VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐINH THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI Bacillus anthracis VÀ Yersinia pestis LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐINH THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI Bacillus anthracis VÀ Yersinia pestis Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thái Sơn Học viện Quân y PGS TS Nghiêm Ngọc Minh Viện Nghiên cứu hệ gen Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Trên đường khoa học đầy vinh quang khơng chơng gai hoàn thành luận án bước khởi đầu, tơi thấy thật may mắn ln có người thầy, cộng sự, người thân đồng hành tơi Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thái Sơn PGS TS Nghiêm Ngọc Minh, người thầy ln tận tụy, góp ý cho tơi, tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình nghiên cứu hoàn thành luận án Luận án thực Bộ môn Vi sinh y học; Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Qn y Phòng Cơng nghệ sinh học mơi trường, Viện Công nghệ sinh học, với giúp đỡ tận tình thầy cơ, anh chị em đồng nghiệp giành cho, tơi xin phép gửi tới lòng biết ơn chân thành Luận án nhận hỗ trợ quý báu đề tài cấp Bộ Quốc Phòng “Nghiên cứu chế tạo kit PCR đa mồi xác định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than dịch hạch”, PGS TS Nguyễn Thái Sơn làm chủ nhiệm Đồng thời, để hồn thành chương trình học tập hồn thành luận án, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu nhiệt tình cá nhân quan, tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến: GS TS Trương Nam Hải, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học dành cho tơi đóng góp q báu nội dung nghiên cứu giai đoạn đầu nghiên cứu sinh quan tâm, động viên giúp tơi hồn thành luận án Ban Lãnh đạo, Bộ phận Đào tạo Viện Công nghệ sinh học; Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện Quân y; Ban Cán bộ, Phòng Chính trị; Chỉ huy Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân tạo điều kiện thời gian, kinh phí trang thiết bị TS Đồn Trọng Tuyên, Cục Quân y tạo điều kiện thuận lợi chủng nghiên cứu chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm quý báu nghiên cứu với mầm bệnh nguy hiểm Cuối gia đình thân yêu bạn bè tin tưởng, động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực thành công luận án Đinh Thị Thu Hằng i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi thực số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2017 NCS Đinh Thị Thu Hằng ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Chữ viết tắt Giải nghĩa API Analytical profile index BHI Brain heart infusion Môi trường dinh dưỡng BHI BLAST Basic local alignment search tool Bp Base pairs Công cụ xếp Cặp base BSL-3 Bio-safety level An toàn sinh học cấp CDC CFU Centers for Disease Control and Prevention Colony forming unit Trung tâm kiểm sốt phòng ngừa dịch bệnh Đơn vị hình thành khuẩn lạc CRMs Certified reference materials Vật liệu tham chiếu chứng nhận dNTPs Deoxynucleotide triphosphates EQA External quality assessment Đánh giá chất lượng từ bên IC Internal amplification control Chứng nội ID Identification Định danh IS International standard Mẫu chuẩn quốc tế ISO International organization Kilo base Kb LAMP LB Loop mediated amplification Luria-Bertani MCS Multiplex cloning site standard isothermal tìm kiếm Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế Khuếch đại đẳng nhiệt tạo vòm Vùng đa điểm cắt iii mPCR Multiplex PCR PCR đa mồi NAT Nucleic acid amplification testing The National Center for Biotechnology Information Next generation sequencing Xét nghiệm khuếch đại dựa axit nucleic Trung tâm Quốc gia thông tin công nghệ sinh học Giải trình tự hệ OD The National Institute for Biological Standards and Control The National Institute of Standards and Technology Optical density Viện Quốc gia kiểm chuẩn sinh học Viện Quốc gia Tiêu chuẩn Công nghệ Mật độ quang học ORF Open reading frame Khung đọc mở PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp QA Quality assurance Đảm bảo chất lượng QC Quality control Kiểm soát chất lượng RMs Reference materials Các vật liệu tham