khác theo khuyến cáo nhà cung cấp vector pGKJE8 nhiệt độ thích hợp để chaperone biểu dạng tan 25oC Kết thu tế bào cho thấy mật độ tế bào thu sau cảm ứng cao 30oC thấp 20oC (Hình 3.13) Kết điện di đồ cho thấy protein Xbx14 tạo thành có dạng tan dạng không tan 20oC, 25oC, 30oC (Hình 3.14) Mặc dù lượng protein tái tổ hợp tổng số Xbx14 tạo 30oC cao nhất, lượng protein Xbx14 dạng tan 20oC nhiều Kết hợp khuyến cáo hãng cung cấp vector pG-KJE8 kết lượng protein tái tổ hợp tan nhiệt độ trên, lựa chọn nhiệt độ 20oC để biểu gen Xbx14 thí nghiệm b Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ IPTG đến hiệu cảm ứng Hình 3.15 Mật độ tế bào biểu E coli Rosetta (DE3) mang Pet22Xbx cảm ứng IPTG nồng độ từ 0,0 đến 1,5 mM Để kiểm tra ảnh hưởng nồng độ IPTG cảm ứng đến hiệu biểu gen Xbx14 tế bào E.coli Rosetta 20oC, chọn nồng độ IPTG cảm ứng mM; 0,05 mM; 0,1 mM; 0,3 mM; 0,5 mM; 0,7mM; 1mM; 1,2 mM 1,5 mM Tất mẫu cảm ứng nuôi 20oC thời gian Mẫu tế bào cảm ứng nồng độ IPTG thu được, đo OD600 để so sánh sinh khối cuối Kết cho thấy nồng độ IPTG tăng từ 0,0 mM đến 1,5 mM sinh khối tế bào thu giảm dần (Hình 3.15) Kết cảm ứng biểu Xbx14 tổng số nồng độ IPTG khác kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12,6% có SDS (Hình 3.16) Từ điện di đồ kiểm tra protein Xbx14 tổng số cho thấy: nồng độ IPTG 0,05 mM lượng protein tái tổ hợp Xbx14 thu nhiều Các đường chạy 0,0 – 1,5: protein tổng số/tan biểu tế bào cảm ứng nồng độ IPTG từ 0,0 đến 1,5 mM; đường chạy M: protein chuẩn (Thermo scientific) Kiểm tra lượng Xbx14 dạng tan cho thấy nồng độ IPTG cảm ứng khác lượng protein tái tổ hợp tan tỷ lệ thuận với lượng protein Xbx14 tổng số (Hình 3.16, Hình 3.17) Do để thu sinh khối tế bào lượng protein Xbx14 nhiều nhất, tỷ lệ protein dạng tan cao nồng độ IPTG cảm ứng thích hợp 0,05 mM c Ảnh hưởng thời điểm cảm ứng đến hiệu biểu protein Xbx14 Đường chạy ĐC: đối chứng âm, protein tổng số dòng tế bào biểu không cảm ứng IPTG; đường chạy TS: protein tổng số biểu tế bào mang Pet22Xbx; đường chạy S: protein dạng tan; đường chạy P: protein dạng không tan; đường chạy M: protein chuẩn unstained (Thermo scientific) Mẫu tế bào nuôi 25oC để cảm ứng biểu chaperone 20oC cảm ứng biểu Xbx14 Mật độ tế bào thu sau cảm ứng đo OD để kiểm tra Kết cảm ứng IPTG OD 600 1,5 thu lượng sinh khối tế bào lớn (Hình 3.18) Mẫu tế bào thu tiếp tục kiểm tra lượng protein Xbx14 tổng số dạng tan Kết kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12,6% có SDS cho thấy, cảm ứng thời điểm OD600 0,7 1,5 thu lượng protein Xbx14 tổng số tan tương đương Tuy nhiên cảm ứng OD600 = 1,5 thu sinh khối tế bào lớn (Hình 3.19) Do chúng tơi chọn cảm ứng OD600 = 1,5 cho thí nghiệm d Ảnh hưởng thời gian thu mẫu đến hiệu biểu Xbx14 Đường chạy ĐC: đối chứng âm, protein tổng