Nghiên cứu điều kiện phân tích sulfamit phương pháp sắc ký Bùi Minh Thái Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Hóa học; Chuyên ngành : Hóa phân tích; Mã số: 60 44 29; Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Ri Năm bảo vệ: 2011 Abstract: Tối ưu hoá điều kiện tách định lượng đồng thời năm chất HPLC: Chọn bước sóng detector; Chọn pha tĩnh; Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ…; Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lượng; Đánh giá độ lặp lại độ phép đo Tối ưu hố điều kiện xử lý mẫu phân tích: Chọn phương pháp xử lý mẫu xác định hiệu suất thu hồi Xây dựng quy trình phân tích ứng dụng quy trình nghiên cứu để phân tích số mẫu tơm Keyword: Phương pháp sắc ký; Hóa phân tích; Sulfamit; Chất kháng sinh; Tôm Content Dư lượng kháng sinh thực phẩm vấn đề quan ngại hầu hết quan kiểm soát thực phẩm giới Một số loại kháng sinh thông thường (chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) thân gây tác động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, số loại khác kháng sinh nhóm nitrofurans qua trình trao đổi chất thể động vật sinh hợp chất có độc tính cao thể sống Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit (SAs) nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ rộng, sử dụng nhiều trong nuôi trồng, chế biến nơng thủy sản, v.v Dựa thực tế đó, luận văn này, tiến hành nghiên cứu điều kiện tách xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole sulfamit sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis, phương pháp có độ chọn lọc, độ nhạy tốt trang bị nhiều sở kiểm nghiệm nước ta, có tính khả thi ứng dụng vào thực tế Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung sulfamit (SAs), metronidazole(MTD) 1.1.1 Cấu trúc phân tử Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát: R2 N SO NH R1 Khi thay nhóm R1, R2 gốc khác nhau, có SAs khác nhau.Vì có họ SAs Cấu trúc Metronidazole(MTD): Là thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt vi khuẩn kỵ khí động vật nguyên sinh MTD thành phần có mặt thức ăn chăn ni, thuốc kháng sinh nuôi trồng thủy sản (với tên thương mại Enro DC) 1.1.2 Tính chất vật lý hố học Sulfamit, Metronidazole 1.1.2.1 Tính chất vật lý SAs dạng tinh thể màu trắng vàng nhạt, khơng mùi, thường tan nước, tan dung dịch axít, tan dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin) MTD tinh thể bột kết tinh, vàng, không mùi, bền ngồi khơng khí, sẫm màu dần tiếp xúc với ánh sáng Nóng chảy khoảng 159oC – 163oC Metronidazol khó tan nước, aceton 1.1.2.2 Tính chất hố học - SAs có tính chất lưỡng tính - SAs tạo muối phức kết tủa với ion Ag+, tạo phức màu kết tủa với ion Cu2+, Co2+, … - Ở nhóm amin bậc SAs có đơi điện tử tự do, giúp SAs thực phản ứng tạo phức chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho phức màu tím có bước sóng hấp thụ cực đại 270-273 nm - Nhóm amin thơm tự cho phản ứng diazo hoá, ngưng tụ với naphtol cho ảnsphẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ bước sóng 460nm 1.1.3 Tính chất dƣợc lý phổ tác dụng Sulfamit, Metronidazole Với liều điều trị, SAs không diệt vi khuẩn, làm vi khuẩn yếu đi, không phát triển sinh sản được, dễ bị bạch cầu tiêu diệt SAs có phổ tác dụng hoạt phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vi khuẩn tả, Shigella, E.coli, trực khuẩn Metronidazole có hoạt phổ rộng bao gồm động vật nguyên sinh