chiếu Rpm Resolution per minute Vòng/phút SNPs Đa hình nucleotide đơn SRMs Single nucleotide polymorphisms Standard Reference Materials TBE Tris - Borate - EDTA YHDPQĐ Y học dự phòng Quân đội WHO World Health Organization NCBI NGS NIBSC NIST Các vật liệu tham chiếu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Đặc điểm hệ gen chủng B anthracis Ames Bảng 2.1 Thông tin chủng vi khuẩn nghiên cứu 34 Bảng 2.2 Các mồi sử dụng nghiên cứu nhân dòng giải trình tự 36 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi tạo dòng chứng nội cạnh tranh 37 Bảng 2.4 Các máy thiết bị 37 Bảng 2.5 Thành phần dự kiến mPCR xác định đồng thời B anthracis Y pestis 41 Bảng 3.1 Thông tin cặp mồi mPCR xác định B anthracis Y pestis 52 Bảng 3.2 Tổng hợp kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi mPCR 60 Bảng 3.3 Tổng hợp kết tối ưu nồng độ MgCl2 mPCR 60 Bảng 3.4 Tổng hợp kết tối ưu nồng độ dNTPs mPCR 62 Bảng 3.5 Tổng hợp kết tối ưu dung dịch đệm mPCR 62 Bảng 3.6 Các thành phần cho mPCR tối ưu với cặp mồi xác định gen vrrA, pagA, capA, ypo2088, pla, caf1 phát đồng thời B anthracis Y pestis 63 Bảng 3.7 Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát B anthracis 70 Bảng 3.8 Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định B anthracis 71 Bảng 3.9 Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát Y pestis 72 74 Bảng 3.10 Bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu kiểm định kit B anthracis Bảng 3.11 Đánh giá độ nhạy mPCR với B anthracis mẫu chuẩn 75 Bảng 3.12 Đánh giá độ nhạy kit mPCR với Y pestis mẫu chuẩn 76 v 77 Bảng 3.13 Đánh giá độ đặc hiệu kit mPCR với B anthracis Bảng 3.14 Đánh giá độ đặc hiệu kit mPCR với Y pestis mẫu chuẩn 78 Bảng 3.15 Tổng hợp kết định danh xác định chủng B anthracis kit API50 CH 82 Bảng 3.16 Tổng hợp đột biến xác định chủng Bacillus anthracis 92 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Bacillus anthracis tiêu nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu Hình 1.2 Khuẩn lạc B anthracis môi trường thạch máu cừu Hình 1.3 Yersinia pestis tiêu nhuộm Wright - Giemsa 11 Hình 1.4 Khuẩn lạc Y pestis mơi trường thạch máu 12 Hình 2.1 Sơ đồ q trình tạo dòng chứng nội tái tổ hợp pJET1.2-capA- IC1 43 Hình 3.1 Các đoạn sản phẩm PCR tương ứng với cặp mồi khác gen vrrA 48 Hình 3.2 Thơng tin cặp mồi khuếch đại gen vrrA với kích thước khác 49 Hình 3.3 Thông tin cặp mồi khuếch đại gen pagA với kích thước khác 49 Hình 3.4 Thơng tin cặp mồi khuếch đại gen capA với kích thước khác 50 Hình 3.5 Thơng tin cặp mồi khuếch đại gen ypo2088 với kích thước khác 50 Hình 3.6 Thơng tin cặp mồi khuếch đại gen pla với kích thước khác 51 Hình 3.7 Thơng tin cặp mồi khuếch đại gen caf1 với kích thước khác 51 Hình 3.8 Sản phẩm khuếch đại gen đích B anthracis Ba1 PCR đơn mồi 53 Hình 3.9 Sản phẩm khuếch đại đồng thời gen đích B anthracis mPCR với cặp mồi vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1 54 Hình 3.10 Sản phẩm khuếch đại gen đích Y pestis Yp1 PCR đơn mồi 55 vii Hình 3.11 Sản phẩm khuếch đại đồng thời gen đích Y pestis Yp1 mPCR với cặp mồi ypo2088F1/R1, plaF1/R1, cafF1/R1 56 Hình 3.12 Sản phẩm PCR với cặp mồi, loại DNA khuôn 56 Hình 3.13 Sản phẩm mPCR với cặp mồi, loại tác nhân 57 Hình 3.14 Tối ưu nồng độ mồi mPCR 58 Hình 3.15 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi mPCR 59 Hình 3.16 Tối ưu nồng độ MgCl2 mPCR 61 Hình 3.17 Tối ưu nồng độ dNTPs mPCR 61 Hình 3.18 Phân lập gen lef cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI tạo dòng phụ vector pJET1.2/blunt 64 Hình 3.19 Các kết tạo dòng chứng nội pJET1.2-capA-IC1 65 Hình 3.20 Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung IC trình tách chiết DNA nồng độ khác với mẫu B anthracis 66 Hình 3.21 Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung chứng nội q trình tách chiết DNA nồng độ 105 5x104 copy 67 Hình 3.22 Master mix mPCR đóng gói kèm hướng dẫn sử dụng 69 Hình 3.23 Xác định ngưỡng phát B anthracis 70 Hình 3.24 Xác định ngưỡng phát Y pestis 73 Hình 3.25 Kiểm tra mPCR mẫu chuẩn độ nhạy với B anthracis 76 Hình 3.26 Kiểm tra mPCR mẫu chuẩn độ nhạy