số dòng tế bào biểu không cảm ứng IPTG; đường chạy TS: protein tổng số biểu tế bào mang Pet22Xbx; đường chạy S: protein dạng tan; đường chạy P: protein dạng không tan; đường chạy M: protein chuẩn unstained (Thermo scientific) Tế bào sau cảm ứng 0,05 mM IPTG OD600 1,5 nuôi tiếp 20oC, mẫu thu lại để kiểm tra sau giờ, giờ, 15 20 cảm ứng Kết đo OD 600 thời điểm thu mẫu khác cho thấy mật độ tế bào tăng dần từ đạt cao thời điểm 15 giờ, sau giảm thời điểm 20 (Hình 3.20) Mẫu tế bào biểu sau thu, tiếp tục phá siêu âm để kiểm tra mức độ biểu dạng tan Xbx14 Kết cho thấy lượng protein Xbx14 tổng số tan thu thời điểm thu mẫu sau cảm ứng nhất, sau 15 tăng lên 20 mật độ tế bào giảm, môi trường thiếu chất dinh dưỡng, lượng protein Xbx14 tổng số tan ổn định (Hình 3.21) Kết hợp với số liệu mật độ tế bào thu mẫu cuối cùng, lựa chọn thời điểm thu mẫu sau 15 cảm ứng, 20oC Như điều kiện tối ưu đồng biểu Xbx14 với chaperone tế bào E coli Rosetta bao gồm: nhiệt độ biểu 20oC, nồng độ IPTG cảm ứng 0,05 mM, OD600 cảm ứng 1,5 thu mẫu sau 15 cảm ứng 3.3.2 Tinh chế Xbx14 Theo thiết kế ban đầu gen GL0112518 gắn vào vector biểu pET22b(+) vị trí đa nối, phía sau có đoạn trình tự mã hóa cho axit amin Histidine tích điện âm để sử dụng tinh chế cột sắc kí lực Tuy nhiên mẫu protein Xbx14 tan nước bị tủa hoàn toàn nồng độ muối thấp Đây lý không sử dụng cột sắc ký lực, mà sử dụng muối (NH4)2SO4 để tinh chế cách tủa phân đoạn 3.3.2.1 Tinh chế Xbx14 muối (NH4)2SO4 Kết cho thấy Xbx14 bị tủa theo phân đoạn từ nồng độ muối cao, đến nồng độ muối thấp Hình 3.22A cho thấy Xbx14 bị tủa nồng độ muối 5% (NH4)2SO4, tiếp tục bị tủa sử dụng nồng độ muối (NH4)2SO4 thấp 3% (Hình 3.22B), 1% (Hình 3.22C), 0,2% (Hình 3.22D) 0,02% (Hình 3.22E) Càng nồng độ muối thấp protein không mong muốn bị tủa Xbx14 dần Hầu loại protein có kích thước lớn Xbx14 khơng bị tủa, mà lượng protein tạp nhiễm Để tiếp tục làm protein tạp nhiễm, dựa điểm đẳng điện protein Xbx14 khả hòa tan đệm có pH khác Kết ra, hầu hết protein không mong muốn bị hòa tan, Xbx14 tủa đệm phosphate pH = Như việc sử dụng đệm phosphate pH = để rửa tủa, tiếp tục giúp tinh Xbx14 (Hình 3.22F) Hình 3.22 Điện di đồ kết tủa protein Xbx14 biểu tế bào E coli Rosetta (DE3) muối (NH4)2SO4 theo phân đoạn 5% (A), 3% (B), 1% (C), 0,2%(D), 0,02% (E) rửa tủa đệm phosphate pH = (F) Đường chạy TS: protein tổng số biểu tế bào mang Pet22Xbx; đường chạy S: protein dạng tan; đường chạy 5%, 10%,… tương ứng nồng độ muối (NH4)2SO4 sử dụng để tủa Xbx14; đường chạy F: dịch cuối sau tủa protein tan; đường chạy R: dịch sau rửa tủa protein Xbx14 đệm phosphate (pH=9); đường chạy L: Xbx14 sau rửa đường chạy đệm phosphate; M: protein chuẩn unstained (Thermo scientific) 3.3.2.2 Kiểm tra độ Xbx14 sau tinh chế phần mềm Quantity one Hình 