vi khuẩn yếm khí bao gồm: nhóm Bacteroides(gồm B fragilis), Fusobacterium Veillonella, nhóm Clostridium (bao gồm C difficile C perfringens), Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus Nó hiệu B fragilis phân lập kháng với clindamycin 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng khuẩn Sulfamit, Metronidazole 1.1.4.1 Cơ chế kháng khuẩn SAs - Ức chế enzym chuyển hóa acid folic - Ngăn cản tổng hợp axít folic vi khuẩn 1.1.4.2 Cơ chế kháng khuẩn Metronidazole Metronidazole tác dụng lên vi khuẩn kỵ khí Helicobacter pylori Gardnerella vaginalis, chế hành động chưa hiểu rõ Tuy nhiên, hoạt động chống lại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc xảy thơng qua quy trình bốn bước: - Tấn cơng vào vi sinh vật - Làm suy giảm hoạt hóa vận chuyển protein tế bào: - Giảm tương tác tiểu phân trung gian với tế bào - tiểu phân trung gian độc tương tác với DNA chủ, dẫn đến vỡ sợi DNA phá hủy chuỗi AND - Sự phá vỡ sản phẩm trung gian gây độc tế bào - tiểu phân trung gian độc hại phân hủy thành sản phẩm cuối không hoạt động 1.1.5 Một số chế phẩm Sulfamit tiêu biểu Như ta biết, SAs có họ gồm hàng nghìn chất, với tính chất cơng dụng khác Vì vậy, chúng tơi sâu vào bốn SAs nghiên cứu luận văn 1.1.5.1 Sulfaguanidin (SGU) Công thức: O O S NH H2N NH2 HN 1.1.5.2.Sulfamethoxypyridazin (SMP) Công thức: N O OCH3 N O S NH H2N 1.1.5.3.Sulfadoxin (SDO) Công thức: O N O N S OCH3 NH OCH3 H2N 1.1.5.4 Sulfamethoxazol (SMX) Công thức: O O O CH3 S NH H2 N N 1.2 Phƣơng pháp xác định 1.2.1 Một số cơng trình nghiên cứu xác định Sas phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004 [8], qui định phương pháp xác định hàm lượng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin,sulfamethoxypiridazine,sulfacloropyridazin,sulfadoxin, sulfamethoxazone sulfadimethoxin sulfa-chinoxalin) sản phẩm thủy sản HPLC- detector huỳnh quang Năm 2010 Cheong cộng sự[12] xác định dư lượng SAs (Sulfadiazine (SDZ),Sulfamethazine(SMZ),Sulfamethoxazole(SMX) Sulfaquinoxaline(SQX)) gan gà sử dụng phương pháp HPLC pha đảo, detector UV bước sóng 266nm PVinas, C.Lopez Erroz, N.Campillo, M.Hernandez xác định dư lượng sulfamit( sulfadiazine, sulfathiazole, sulfapyridine, sulfamerazine, sulfamethazine, sulfamethizole,sulfamethoxypyridazine,sulfachloropyridazine,sulfamonomethoxine, , sulfamethoxazole, sulfadimethoxine) thực phẩm phương pháp HPLC với dẫn xuất hóa huỳnh quang sau cột 1.2.2 Một số cơng trình nghiên cứu xác định Metronidazole phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) HPLC phương pháp ứng dụng để xác định Metronidazole năm gần Năm 2005, Ticiano Gomes Nascimento cộng sử dụng HPLC – UV xác định đồng thời ranitidine metronidazole huyết tương Năm 2007 Naser Tavakoli cộng sử dụng HPLC để xác định đồng thời metronidazole amoxicillin Năm 2008 Hadir M Maher cộng [đã xác định dư lượng đồng thời metronidazole spiamycin cá sử dụng phương pháp HPLC –UV 1.2.3 Một số cơng trình nghiên cứu xác định đồng thời sulfamit metronidazole phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Năm 2002, Richard Lindberg cộng xác định đồng thời chất kháng sinh thuộc họ sau: fluoroquinolones, sulfamit, trimethoprim,-β lactam (penicillin cephalosporines), nitroimidazoles tetracycline nước thải bệnh viện Phương pháp phân tích HPLC – MS Năm 2007, Wang P, Li J, Zheng H xác định đồng thời sulfamit (sulfacetamide,sulfapyridine,sulfamerazine,sulfamethazine,sulfamater,sulfamonomethoxi ne, sulfamethoxazole) metronidazole, chloramphenicol mỹ phẩm sắc ký HPLC-PDA - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu 2.1.