với Y pestis 76 Hình 3.27 Kiểm tra mPCR mẫu chuẩn độ nhạy với B anthracis Y pestis 77 Hình 3.28 Đánh giá độ đặc hiệu với B anthracis kit BaYp-mPCR 78 Hình 3.29 Kiểm định độ đặc hiệu với Y pestis kit BaYp-mPCR 78 Hình 3.30 Kiểm tra mPCR sau tạo master mix 79 Hình 3.31 Kiểm tra độ ổn định mPCR sau thời gian bảo quản tháng 79 viii M 10 Sau thời gian tháng bảo quản M 10 Sau thời gian tháng bảo quản M 10 Sau thời gian tháng bảo quản M Sau thời gian 10 tháng bảo quản 10 Sau thời gian 11 tháng bảo quản Phụ lục Minh họa kết giải trình tự gen đích B anthracis (pagA, capA, vrrA) Y pestis (pla, caf1, ypo2088) từ băng tinh gel Trình tự đoạn gen vrrA Trình tự đoạn gen pagA Trình tự đoạn gen pla Trình tự đoạn gen caf1 Phụ lục 10 Kiểm tra sản phẩm tách plasmid từ thể biến nạp chứa gen pla, caf1 chủng Y pestis Yp1 PCR khuẩn lạc enzyme giới hạn M Marker kb (Thermo Scientific); a) PCR khuẩn lạc, 1-4 Các dòng khuẩn lạc 1-4 với gen pla; 5-8 Các dòng khuẩn lạc 1-4 với gen caf1; b) Cắt kiểm tra cặp enzyme giới hạn AvaI XbaI; 1-4 Sản phẩm cắt dòng khuẩn lạc 3; 1, 2, với gen pla; c) Cắt kiểm tra cặp enzyme giới hạn AvaI XbaI; 1, Sản phẩm cắt dòng khuẩn lạc 1, với gen caf1 Phụ lục 11 So sánh trình tự axit amin kháng nguyên bảo vệ PA chủng B anthracis Ba1, Ba3 Ba4 với 15 chủng tham chiếu Phụ lục 12 Một số trình tự nucleotide B anthracis đăng ký Genbank Bacillus anthracis strain 4NS plasmid pX01 protective antigen gene, complete cds GenBank: KP213103.1 FASTA Graphics PopSet Go to: LOCUS KP213103 2322 bp DNA linear BCT 18-APR-2015 DEFINITION Bacillus anthracis strain 4NS plasmid pX01 protective antigen gene, complete cds ACCESSION KP213103 VERSION KP213103.1 GI:806993499 KEYWORDS SOURCE Bacillus anthracis ORGANISM Bacillus anthracis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus; Bacillus cereus group REFERENCE (bases to 2322) AUTHORS Hang,D.T.T and Son,N.T TITLE Study the complete sequence of protective antigen gene on Bacillus anthracis strains VCM1168, 4NS and 1C3 isolated in northern Vietnam JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 2322) AUTHORS Hang,D.T.T and Son,N.T TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (28-NOV-2014) Medical Microbiology, Vietnam Military Medical University, 160 Phung Hung, Ha Dong, Ha Noi, Viet Nam, Ha Noi, Ha Dong 84, Viet Nam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 2322 /organism="Bacillus anthracis" /mol_type="genomic DNA" /strain="4NS" /host="Homo sapiens" /db_xref="taxon:1392" /plasmid="pX01" /country="Viet Nam" CDS 14 2308 /note="pag" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="protective antigen" /protein_id="AKC34323.1" /db_xref="GI:806993500" /translation="MKKRKVLIPLMALSTILVSSTGNLEVIQAEVKQENRLLNESESS SQGLLGYYFSDLNFQAPMVVTSSTTGDLSIPSSELENIPSENQYFQSAIWSGFIKVKK SDEYTFATSADNHVTMWVDDQEVINKASNSNKIRLEKGRLYQIKIQYQRENPTEKGLD FKLYWTDSQNKKEVISSDNLQLPELKQKSSNSRKKRSTSAGPTVPDRDNDGIPDSLEV EGYTVDVKNKRTFLSPWISNIHEKKGLTKYKSSPEKWSTASDPYSDFEKVTGRIDKNV SPEARHPLVAAYPIVHVDMENIILSKNEDQSTQNTDSQTRTISKNTSTSRTHTSEVHG NAEVHASFFDIGGSVSAGFSNSNSSTVAIDHSLSLAGERTWAETMGLNTADTARLNAN IRYVNTGTAPIYNVLPTTSLVLGKNQTLATIKAKENQLSQILAPNNYYPSKNLAPIAL NAQDDFSSTPITMNYNQFLELEKTKQLRLDTDQVYGNIATYNFENGRVRVDTGSNWSE VLPQIQETTARIIFNGKDLNLVERRIAAVNPSDPLETTKPDMTLKEALKIAFGFNEPN GNLQYQGKDITEFDFNFDQQTSQNIKNQLAELNATNIYTVLDKIKLNAKMNILIRDKR FHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLK EVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPS ENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG" ORIGIN aaggagaacg tatatgaaaa aacgaaaagt gttaatacca ttaatggcat tgtctacgat 61 attagtttca agcacaggta atttagaggt gattcaggca gaagttaaac aggagaaccg 121 gttattaaat gaatcagaat caagttccca ggggttacta ggatactatt ttagtgattt 181 gaattttcaa gcacccatgg tggttacctc ttctactaca ggggatttat ctattcctag 241 ttctgagtta gaaaatattc catcggaaaa ccaatatttt caatctgcta tttggtcagg 301 atttatcaaa gttaagaaga gtgatgaata tacatttgct acttccgctg ataatcatgt 361 aacaatgtgg gtagatgacc aagaagtgat taataaagct tctaattcta acaaaatcag 421 attagaaaaa ggaagattat atcaaataaa aattcaatat caacgagaaa atcctactga 481 aaaaggattg gatttcaagt