3.23 Kết kiểm tra độ Xbx14 sau tinh chế muối (NH4)2SO4 rửa đệm phosphate (pH = 9) Bằng phần mềm Quantity One, độ tương đối protein Xbx14 tinh chế đánh giá mức định lượng Mẫu đo hàm lượng tính tốn cho đường chạy µg µg protein (Hình 3.23A) Một vị trí (BGR) có màu sắc độ sáng giống với vị trí băng protein Xbx14 ảnh quét gel lựa chọn Mỗi băng điện di đỉnh đường cong tương ứng đồ thị (Hình 3.23B 3.23C) Kết phân tích hình ảnh điện di qt tính tốn protein Xbx14 so với với protein tổng số chiếm 19,8% Tuy nhiên sau tinh chế Xbx14 chiếm tỷ lệ 92,7% 3.3.3 Nghiên cứu tính chất Xbx14 3.3.3.1 Xác định hoạt tính Xbx14 Hoạt tính Xbx14 xác định chất pNPX 10 mM pha đệm phosphate (pH = 7) theo phương pháp Teng cộng Sau ủ 1,5 mắt thường quan sát cho thấy mẫu phản ứng xuất màu vàng đặc trưng pNP, mẫu đối chứng (ĐC) khơng xuất màu vàng Hoạt tính enzyme xác định xác phương pháp đo Elisa bước sóng 405 nm Kết đo tính tốn theo đường chuẩn cho thấy, sau phản ứng 30 µl Xbx14 (0,253 mg/ml) thủy phân 20 µl pNPX 10mM tạo lượng pNP 0,1692 µMol (Hình 3.24) 3.3.3.2 Xác định tính đặc hiệu chất Xbx14 Một số chất phổ biến CMC, p-nitrophenyl-β-glucoside (pNPG), 4-nitrophenyl β- D-xylopyranoside (pNPX) xylan sử dụng để kiểm tra tính đặc hiệu Xbx14 Trong đó, pNPX chất đặc hiệu dạng tan Xbx14, CMC chất đặc hiệu endoglucanase, xylan chất đặc hiệu xylanase pNPG chất đặc hiệu β-glucosidase Kết kiểm tra cho thấy, Xbx14 thể hoạt tính cao chất pNPX, có hoạt tính yếu với chất xylan khơng phân cắt chất CMC pNPG (Hình 3.25) Điều chứng tỏ Xbx14 có hoạt tính đặc hiệu enzyme β–xylosidase phân cắt đường đôi xylose phân cắt phân tử đường đầu mạch xylan 3.3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính Xbx14 Tiếp tục nghiên cứu hoạt động tối ưu enzyme Xbx14 theo dải nhiệt độ 20oC, 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC 90oC Kết cho thấy hoạt tính β–xylosidase tăng dần từ 20oC đến 60oC giảm dần nhiệt độ tăng đến 80oC giảm mạnh nhiệt độ 90oC Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động Xbx14 60oC (Hình 3.26), cao hầu hết nghiên cứu công bố nhiệt độ hoạt động β– xylosidase với dự đốn cơng cụ TBI Đây hứa hẹn enzyme mới, có khả chịu nhiệt tốt 3.3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến hoạt tính Xbx14 Theo ước đốn phần mềm Alcapred, Xbx14 enzyme có khả hoạt động tốt vùng pH kiềm Kết kiểm tra hoạt tính cho thấy, enzyme khơng có hoạt tính pH = 5, hoạt tính tăng dần từ pH = đến pH = đạt giá trị cao pH = Sau hoạt tính giảm nhẹ pH = 10 giảm sâu pH = 12 (Hình 3.27) Như pH hoạt động tối ưu Xbx14 thích hợp mơi trường kiềm tính, với dự đốn ban đầu sử dụng cơng cụ Alcapred Enzyme có tiềm ứng dụng hiệu kết hợp với điều kiện xử lý sinh khối thực vật dung dịch kiềm Đây enzyme mà chúng tơi muốn tìm kiếm nghiên cứu 3.3.3.5 