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu Ở Việt Nam nuôi tôm trở thành hoạt động quan trọng xem mục tiêu chủ yếu kế hoạch phát triển nuôi trồng thủy sản Sự phát triển nhanh chóng nghề ni tơm dẫn đến tình hình sử dụng thuốc hóa chất gia tăng Họ thuốc kháng khuẩn SAs, MTD nhóm có hoạt phổ rộng, sử dụng nhiều chăn ni tơm để phòng ngừa chữa nhiều loại bệnh nhiễm khuẩn cho vật nuôi Sau vật ni sử dụng chất đó, khơng đảm bảo thời gian cách ly để vật nuôi tự làm có tồn dư chất kháng khuẩn gây tổn hại cho sức khoẻ người tiêu dùng Vì đối tượng phân tích mà chúng tơi chọn để nghiên cứu Metronidazole sulfaguanidin(SGU),sulfamethoxypyridazon(SMP),sulfadoxim(SDO),sulfamethoxazon (SMX), chất họ kháng khuẩn SAs sử dụng nhiều chăn nuôi.Xuất phát từ yêu cầu này, lựa chọn phương pháp nghiên cứu phương pháp HPLC hấp phụ pha ngược, detector ghép nối detector UV-Vis 2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu Với mục tiêu trên, luận văn nghiên cứu tách xác định đồng thời Sas, MTD HPLC sử dụng cột chiết pha ngược dùng detector UV-Vis 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Trong luận văn đối tượng phân tích mẫu tơm, có thành phần phức tạp Vì chúng tơi chọn phương pháp HPLC (High Performance Liquid Chromatograghy - Sắc ký lỏng hiệu nâng cao) để khảo sát điều kiện tách định lượng chất 2.2.1 Nguyên tắc chung trang bị phƣơng pháp HPLC Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) kỹ thuật tách chất xảy q trình chất tan chuyển dịch cột tách có chứa chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác phụ thuộc vào hệ số phân bố 2.2.2 Phân tích định lƣợng HPLC Trong điều kiện phân tích chọn, đại lượng đặc trưng cho chất thời gian lưu tRi chất cột tách Chúng ta dựa vào thời gian lưu để định tính chất thơng qua mẫu chuẩn Sau dựa vào tín hiệu phân tích thu (chiều cao pic diện tích pic) để định lượng chất Thông thường phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao pic diện tích H = k.Cb S = k.Cb Trong đó: H - chiều cao pic sắc ký chất S - diện tích pic sắc ký chất k - số điều kiện thực nghiệm tách sắc ký b - số chất, nhận giá trị vùng: < b ≤ 2.3 Giới thiệu chung phƣơng pháp chiết pha rắn Khi lượng chất phân tích có mẫu nhỏ, bước làm giàu chất phân tích qua cột chiết pha rắn cần thiết Hơn nữa, mẫu thực phẩm loại mẫu có phức tạp, ngồi chất phân tích có nhiều chất béo khác nên cần phải chiết pha rắn để lấy chất phân tích cách định lượng từ dung dịch, loại tạp chất thu hồi toàn 2.4 Hố chất dụng cụ 2.4.1 Hố chất Sulfadoxin (SDO), sulfaguanidin (SGU), sulfamethoxypyridazine (SMP), sulfamethoxazon(SMX), metronozazol(MTD) tinh khiết 99.9% Viện Kiểm nghiệm Dược Bộ y tế - Hai Bà Trưng, Hà Nội Metanol (MeOH), axetonitril (ACN), axít axetic, muối natri axetat loại tinh khiết HPLC hãng Meck, Đức 2.4.2 Dụng cụ Máy quang phổ UV-Vis 8453 hãng Agilent - Mỹ, điều khiển phần mềm Chemstation cho phép quét phổ từ 190 – 1100 nm Máy đo pH TIM 800 hãng Radiometer – Đan Mạch với điện cực thuỷ tinh Red – Rod cho phép đo pH bổ nhiệt độ tự động Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 3.1.1 Chọn bƣớc sóng detector Từ quang phổ, thấy chất hấp thu cực đại bước