tgtactggac cgattctcaa aataaaaaag aagtgatttc 541 tagtgataac ttacaattgc cagaattaaa acaaaaatct tcgaactcaa gaaaaaagcg 601 aagtacaagt gctggaccta cggttccaga ccgtgacaat gatggaatcc ctgattcatt 661 agaggtagaa ggatatacgg ttgatgtcaa aaataaaaga acttttcttt caccatggat 721 ttctaatatt catgaaaaga aaggattaac caaatataaa tcatctcctg aaaaatggag 781 cacggcttct gatccgtaca gtgatttcga aaaggttaca ggacggattg ataagaatgt 841 atcaccagag gcaagacacc cccttgtggc agcttatccg attgtacatg tagatatgga 901 gaatattatt ctctcaaaaa atgaggatca atccacacag aatactgata gtcaaacgag 961 aacaataagt aaaaatactt ctacaagtag gacacatact agtgaagtac atggaaatgc 1021 agaagtgcat gcgtcgttct ttgatattgg tgggagtgta tctgcaggat ttagtaattc 1081 gaattcaagt acggtcgcaa ttgatcattc actatctcta gcaggggaaa gaacttgggc 1141 tgaaacaatg ggtttaaata ccgctgatac agcaagatta aatgccaata ttagatatgt 1201 aaatactggg acggctccaa tctacaacgt gttaccaacg acttcgttag tgttaggaaa 1261 aaatcaaaca ctcgcgacaa ttaaagctaa ggaaaaccaa ttaagtcaaa tacttgcacc 1321 taataattat tatccttcta aaaacttggc gccaatcgca ttaaatgcac aagacgattt 1381 cagttctact ccaattacaa tgaattacaa tcaatttctt gagttagaaa aaacgaaaca 1441 attaagatta gatacggatc aagtatatgg gaatatagca acatacaatt ttgaaaatgg 1501 aagagtgagg gtggatacag gctcgaactg gagtgaagtg ttaccgcaaa ttcaagaaac 1561 aactgcacgt atcattttta atggaaaaga tttaaatctg gtagaaaggc ggatagcggc 1621 ggttaatcct agtgatccat tagaaacgac taaaccggat atgacattaa aagaagccct 1681 taaaatagca tttggattta acgaaccgaa tggaaactta caatatcaag ggaaagacat 1741 aaccgaattt gattttaatt tcgatcaaca aacatctcaa aatatcaaga atcagttagc 1801 ggaattaaac gcaactaaca tatatactgt attagataaa atcaaattaa atgcaaaaat 1861 gaatatttta ataagagata aacgttttca ttatgataga aataacatag cagttggggc 1921 ggatgagtca gtagttaagg aggctcatag agaagtaatt aattcgtcaa cagagggatt 1981 attgttaaat attgataagg atataagaaa aatattatca ggttatattg tagaaattga 2041 agatactgaa gggcttaaag aagttataaa tgacagatat gatatgttga atatttctag 2101 tttacggcaa gatggaaaaa catttataga ttttaaaaaa tataatgata aattaccgtt 2161 atatataagt aatcccaatt ataaggtaaa tgtatatgct gttactaaag aaaacactat 2221 tattaatcct agtgagaatg gggatactag taccaacggg atcaagaaaa ttttaatctt 2281 ttctaaaaaa ggctatgaga taggataagg taattctagg tg // Bacillus anthracis strain 4NS plasmid pX01 lethal factor gene, complete cds GenBank: KP759886.1 FASTA Graphics PopSet Go to: LOCUS KP759886 2490 bp DNA linear BCT 16-AUG-2015 DEFINITION Bacillus anthracis strain 4NS plasmid pX01 lethal factor gene, complete cds ACCESSION KP759886 VERSION KP759886.1 GI:914408428 KEYWORDS SOURCE Bacillus anthracis ORGANISM Bacillus anthracis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus;Bacillus cereus group REFERENCE (bases to 2490) AUTHORS Dinh,H.T.T., Nguyen,S.T., Nghiem,M.N., Cao,D.T and Trieu,N.T TITLE Development of a recombinant internal amplification control in multiplex PCR assay for simultaneous detection of Bacillus anthrasis and Yersinia pestis in Vietnam JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 2490) AUTHORS Dinh,H.T.T., Nguyen,S.T., Nghiem,M.N., Nguyen,A.V., Nguyen,V.T and Tran,K.D TITLE Sequence analysis of specific target gene and virulence genes on plasmids pXO1 and pXO2 of Bacillus anthracis strains isolated in Vietnam and application of virulence Bacillus anthracis detection JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 2490) AUTHORS Dinh,H.T.T., Nguyen,S.T., Nghiem,M.N., Cao,D.T and Trieu,N.T TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (07-FEB-2015) Medical Microbiology, Vietnam Military Medical University, 160 Phung Hung, Ha Noi, Ha Dong 84, Viet Nam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 2490 /organism="Bacillus anthracis" /mol_type="genomic DNA" /strain="4NS" /host="Homo sapiens" /db_xref="taxon:1392" /plasmid="pX01" /country="Viet Nam" CDS 52 2481 /note="lef" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="lethal factor" /protein_id="AKV71981.1" /db_xref="GI:914408429" /translation="MNIKKEFIKVISMSCLVTAITLSGPVFIPLVQGAGGHGDVGMHV KEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKVPSD VLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEP VLVIQSSEDYVENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDG QDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNY MDKFNEQEINLSLEELKDQRMLARYEKWEKIKQHYQHWSDSLSEEGRGLLKKLQIPIE PKKDDIIHSLSQEEKELLKRIQIDSSDFLSTEEKEFLKKLQIDIRDSLSEEEKELLNR IQVDSSNPLSEKEKEFLKKLKLDIQPYDINQRLQDTGGLIDSPSINLDVRKQYKRDIQ NIDALLHQSIGSTLYNKIYLYENMNINNLTATLGADLVDSTDNTKINRGIFNEFKKNF KYSISSNYMIVDINERPALDNERLKWRIQLSPDTRAGYLENGKLILQRNIGLEIKDVQ IIKQSEKEYIRIDAKVVPKSKIDTKIQEAQLNINQEWNKALGLPKYTKLITFNVHNRY ASNIVESAYLILNEWKNNIQSDLIKKVTNYLVDGNGRFVFTDITLPNIAEQYTHQDEI YEQVHSKGLYVPESRSILLHGPSKGVELRNDSEGFIHEFGHAVDDYAGYLLDKNQSDL VTNSKKFIDIFKEEGSNLTSYGRTNEAEFFAEAFRLMHSTDHAERLKVQKNAPKTFQFINDQIKFIINS" ORIGIN tactttattt tattgttgaa atgttcactt ataaaaaagg agagattaaa tatgaatata 61 aaaaaagaat ttataaaagt aattagtatg tcatgtttag taacagcaat tactttgagt 121 ggtcccgtct ttatccccct tgtacagggg gcgggcggtc atggtgatgt aggtatgcac 181 gtaaaagaga aagagaaaaa taaagatgag aataagagaa aagatgaaga acgaaataaa 241 acacaggaag agcatttaaa ggaaatcatg aaacacattg taaaaataga agtaaaaggg 301 gaggaagctg ttaaaaaaga ggcagcagaa aagctacttg agaaagtacc atctgatgtt 361 ttagagatgt ataaagcaat tggaggaaag atatatattg tggatggtga tattacaaaa 421 catatatctt tagaagcatt atctgaagat aagaaaaaaa taaaagacat ttatgggaaa 481 gatgctttat tacatgaaca ttatgtatat gcaaaagaag gatatgaacc cgtacttgta 541 atccaatctt cggaagatta tgtagaaaat actgaaaagg cactgaacgt ttattatgaa 601 ataggtaaga tattatcaag ggatatttta agtaaaatta atcaaccata tcagaaattt 661 ttagatgtat taaataccat taaaaatgca tctgattcag atggacaaga tcttttattt 721 actaatcagc ttaaggaaca tcccacagac ttttctgtag aattcttgga acaaaatagc 781 aatgaggtac aagaagtatt tgcgaaagct tttgcatatt atatcgagcc acagcatcgt 841 gatgttttac agctttatgc accggaagct tttaattaca tggataaatt taacgaacaa 901 gaaataaatc tatccttgga agaacttaaa gatcaacgga tgctggcaag atatgaaaaa 961 tgggaaaaga taaaacagca ctatcaacac tggagcgatt ctttatctga agaaggaaga 1021 ggacttttaa aaaagctgca gattcctatt gagccaaaga aagatgacat aattcattct 1081 ttatctcaag aagaaaaaga gcttctaaaa agaatacaaa ttgatagtag tgatttttta 1141 tctactgagg aaaaagagtt tttaaaaaag ctacaaattg atattcgtga ttctttatct 1201 gaagaagaaa aagagctttt aaatagaata caggtggata gtagtaatcc tttatctgaa 1261 aaagaaaaag agtttttaaa aaagctgaaa cttgatattc aaccatatga tattaatcaa 1321 aggttgcaag atacaggagg gttaattgat agtccgtcaa ttaatcttga tgtaagaaag 1381 cagtataaaa gggatattca aaatattgat gctttattac atcaatccat tggaagtacc 1441 ttgtacaata aaatttattt gtatgaaaat atgaatatca ataaccttac agcaacccta 1501 ggtgcggatt tagttgattc cactgataat actaaaatta atagaggtat tttcaatgaa 1561 ttcaaaaaaa atttcaaata tagtatttct agtaactata tgattgttga tataaatgaa 1621 aggcctgcat tagataatga gcgtttgaaa tggagaatcc aattatcacc agatactcga 1681 gcaggatatt tagaaaatgg aaagcttata ttacaaagaa acatcggtct ggaaataaag 1741 gatgtacaaa taattaagca atccgaaaaa gaatatataa ggattgatgc gaaagtagtg 1801 ccaaagagta aaatagatac aaaaattcaa gaagcacagt taaatataaa tcaggaatgg 1861 aataaagcat tagggttacc aaaatataca aagcttatta cattcaacgt gcataataga 1921 tatgcatcca atattgtaga aagtgcttat ttaatattga atgaatggaa aaataatatt 1981 caaagtgatc ttataaaaaa ggtaacaaat tacttagttg atggtaatgg aagatttgtt 2041 tttaccgata ttactctccc taatatagct gaacaatata cacatcaaga tgagatatat 2101 gagcaagttc attcaaaagg gttatatgtt ccagaatccc gttctatatt actccatgga 2161 ccttcaaaag gtgtagaatt aaggaatgat agtgagggtt ttatacacga atttggacat 2221 gctgtggatg attatgctgg atatctatta gataagaacc aatctgattt agttacaaat 2281 tctaaaaaat tcattgatat ttttaaggaa gaagggagta atttaacttc gtatgggaga 2341 acaaatgaag cggaattttt tgcagaagcc tttaggttaa tgcattctac ggaccatgct 2401 gaacgtttaa aagttcaaaa aaatgctccg aaaactttcc aatttattaa cgatcagatt 2461 aagttcatta ttaactcata agtaatgtat // Bacillus anthracis plasmid pX02 capsule biosynthesis protein CapC gene, complete cds; and capsule biosynthesis protein CapB (capB) gene, partial cds GenBank: KP759892.1 FASTA Graphics PopSet Go to: LOCUS KP759892 1848 bp DNA linear BCT 16-AUG-2015 DEFINITION Bacillus anthracis plasmid pX02 capsule biosynthesis protein CapC gene, complete cds; and capsule biosynthesis protein CapB (capB) gene, partial cds ACCESSION KP759892 VERSION KP759892.1 GI:914408442 KEYWORDS