Nghiên cứu độ bền nhiệt Xbx14 Xbx14 xử lý nhiệt độ từ 20oC, 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC 90oC khoảng thời gian khác trước ủ với chất, để kiểm tra độ bền nhiệt Kết cho thấy nhiệt độ lớn 70oC, Xbx14 hoàn toàn hoạt tính dù thời gian xử lý ngắn (1 giờ) Ở nhiệt độ từ 20oC đến 60oC, hoạt tính enzyme gần ổn định sau xử lý nhiệt từ đến Như enzyme Xbx14 bền nhiệt khoảng nhiệt độ 20oC đến 60oC (Hình 3.28) 3.3.3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng số ion kim loại hóa chất lên hoạt tính Xbx14 Để đánh giá ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính Xbx14, chúng tơi tiến hành theo phương pháp mô tả Lee cộng Shi cộng Kết nồng độ 10 mM, ion kim loại làm tăng hoạt tính enzyme Xbx14 Imidazol với nồng độ 10 mM khơng ảnh hưởng đến hoạt tính Xbx14, nhiên nồng độ µM 2- mercaptoethanol µM urea làm giảm đáng kể đến hoạt tính Xbx14 (Hình 3.29) 3.3.3.7 Nghiên cứu đặc điểm động học Xbx14 Hình 3.30 Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng enzyme vào nồng độ chất pNPX theo Linewever-Burk Hằng số Km Xbx14 xác định dải nồng độ chất pNPX từ 2,0 đến 20 mg/ml đệm phosphate pH = Thông số động học xác định từ đồ thị Lineweaver-Burke Kết cho thấy, với lượng protein Xbx14 0,253 mg/ml, phương trình phụ thuộc tốc độ phản ứng với nồng độ chất tuân theo hàm y = ax+b với độ tin cậy cao R2 = 0,9937 (Hình 3.30) Dựa phương trình, Km Vmax Xbx14 tương ứng 3,18 mM 6,5 mol/phút Do đó, hoạt tính riêng Xbx14 đạt 24,54 U/mg So với hoạt tính riêng β-xylosidase nghiên cứu từ nấm vi khuẩn, hoạt tính Xbx14 cao Tóm lại nghiên cứu hoạt tính Xbx14 cho thấy enzyme mới, có khả hoạt động tối ưu nhiệt độ cao (60oC), môi trường kiềm (pH = 9) bền nhiệt, với hoạt tính riêng tốt 24,54 U/mg Enzyme hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích kinh tế kết hợp với phương pháp xử lý sinh khối thực vật kiềm nhiệt thực tiễn KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Nghiên cứu khai thác 20 lồi vi khuẩn có số lượng ORF lớn phù hợp với chế độ ăn gỗ giàu lignocellulose nghèo Nitơ mối C gestroi từ liệu trình tự DNA đa hệ gen Trong có 03 lồi tham gia chuyển hóa Nitơ 05 lồi tham gia thủy phân lignocellulose khơng có loài mối khác Đồng thời xác định lignocellulase vi sinh vật ruột mối C gestroi thuộc 52 họ GH khác theo phân loại CAZY Xây dựng phương pháp tìm kiếm gen từ liệu trình tự DNA đa hệ gen mẫu dò dựa vào trình tự axit amin nghiên cứu tính chất hỗ trợ cơng cụ tin sinh học, theo định hướng ứng dụng khả chịu nhiệt chịu kiềm enzyme Sử dụng mẫu dò thuộc họ GH43 có độ dài 464 axit amin tìm kiếm gen GL0112518 mã hóa β–xylosidase từ liệu DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C gestroi; Biểu thành cơng gen Xbx14 có hoạt tính β–xylosidase dự đốn ban đầu, với thơng số