sóng khơng khác nhiều nằm khoảng 260-275nm Riêng MTD hấp thụ cực đại tại320nm Vì vậy, để có bước sóng chung cho chất chúng tơi chọn bước sóng 270nm cho thí nghiệm Đồng thời để định lượng chất MTD nhạy hơn, Detecto để kênh 320nm 270nm 3.1.2 Thăm dò khả tách Sulfamit cột RP-C18 Thời gian lưu tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký lúc chất tan rửa giải khỏi cột điểm có nồng độ cực đại Bảng 3.2: Thời gian lưu thứ tự pic chất phân tích TT Thời gian lưu tRi (phút) 3,30 4,48 8,49 13,23 15,08 Chất phân tích SGU MTD SMP SDO SMX Dựa vào việc khảo sát thời gian lưu chất phân tích biết thời gian lưu cụ thể chất làm sở cho trình phát định tính định lượng sulfamit, metronidazole đối tượng nghiên cứu sau 3.2 Chọn pha tĩnh Để nghiên cứu tách xác định SAs, MTD đa phần chất phân cực chủ yếu cơng trình cơng bố sử dụng cột tách chứa chất nhồi pha đảo RP- C4, RP – C12 ….Cột RP – C18 với kích thước hạt nhồi 5µm hãng Sulpenco- Australia chọn để tách chất 3.3 Tối ƣu hoá pha động 3.3.1 Nồng độ đệm axetat pha động Các giá trị nồng độ dung dịch đệm lựa chọn khảo sát khoảng – 20mM Khi thay đổi nồng độ dung dịch đệm hệ số dung tích khơng thay đổi Hơn nữa, nhìn sắc đồ nồng độ đệm khơng có ảnh hưởng rõ rệt tới khả tách thời gian xuất pic, diện tích pic sắc ký Tại nồng độ dung dịch đệm định pha động hệ số dung tích chất phân tích có khác rõ rệt, có tách tốt chất trình sắc ký Với khoảng nồng độ đệm tiến hành khảo sát pic sắc ký sắc nét riêng biệt Dựa nhận xét nồng độ dung dịch đệm thích hợp pha động lựa chọn 10mM 3.3.2 Độ pH cho dung dịch đệm axetat pH cao khả tách chất SMX SDO (pH=5,5) pH thấp thời gian rửa giải lâu (pH=3,5) Tại giá trị pH = 4,5 pic sắc ký có tách biệt rõ rệt hơn, pic cân đối không nhiều thời gian xuất pic sắc ký Mặt khác, dựa đồ thị nhận thấy pH có khác rõ rệt hệ số dung tích cuả chất phân tích Như vậy, pH pha động chọn 4,5 cho thí nghiệm 3.3.3 Tỉ lệ thành phần pha động Khi tăng dần tỉ lệ thành phần pha động thời gian rửa giải chất khỏi cột nhanh hơn, hệ số dung tích gần hơn, sắc đồ chân pic sắc ký lại không tách biệt rõ ràng, ảnh hưởng đến diện tích pic sắc ký (ví dụ tỉ lệ 30% ACN – 70% đệm) Tuy nhiên, tỷ ACN thấp nhiều thời gian để rửa giải chất phân tích Vì vậy, nên chọn tỷ lệ cho thời gian rửa giải không nhanh, không chậm, pic rõ ràng Với nhận xét lựa chọn tỉ lệ pha động gồm 20% ACN – 80% tỉ lệ phù hợp cho thí nghiệm 3.3.4 Tốc độ pha động Khi tăng tốc độ pha động qua cột tách thời gian lưu SAs giảm, pic sắc ký xuất gần Tại tốc độ 1ml/phút cho khả tách tốt không nhiều thời gian tách chất khỏi cột Do tốc độ pha động 1ml/phút chọn cho thí nghiệm 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.4.1 Khảo sát lập đƣờng chuẩn khoảng nồng độ 0,05 – 1,000ppm Từ điều kiện tối ưu trên, tiến hành kháo sát khoảng tuyến tính phép đo với điều kiện sau: Pha tĩnh: RP – C18 (25cmì4,6cm; 5àm) Pha ng: 20% ACN- 80% m axetat 10mM (pH=4,5) Tốc độ pha động: ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Detector: UV: 270 nm, 320nm Khoảng nồng độ 0,05ppm – 1,00 ppm Phương pháp định lượng Diện tích pic 140000 120000 Spic(mAu.s) 120000 Spic(mAu.s) 100000 100000 80000 80000 Y=A+B*X Y=A+B*X 60000 He so Gia tri Sai so -A 1092,45955 501,2982 B 117814,43366 982,18271 40000 He so Gia tri Sai so -A 5269,04612 667,96047 B 124010,14563 1308,72048 60000 40000 20000 R SD N P -0,9999 772,12306