SOURCE Bacillus anthracis ORGANISM Bacillus anthracis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus;Bacillus cereus group REFERENCE (bases to 1848) AUTHORS Dinh,H.T.T., Nguyen,S.T and Nghiem,M.N TITLE Sequence analysis of specific target gene and virulence genes on plasmids pXO1 and pXO2 of Bacillus anthracis strains isolated in Vietnam and application of virulence Bacillus anthracis detection JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1848) AUTHORS Dinh,H.T.T., Nguyen,S.T., Nghiem,M.N., Cao,D.T and Trieu,N.T TITLE Development of a recombinant internal amplification control in multiplex PCR assay for simultaneous detection of Bacillus anthrasis and Yersinia pestis in Vietnam JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1848) AUTHORS Dinh,H.T.T and Nguyen,S.T TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (09-FEB-2015) Medical Microbiology, Vietnam Military Medical University, 160 Phung Hung, Ha Noi, Ha Dong 84, Viet Nam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1848 /organism="Bacillus anthracis" /mol_type="genomic DNA" /strain="4NS" /host="Homo sapiens" /db_xref="taxon:1392" /plasmid="pX02" /country="Viet Nam" CDS complement(21 470) /codon_start=1 /transl_table=11 /product="capsule biosynthesis protein CapC" /protein_id="AKV71989.1" /db_xref="GI:914408443" /translation="MFGSDLYIALVLGVTLSLIFTERTGILPAGLVVPGYLALVFNQP VFMLVVLFISILTYVIVTYGVSRFMILYGRRKFAATLITGICLKLLFDYCYPVMPFEI FEFRGIGVIVPGLIANTIQRQGLPLTIGTTILLSGATFAIMNIYYLF" gene complement(485 >1848) /gene="capB" CDS complement(485 >1848) /gene="capB" /codon_start=3 /transl_table=11 /product="capsule biosynthesis protein CapB" /protein_id="AKV71990.1" /db_xref="GI:914408444" /translation="HDEAIRIEHRISELYSDEFGVVYAGNHLIFNWYQRLYLSRNILI SKKSKSRKGLIQMIFIIGICTVFLIIYGIWEQRCHQKRLNSIPIRVNINGIRGKSTVT RLITGVVQEAKYKTVGKTTGTSARMIYWFTDEEQPIKRRKEGPNIGEQRRVVKEAADL EAEALICECMAVQPDYQIIFQNKMIQANVGVIVNVLEDHMDVMGPTLDEVAEAFTATI PYNGHLVTIESEYLDYFKEVAEERNTKVIVADNSRISEEFLRKFDYMVFPDNASLALA VAEALGIDEETAFRGMLNAHPDPGAMRITRFADQSKPAFFVNGFAANDPSSTLRIWER VDDFGYSNLAPIVIMNCRPDRVDRTEQFARDVLPYIKAEIVIAIGETTAPITSAFEKG DIPTQEYWNLEGWSTSEIMSRMRPYLKNRIVYGVGNIHGAAEPLIDMIMEEQIGKKQAKVI" ORIGIN tcgtctcatt ctacctcacc ttaaaataag taataaatat tcatgattgc aaatgttgca 61 ccacttaaca aaattgtagt tccaattgtt aatggtaacc cttgtctttg aattgtattt 121 gcaattaatc ctggaacaat aactccaata ccacggaatt caaaaatctc aaatggcata 181 acaggataac aataatcaaa taaaagtttt aaacaaatac ctgtaattag cgttgccgca 241 aattttctac ggccatataa aatcatgaat cttgaaacac catacgtaac gattacatat 301 gttaaaatac tgataaataa aacaaccaac ataaatacgg gctgattaaa aacgagtgct 361 aaataaccag gtacaactaa acctgcaggt aaaatacctg ttctttctgt aaaaataagg 421 ctcagtgtaa ctcctaatac taatgcaata tataaatctg atccaaacat tcctgtccct 481 ccacttaaat cacttttgct tgctttttgc caatttgttc ttccataatc atatcgatta 541 atggctcagc tgcaccatga atattaccca ctccatatac aatccgattt tttaaatatg 601 gacgcatacg agacataatt tcacttgttg accagccttc taagttccaa tactcttgcg 661 ttggaatatc tcctttttca aaagcacttg taataggtgc agtcgtttct ccaatcgcaa 721 taactatttc cgctttaata tatggcaaaa catccctagc aaactgctca gtacgatcaa 781 cgcggtcagg gcggcaattc ataattacaa ttggagctag attactatat ccaaaatcat 841 ccacacgttc ccaaatacgt aatgttgatg agggatcatt cgctgcaaaa ccatttacga 901 agaacgcagg cttagattgg tcagcaaaac gtgtaattct cattgctcct ggatccggat 961 gagcattcaa cataccacgg aatgctgttt cctcatcaat cccaagagcc tctgctaccg 1021 ctaaagcaag cgatgcatta tctgggaaga ccatgtaatc aaattttcgt aagaattctt 1081 ctgaaattct agaattatcc gcaacaatca cttttgtatt tctctcttct gcaacctctt 1141 taaagtaatc caagtattca ctttcaatag tgactaaatg tccattatat ggaatggtag 1201 cagtgaaagc ttcagctact tcgtcaagtg taggtcccat aacatccata tgatcttcta 1261 aaacatttac aatcactcca acatttgctt gaatcatttt attttggaag ataatttgat 1321 aatcgggttg aactgccata cattcacaaa taagtgcttc tgcttctaaa tcagcagcct 1381 ctttaactac cctgcgttgc tcaccgatat taggaccttc tttacggcgc ttaatcggtt 1441 gctcctcgtc agtaaaccaa tatatcattc gcgcagatgt accagttgtt ttccctacag 1501 tcttatattt cgcttcttgt acaacacctg taattagtct tgtaacggta gatttacctc 1561 gaattccatt tatgtttact cgaattggga tagaattgag ccttttctga