động học theo phương trình Lineweaver-Burk Km = 3,18 mM, Vmax = 6,5 mol/phút hoạt tính riêng đạt 24,54 U/mg Đây enzyme mới, có hoạt tính tốt với khả hoạt động tối ưu điều kiện nhiệt độ cao pH kiềm Kiến nghị Thử nghiệm sử dụng enzyme Xbx14 kết hợp với cellulase hemicellulase khác để làm hỗn hợp enzyme thủy phân hoàn tồn lignocellulose CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Nguyễn Minh Giang, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải (2015) Sử dụng công cụ tin sinh nghiên cứu metagenomic - hướng nghiên cứu ứng dụng sinh học Tạp chí khoa học Trường ĐHSP TP.HCM, số tháng năm 2015 Nguyễn Minh Giang, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải (2016) Sử dụng số công cụ tin sinh khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose từ liệu đa hệ gen vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(1 ): 39-47 Nguyen Minh Giang, Do Thi Huyen, Truong Nam Hai (2016) In silicon mining for alkaline enzymes from metagenomic DNA data of gut microbes of the lower termite Coptotermes gestroi in Viet Nam Tạp chí Sinh học 38(3): 374-383 DOI: 10.15625/0866-7160/v38n3.7811 Nguyễn Minh Giang, Đỗ Thị Huyền, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2017) Xây dựng probe để khai thác chọn gen mã hóa xylan 1-4 beta xylosidase từ liệu giải trình tự đa hệ gen Tạp Chí Cơng Nghệ Sinh Học Chấp nhận đăng Nguyễn Minh Giang, Nguyễn Minh Thu, Nguyễn Thị Duyên, Đỗ Thị Huyền, Hồ Thị Thương, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Trương Nam Hải (2017) Thiết kế vector biểu pCB301-Xbxs14-ELP biểu gen Xbxs14 mã hóa Xylan 1,4-beta xylosidase từ vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi thuốc Nicotiana benthamiana Tạp chí Sinh học Tạp chí Sinh học, 39(2): 239-248 DOI: 10.15625/0866-7160/v39n2.9843 Nguyễn Minh Giang, Phạm Hải Như, Nguyễn Minh Thu, Đỗ Thị Huyền, Đinh Nho Thái, Trương Nam Hải (2017) Biểu gen Xbxs14 mã hóa xylan 1,4-beta xylosidase có nguồn gốc từ vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi tế bào Escherichia coli Rosetta (DE3) Tạp Chí Cơng Nghệ Sinh Học 15(3):1-7 ... TÍNH CHẤT CỦA β- XYLOSIDASE TỪ VI SINH VẬT RUỘT MỐI Coptotermes gestroi Ở VI T NAM Mục tiêu 2.1 Mục tiêu chung Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn enzyme thủy phân lignocellulose ruột mối C gestroi từ. .. LOẠI CỦA CAZY TỪ DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN CỦA VI SINH VẬT TRONG RUỘT MỐI C gestroi 3.1.1 Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn sống ruột mối C gestroi 3.1.1.1 Thành phần lồi vi khuẩn có số lượng ORF lớn ruột. .. nghiên cứu đa dạng vi sinh vật enzyme chuyển hóa lignocellulose ruột mối C gestroi Vi t Nam Tóm tắt kết nghiên cứu mối, hệ vi sinh vật, enzyme thủy phân lignocellulose ruột C gestroi Vi t Nam,