tggcaacgtt 1621 gttcccatat accataaata atcaaaaaca ctgtacatat acctattatg aagatcatct 1681 gtattaatcc cttcctgctt ttcgatttct tgcttattaa gatatttcga cttaagtaga 1741 gtcgttgata ccaattaaaa attaggtggt tccctgcata tacaacaccg aattcatctg 1801 agtataattc tgaaatccta tgttcaatgc gtattgcctc atcatgtt // Bacillus anthracis strain 4NS VrrA gene, complete cds GenBank: KP759889.1 FASTA Graphics PopSet LOCUS KP759889 519 bp DNA linear BCT 16-AUG-2015 DEFINITION Bacillus anthracis strain 4NS VrrA gene, complete cds ACCESSION KP759889 VERSION KP759889.1 GI:914408434 KEYWORDS SOURCE Bacillus anthracis ORGANISM Bacillus anthracis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus;Bacillus cereus group REFERENCE (bases to 519) AUTHORS Dinh,H.T.T., Nguyen,S.T and Nghiem,M.N TITLE Sequence analysis of specific target gene and virulence genes on plasmids pXO1 and pXO2 of Bacillus anthracis strains isolated in Vietnam and application of virulence Bacillus anthracis detection JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 519) AUTHORS Dinh,H.T.T., Nguyen,S.T., Nghiem,M.N., Cao,D.T and Trieu,N.T TITLE Development of a recombinant internal amplification control in multiplex PCR assay for simultaneous detection of Bacillus anthrasis and Yersinia pestis in Vietnam JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 519) AUTHORS Dinh,H.T.T and Nguyen,S.T TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (09-FEB-2015) Medical Microbiology, Vietnam Military Medical University, 160 Phung Hung, Ha Noi, Ha Dong 84, Viet Nam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 519 /organism="Bacillus anthracis" /mol_type="genomic DNA" /strain="4NS" /host="Homo sapiens" /db_xref="taxon:1392" /country="Viet Nam" CDS 18 461 /codon_start=1 /transl_table=11 /product="VrrA" /protein_id="AKV71984.1" /db_xref="GI:914408435" /translation="MQHHPEQMIPPQMYESNETRGGAATTAASSSGIGSFFSNLISNP TNMINNIEKVSQVVQSVSPVVEQYGPIMRNLPSIVKILTSGKSTEENPTEDQTEDLTE KVEVATPPPPQKKRKRKKMVIEPVIEKEVREEPVQKIATKPKLYV" ORIGIN agcaatacca accatacatg cagcatcatc ccgagcaaat gatccctcct caaatgtatg 61 aatcaaacga aacgcgcggc ggtgcagcaa ctacagcagc atcaagtagc ggcatcggta 121 gttttttttc gaatttaatt tcgaatccaa ctaatatgat aaataatatc gaaaaagtat 181 cacaagtcgt tcaatctgta agccctgtcg tcgaacagta cggtcccatt atgcgtaacc 241 taccaagcat cgttaaaatc ctcacctctg gaaaaagtac ggaagaaaat ccaaccgaag 301 atcaaactga agacctaaca gaaaaggttg aagtagcaac tccacctcct ccacaaaaaa 361 aaagaaaaag aaaaaaaatg gtgattgagc cagttataga aaaagaagtg cgcgaggagc 421 ctgttcaaaa aatagcaaca aaaccaaaac tatatgtgta acaatccttt gttttctatc 481 cactcctcct ttataatgta aaagactatg cacaaaagt// Phụ lục 13 Một số trình tự nucleotide Y pestis đăng ký Genbank Yersinia pestis plasmid pPCP1 plasminogen activator (pla) gene, complete cds GenBank: KM880025.1 FASTA Graphics Go to: LOCUS KM880025 1019 bp DNA linear BCT 03-FEB-2015 DEFINITION Yersinia pestis plasmid pPCP1 plasminogen activator (pla) gene, complete cds ACCESSION KM880025 VERSION KM880025.1 GI:751384056 KEYWORDS SOURCE Yersinia pestis ORGANISM Yersinia pestis Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;Enterobacteriaceae; Yersinia REFERENCE (bases to 1019) AUTHORS Hang,D.T.T and Son,N.T TITLE Sequence analysis of pla, caf1 and ypo2088 genes of Yersinia pestis isolate in Vietnam JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1019) AUTHORS Hang,D.T.T and Son,N.T TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (08-OCT-2014) Medical Microbiology, Vietnam Military Medical University, 160 Phung Hung, Ha Noi, Ha Dong 84, Viet Nam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1019 /organism="Yersinia pestis" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:632" /plasmid="pPCP1" /country="Viet Nam" gene 23 961 /gene="pla" CDS 23 961 /gene="pla" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="plasminogen activator" /protein_id="AJF83857.1" /db_xref="GI:751384057" /translation="MKKSSIVATIITILSGSANAASSQLIPNISPDSFTVAASTGMLS GKSHEMLYDAETGRKISQLDWKIKNVAILKGDISWDPYSFLTLNARGWTSLASGSGNM DDYDWMNENQSEWTDHSSHPATNVNHANEYDLNVKGWLLQDENYKAGITAGYQETRFS WTATGGSYSYNNGAYTGNFPKGVRVIGYNQRFSMPYIGLAGQYRINDFELNALFKFSD WVRAHDNDEHYMRDLTFREKTSGSRYYGTVINAGYYVTPNAKVFAEFTYSKYDEGKGG TQTIDKNSGDSVSIGGDAAGISNKNYTVTAGLQYRF" ORIGIN gcagagagat taagggtgtc taatgaagaa aagttctatt gtggcaacca ttataactat 61 tctgtccggg agtgctaatg cagcatcatc tcagttaata ccaaatatat cccctgacag 121 ctttacagtt gcagcctcca ccgggatgct gagtggaaag tctcatgaaa tgctttatga 181 cgcagaaaca ggaagaaaga tcagccagtt agactggaag atcaaaaatg tcgctatcct 241 gaaaggtgat atatcctggg atccatactc atttctgacc ctgaatgcca gggggtggac 301 gtctctggct tccgggtcag gtaatatgga tgactacgac tggatgaatg aaaatcaatc 361 tgagtggaca gatcactcat ctcatcctgc tacaaatgtt aatcatgcca atgaatatga 421 cctcaatgtg aaaggctggt tactccagga tgagaattat aaagcaggta taacagcagg 481 atatcaggaa acacgtttca gttggacagc tacaggtggt tcatatagtt ataataatgg 541 agcttatacc ggaaacttcc cgaaaggagt gcgggtaata ggttataacc agcgcttttc 601 tatgccatat attggacttg caggccagta tcgcattaat gattttgagt taaatgcatt 661 atttaaattc agcgactggg ttcgggcaca tgataatgat gagcactata tgagagatct 721 tactttccgt gagaagacat ccggctcacg ttattatggt accgtaatta acgctggata 781 ttatgtcaca cctaatgcca aagtctttgc ggaatttaca tacagtaaat atgatgaggg 841 caaaggaggt actcagacca ttgataagaa tagtggagat tctgtctcta ttggcggaga 901 tgctgccggt atttccaata aaaattatac tgtgacggcg ggtctgcaat atcgcttctg 961 aaaaatacag atcatatctc tcttttcatc ctcccctagc ggggaggatg tctgtggaa // Yersinia pestis plasmid pMT1 F1 capsule antigen (caf1) gene, complete cds GenBank: KM880026.1 FASTA Graphics Go to: LOCUS KM880026 654 bp DNA linear BCT 03-FEB-2015 DEFINITION Yersinia pestis plasmid pMT1 F1 capsule antigen (caf1) gene, complete cds ACCESSION KM880026 VERSION KM880026.1 GI:751384058 KEYWORDS SOURCE Yersinia pestis ORGANISM Yersinia pestis Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Yersinia REFERENCE (bases to 654) AUTHORS Hang,D.T.T and Son,N.T TITLE Sequence analysis of pla, caf1 and ypo2088 genes of Yersinia pestis isolate in Vietnam JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 654) AUTHORS Hang,D.T.T and Son,N.T TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (08-OCT-2014) Medical Microbiology, Vietnam Military Medical University, 160 Phung Hung, Ha Noi, Ha Dong 84, Viet Nam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 654 /organism="Yersinia pestis" /mol_type="genomic DNA" /plasmid="pMT1" /country="Viet Nam" gene 60 572 /gene="caf1" CDS 60 572 /gene="caf1" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="F1 capsule antigen" /protein_id="AJF83858.1" /db_xref="GI:751384059" /translation="MKKISSVIAIALFGTIATANAADLTASTTATATLVEPARITLTY KEGAPITIMDNGNIDTELLVGTLTLGGYKTGTTSTSVNFTDAAGDPMYLTFTSQDGNN HQFTTKVIGKDSRDFDISPKVNGENLVGDDVVLATGSQDFFVRSIGSKGGKLAAGKYTDAVTVTVSNQ" ORIGIN ggacacaagc cctctctacg aatttgttcg tggattggat tattcgatag aggtaatata 61 tgaaaaaaat cagttccgtt atcgccattg cattatttgg aactattgca actgctaatg 121 cggcagattt aactgcaagc accactgcaa cggcaactct tgttgaacca gcccgcatca 181 ctcttacata taaggaaggc gctccaatta caattatgga caatggaaac atcgatacag 241 aattacttgt tggtacgctt actcttggcg gctataaaac aggaaccact agcacatctg 301 ttaactttac agatgccgcg ggtgatccca tgtacttaac atttacttct caggatggaa 361 ataaccacca attcactaca aaagtgattg gcaaggattc tagagatttt gatatctctc 421 ctaaggtaaa cggtgagaac cttgtggggg atgacgtcgt cttggctacg ggcagccagg 481 atttctttgt tcgctcaatt ggttccaaag gcggtaaact tgcagcaggt aaatacactg 541 atgctgtaac cgtaaccgta tctaaccaat aatccatata gataatagat aaaggagggc 601 tattatgccc tcctttaata tttatgaatt atcctacttt gagcctaacc ctcg // Phụ lục 14 Kết kiểm định Quốc gia ... Xuất phát từ vấn đề trên, luận án: Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis Yersinia pestis thực với hai mục tiêu: - Phát triển kỹ thuật multiplex. .. XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B anthracis VÀ Y pestis 95 4.1.1 Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B anthracis Y pestis 95 xi 4.1.2 Chứng nội mPCR xác định đồng thời. .. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR 53 3.1.3 Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B anthracis Y pestis 57 3.1.4 Nghiên cứu thiết kế chứng nội tái tổ hợp kỹ thuật mPCR